Name: live imaging and quantification of viral infection in k18 hace2 transgenic mice using reporter-expressing recombinant sars-cov-2
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2 at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить членов нашего института (Техасского института биомедицинских исследований) за их усилия по поддержанию наших объектов в полной рабочем состоянии и безопасности во время пандемии COVID-19. Мы также хотели бы поблагодарить наш Институциональный комитет по биобезопасности (IBC) и Spell (IACUC) за обзор наших протоколов эффективным по времени образом. Мы благодарим доктора Томаса Морана из Медицинской школы Айкана на горе Синай за предоставление моноклонального антитела к протоклональному белку нуклеокапсида (N) sarS-CoV с перекрестным реактивным 1C7C7 (N). Исследования SARS-CoV-2 в лаборатории Мартинеса-Собридо в настоящее время поддерживаются грантами NIAID/NIH RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 и R43AI165089-01; Министерство обороны (DoD) предоставляет гранты W81XWH2110095 и W81XWH2110103; Партнерство Сан-Антонио по прецизионной терапии; Форум Техасского института биомедицинских исследований; Научный центр здравоохранения Техасского университета в Сан-Антонио; Медицинский фонд Сан-Антонио; и Центром исследований патогенеза и передачи гриппа (CRIPT), финансируемым NIAID Центром передового опыта в области исследований и реагирования на грипп (CEIRR, контракт No 75N93021C00014).

Протоколы с участием трансгенных мышей K18 hACE2 были одобрены Институциональным комитетом по биобезопасности (IBC) Техасского биомедицинского научно-исследовательского института (TBRI) и Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC). Все эксперименты проводятся...

<ol>
	<li>V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronavirus+biology+and+replication:+implications+for+SARS-CoV-2.">Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).</li><li>Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus-2+(SARS-CoV-2):+An+update.">Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2): An update.</a> Cureus. 12 (3), 7423 (2020).</li><li>Su, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology,+genetic+recombination,+and+pathogenesis+of+coronaviruses.">Epidemiology, genetic recombination, and pathogenesis of coronaviruses.</a> Trends in Microbiology. 24 (6), 490-502 (2016).</li><li>Cui, J., Li, F., Shi, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+evolution+of+pathogenic+coronaviruses.">Origin and evolution of pathogenic coronaviruses.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (3), 181-192 (2019).</li><li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+characterisation+and+epidemiology+of+2019+novel+coronavirus:+implications+for+virus+origins+and+receptor+binding.">Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding.</a> Lancet. 395 (10224), 565-574 (2020).</li><li>Evans, J. P., Liu, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+host+factors+in+SARS-CoV-2+entry.">Role of host factors in SARS-CoV-2 entry.</a> Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100847 (2021).</li><li>Petersen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+SARS-CoV-2+with+SARS-CoV+and+influenza+pandemics.">Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics.</a> Lancet Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).</li><li>Alfaraj, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+predictors+of+mortality+of+Middle+East+Respiratory+Syndrome+Coronavirus+(MERS-CoV)+infection:+A+cohort+study.">Clinical predictors of mortality of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) infection: A cohort study.</a> Travel Medicine and Infectious Disease. 29, 48-50 (2019).</li><li>Harvey, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+variants,+spike+mutations+and+immune+escape.">SARS-CoV-2 variants, spike mutations and immune escape.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (7), 409-424 (2021).</li><li>Dong, E., Du, H., Gardner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interactive+web-based+dashboard+to+track+COVID-19+in+real+time.">An interactive web-based dashboard to track COVID-19 in real time.</a> Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 533-534 (2020).</li><li>Bar-On, Y. M., Flamholz, A., Phillips, R., Milo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARS-CoV-2+(COVID-19)+by+the+numbers.">ARS-CoV-2 (COVID-19) by the numbers.</a> Elife. 9, 57309 (2020).</li><li>Roussel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2:+fear+versus+data.">SARS-CoV-2: fear versus data.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 55 (5), 105947 (2020).</li><li>Scialo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2:+One+year+in+the+pandemic.+What+have+we+learned,+the+new+vaccine+era+and+the+threat+of+SARS-CoV-2+variants.">SARS-CoV-2: One year in the pandemic. What have we learned, the new vaccine era and the threat of SARS-CoV-2 variants.</a> Biomedicines. 9 (6), 611 (2021).</li><li>. Coronavirus (COVID-19) update: FDA authorizes additional monoclonal antibody for treatment of COVID-19 Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-additional-monoclonal-antibody-treatment-covid-19">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-additional-monoclonal-antibody-treatment-covid-19</a> (2021)</li><li>Dougan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bamlanivimab+plus+Etesevimab+in+Mild+or+Moderate+Covid-19.">Bamlanivimab plus Etesevimab in Mild or Moderate Covid-19.</a> New England Journal of Medicine. 385 (15), 1382-1392 (2021).</li><li>Ledford, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID+antibody+treatments+show+promise+for+preventing+severe+disease.">COVID antibody treatments show promise for preventing severe disease.</a> Nature. 591 (7851), 513-514 (2021).</li><li>Tuccori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+preclinical+discovery+and+development+of+bamlanivimab+for+the+treatment+of+novel+coronavirus+infection+(COVID-19):+reasons+for+limited+clinical+use+and+lessons+for+the+future.">An overview of the preclinical discovery and development of bamlanivimab for the treatment of novel coronavirus infection (COVID-19): reasons for limited clinical use and lessons for the future.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. , 1-12 (2021).</li><li>Phan, A. T., Gukasyan, J., Arabian, S., Wang, S., Neeki, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+inpatient+administration+of+casirivimab+and+imdevimab+antibody+cocktail+for+the+treatment+of+COVID-19+pneumonia.">Emergent inpatient administration of casirivimab and imdevimab antibody cocktail for the treatment of COVID-19 pneumonia.</a> Cureus. 13 (5), 15280 (2021).</li><li>O'Brien, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+REGEN-COV+antibody+combination+in+early+SARS-CoV-2+infection.">Subcutaneous REGEN-COV antibody combination in early SARS-CoV-2 infection.</a> medRxiv. , (2021).</li><li>Beigel, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remdesivir+for+the+treatment+of+Covid-19+-+Final+report.">Remdesivir for the treatment of Covid-19 - Final report.</a> New England Journal of Medicine. 383 (19), 1813-1826 (2020).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+convalescent+plasma+therapy+on+time+to+clinical+improvement+in+patients+with+severe+and+life-threatening+COVID-19:+A+randomized+clinical+trial.">Effect of convalescent plasma therapy on time to clinical improvement in patients with severe and life-threatening COVID-19: A randomized clinical trial.</a> Journal of the American Medical Association. 324 (5), 460-470 (2020).</li><li>Polack, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+the+BNT162b2+mRNA+Covid-19+vaccine.">Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine.</a> New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).</li><li>Oliver, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advisory+committee+on+immunization+practices'+interim+recommendation+for+use+of+Pfizer-BioNTech+COVID-19+vaccine+-+United+States,+December+2020.">The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Pfizer-BioNTech COVID-19 vaccine - United States, December 2020.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (50), 1922-1924 (2020).</li><li>Oliver, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advisory+committee+on+immunization+practices'+interim+recommendation+for+use+of+Janssen+COVID-19+vaccine+-+United+States,+February+2021.">The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Janssen COVID-19 vaccine - United States, February 2021.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 70 (9), 329-332 (2021).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emission+spectra+of+bioluminescent+reporters+and+interaction+with+mammalian+tissue+determine+the+sensitivity+of+detection+in+vivo.">Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo.</a> Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210 (2005).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li><li>Nogales, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+fluorescent+and+bioluminescent+bireporter+Influenza+A+Virus+to+evaluate+viral+infections.">A novel fluorescent and bioluminescent bireporter Influenza A Virus to evaluate viral infections.</a> Journal of Virology. 93 (10), 00032 (2019).</li><li>Nogales, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-competent+fluorescent-expressing+influenza+B+virus.">Replication-competent fluorescent-expressing influenza B virus.</a> Virus Research. 213, 69-81 (2016).</li><li>Welsh, D. K., Noguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+bioluminescence+imaging.">Cellular bioluminescence imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).</li><li>Tran, V., Moser, L. A., Poole, D. S., Mehle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+real-time+in+vivo+imaging+of+an+influenza+reporter+virus+reveals+dynamics+of+replication+and+spread.">Highly sensitive real-time in vivo imaging of an influenza reporter virus reveals dynamics of replication and spread.</a> Journal of Virology. 87 (24), 13321-13329 (2013).</li><li>Schoggins, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dengue+reporter+viruses+reveal+viral+dynamics+in+interferon+receptor-deficient+mice+and+sensitivity+to+interferon+effectors+in+vitro.">Dengue reporter viruses reveal viral dynamics in interferon receptor-deficient mice and sensitivity to interferon effectors in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14610-14615 (2012).</li><li>Luker, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescence+imaging+of+herpes+simplex+virus+type+1+infection+and+therapy+in+living+mice.">Noninvasive bioluminescence imaging of herpes simplex virus type 1 infection and therapy in living mice.</a> Journal of Virology. 76 (23), 12149-12161 (2002).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+antiviral+screening+assay+based+on+eGFP+reporter+virus+of+Mayaro+virus.">Development of a rapid antiviral screening assay based on eGFP reporter virus of Mayaro virus.</a> Antiviral Research. 168, 82-90 (2019).</li><li>Kirui, J., Freed, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+validation+of+a+highly+sensitive+bioluminescent+HIV-1+reporter+vector+that+simplifies+measurement+of+virus+release.">Generation and validation of a highly sensitive bioluminescent HIV-1 reporter vector that simplifies measurement of virus release.</a> Retrovirology. 17 (1), 12 (2020).</li><li>Shang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+stable+eGFP+enterovirus+71+for+antiviral+screening.">Development and characterization of a stable eGFP enterovirus 71 for antiviral screening.</a> Antiviral Research. 97 (2), 198-205 (2013).</li><li>Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+stable+luciferase+dengue+virus+for+high-throughput+screening.">Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening.</a> Antiviral Research. 91 (1), 11-19 (2011).</li><li>Ye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+SARS-CoV-2+from+a+single+bacterial+artificial+chromosome.">Rescue of SARS-CoV-2 from a single bacterial artificial chromosome.</a> mBio. 11 (5), 02168 (2020).</li><li>Avila-Perez, G., Park, J. G., Nogales, A., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+recombinant+Zika+virus+from+a+bacterial+artificial+chromosome+cDNA+clone.">Rescue of recombinant Zika virus from a bacterial artificial chromosome cDNA clone.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59537 (2019).</li><li>Chiem, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bifluorescent-based+assay+for+the+identification+of+neutralizing+antibodies+against+SARS-CoV-2+variants+of+concern+in+vitro+and+in+vivo.">A bifluorescent-based assay for the identification of neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 variants of concern in vitro and in vivo.</a> Journal of Virology. , (2021).</li><li>Committee for the update of the guide for the care and use of laboratory animals., Institute for laboratory animal research (U.S) &amp; National Academies Press (U.S.). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+for+the+care+and+use+of+laboratory+animals.+8th+edn.">Guide for the care and use of laboratory animals. 8th edn.</a> National Research Council (US). , (2011).</li><li>Ye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+SARS-CoV-2+infection+dynamic+in+vivo+using+reporter-expressing+viruses.">Analysis of SARS-CoV-2 infection dynamic in vivo using reporter-expressing viruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), (2021).</li></ol>

Этот протокол демонстрирует возможность использования этих rSARS-CoV-2 экспрессирующих репортерных генов для мониторинга вирусных инфекций in vivo. Оба репортер-экспрессирующих рекомбинантных вируса являются отличным инструментом для изучения инфекций SARS-CoV-2 in vivo. Описанные систе...

Коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) представляет собой оболочку, с положительным чувством, одноцепочечный РНК-вирус, который принадлежит к линии бетакоронавирусов в семействе Coronaviridae 1. Это вирусное семейство делится на альфа-, бета-, гамма- и дельта-коронавирус1. Альфа- и бетакоронавирусы в основном заражают млекопитающих, тогда как гамма- и дельтакоронавирусы заражают почти исключительно птиц2. На сегодняшний день семь коронавирусов (CoV) пересекли видовые барьеры и стали коронавирусами человека (HCoV): два альфа-CoV (HCoV-229E и HCoV-NL63) и пять бета-CoV (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, коронавирус ближневосточного респираторного синдрома [MERS-CoV] и SARS-CoV-2)3,4,5,6. SARS-CoV, MERS-CoV и SARS-CoV-2 являются высокопатогенными, вызывая тяжелую инфекцию нижних дыхательных путей7. До появления SARS-CoV-2 было две эпидемические вспышки, вызванные CoVs: SARS-CoV в Провинции Гуандун, Китай, с 2002 по 2003 год, с коэффициентом летальности (CFR) около 9,7%; и БВРС-КоВ на Ближнем Востоке с 2012 г. по настоящее время, при этом CFR составляет около 34%7,8. SARS-CoV-2 имеет общий CFR между 3,4% -49%, при этом базовые условия способствуют более высокому CFR 8,9. С момента своего открытия в декабре 2019 года в Ухане, Китай, SARS-CoV-2 был ответственен за более чем 242 миллиона случаев инфицирования людей и более 4,9 миллиона человеческих смертей во всем мире 7,10,11,12. Примечательно, что с конца 2020 года новые вызывающие озабоченность варианты SARS-CoV-2 (VoC) и интересующие их варианты (VoI) повлияли на характеристики вируса, включая передачу и антигенность 9,13, а также на общее направление пандемии COVID-19. Для лечения инфекций SARS-CoV-2 в настоящее время существует только один Соединенные Штаты (США). Терапевтический противовирусный препарат Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) (ремдесивир) и один препарат с разрешением на экстренное использование (EUA) (барицитиниб, вводимый в комбинации с ремдесивиром)14. Существует также 6 одобренных моноклональных антител EUA: REGEN-COV (казиривимаб и имдевимаб, вводимые вместе), сотровимаб, тоцилизумаб, бамланивимаб и этесевимаб, вводимые вместе 15,16,17,18,19. В настоящее время существует только одна одобренная FDA профилактическая вакцина, Pfizer-BioNTech, и две другие профилактические вакцины (Moderna и Janssen) были одобрены EUA 20,21,22,23,24. Однако при неконтролируемом уровне инфицирования и появлении VoC и VoI SARS-CoV-2 по-прежнему представляет угрозу для здоровья человека. Поэтому срочно необходимы новые подходы для выявления эффективных профилактических и терапевтических средств для борьбы с инфекцией SARS-CoV-2 и все еще продолжающейся пандемией COVID-19.
Изучение SARS-CoV-2 требует трудоемких методов и вторичных подходов для выявления присутствия вируса в инфицированных клетках и / или проверенных животных моделях инфекции. Использование обратной генетики позволило генерации рекомбинантных вирусов ответить на важные вопросы биологии вирусных инфекций. Например, методы обратной генетики предоставили средства для выявления и понимания механизмов вирусной инфекции, патогенеза и болезни. Аналогичным образом, подходы обратной генетики проложили путь к разработке рекомбинантных вирусов, лишенных вирусных белков, чтобы понять их вклад в вирусный патогенез. Кроме того, методы обратной генетики были использованы для генерации рекомбинантных вирусов, экспрессирующих репортерные гены для применения in vitro и in vivo, включая выявление профилактических и/или терапевтических подходов к лечению вирусных инфекций. Флуоресцентные и биолюминесцентные белки являются наиболее часто используемыми репортерными генами из-за их чувствительности, стабильности и легкости обнаружения на основе совершенствования новых технологий25,26. Было показано, что флуоресцентные белки in vitro служат лучшим вариантом локализации вирусов в инфицированных клетках, в то время как люциферазы более удобны для количественных исследований 27,28,29. In vivo люциферазы предпочтительнее флуоресцентных белков для визуализации целых животных, в то время как флуоресцентные белки предпочтительны для идентификации инфицированных клеток или визуализации ex vivo 30,31,32. Использование репортер-экспрессирующих рекомбинантных вирусов послужило мощным инструментом для изучения вирусов во многих семействах, включая, среди прочего, флавивирусы, энтеровирусы, альфавирусы, лентивирусы, аренавирусы и вирусы гриппа 28,33,34,35,36.
Чтобы преодолеть потребность во вторичных подходах к изучению SARS-CoV-2 и охарактеризовать инфекцию SARS-CoV-2 in vivo в реальном времени, мы создали репликационно-компетентный рекомбинантный (r)SARS-CoV-2, который экспрессирует биолюминесцентные (нанолюциферазы, Nluc) или флуоресцентные (Венера) белки, используя нашу ранее описанную обратную генетику на основе бактериальных искусственных хромосом (BAC), которые поддерживаются как единая копия в E. colili с целью минимизации токсичности последовательностей вируса при его размножении в бактериях37,38. Примечательно, что rSARS-CoV-2/Nluc и rSARS-CoV-2/Venus показали rSARS-CoV-2/WT-подобную патогенность in vivo. Высокий уровень экспрессии Венеры от rSARS-CoV-2/Venus позволил обнаружить вирусную инфекцию в легких инфицированных трансгенных мышей K18 hACE2 с помощью системы визуализации in vivo (IVIS)39. Уровни экспрессии Венеры хорошо коррелировали с вирусными титрами, обнаруженными в легких, демонстрируя возможность использования экспрессии Венеры в качестве действительного суррогата инфекции SARS-CoV-2. Используя rSARS-CoV-2/Nluc, мы смогли отслеживать динамику вирусной инфекции в режиме реального времени и продольно оценивать инфекцию SARS-CoV-2 in vivo, используя тот же подход IVIS у трансгенных мышей K18 hACE2.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Triton X-100</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>X198-07</td>
			<td>Store at room temperature (RT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% DEAE-Dextran</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>195133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin solution, neutral buffered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S-5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>655-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>African green monkey kidney epithelial cells (Vero E6)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ami HT</td>
			<td>Spectral Instruments Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aura Imaging Software 3.2.0</td>
			<td>Spectral Instruments Imaging</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), 35%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-055-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia gas machine</td>
			<td>Veterinary Anesthesia Systems, Inc.</td>
			<td>VAS 2001R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>1500-050</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four- to six-week-old female K18-hACE2 transgenic mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism Version 9.1.0</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>1001936040</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MARS Data Analysis Software</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MB10 tablets</td>
			<td>QUIP Laboratories</td>
			<td>MBTAB1.5</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-Glo Luciferase Assay Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N1110</td>
			<td>This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well Microplates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>269620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well Microplates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>269620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-009-CI</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHERAstar FSX</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td>PHERAstar FSX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precelleys Evolution homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000062-PEVO0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft tissue homogenizing CK14 &#8211; 7 mL</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000940-LYSK0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 EasYFlask</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN ABC-HRP Kit, Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-4002</td>
			<td>ABC kit and DAB Peroxidase Substrate kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging and quantification of viral infection in k18 hace2 transgenic mice using reporter-expressing recombinant sars-cov-2

Пандемия коронавирусной болезни 2019 года (COVID-19) была вызвана тяжелым острым респираторным синдромом коронавируса 2 (SARS-CoV-2). На сегодняшний день SARS-CoV-2 является причиной более 242 миллионов инфекций и более 4,9 миллиона смертей во всем мире. Подобно другим вирусам, изучение SARS-CoV-2 требует использования экспериментальных методов для обнаружения присутствия вируса в инфицированных клетках и/или на животных моделях. Чтобы преодолеть это ограничение, мы создали репликационно-компетентный рекомбинантный (r)SARS-CoV-2, который экспрессирует биолюминесцентные (нанолюцифераза, Nluc) или флуоресцентные (Венера) белки. Эти репортер-экспрессирующие rSARS-CoV-2 позволяют отслеживать вирусные инфекции in vitro и in vivo на основе экспрессии генов-репортеров Nluc и Venus. Здесь исследование описывает использование rSARS-CoV-2/Nluc и rSARS-CoV-2/Venus для обнаружения и отслеживания инфекции SARS-CoV-2 в ранее описанной K18 человеческой ангиотензинпревращающей ферменте 2 (hACE2) трансгенной мышиной модели инфекции с использованием систем визуализации in vivo (IVIS). Эти rSARS-CoV-2/Nluc и rSARS-CoV-2/Venus демонстрируют rSARS-CoV-2/WT-подобную патогенность и репликацию вируса in vivo. Важно отметить, что экспрессия Nluc и Venus позволяет нам напрямую отслеживать вирусные инфекции in vivo и ex vivo у инфицированных мышей. Эти rSARS-CoV-2/Nluc и rSARS-CoV-2/Venus представляют собой отличный вариант для изучения биологии SARS-CoV-2 in vivo, понимания вирусной инфекции и связанного с ней заболевания COVID-19 и определения эффективных профилактических и/или терапевтических методов лечения для борьбы с инфекцией SARS-CoV-2.

Инфекция rSARS-CoV-2/Nluc у трансгенных мышей K18 hACE2 (рисунки 1 и 2) На рисунке 1А показано схематическое изображение rSARS-CoV-2/WT (вверху) и rSARS-CoV-2/Nluc (снизу), используемых для оценки инфекций in vivo. На рисунке 1B показана схематиче?...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2 at JoVE.com

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Этот протокол описывает динамику вирусных инфекций с использованием люциферазы и флуоресцентно-экспрессирующих рекомбинантных (r)SARS-CoV-2 и систем визуализации in vivo (IVIS) у трансгенных мышей K18 hACE2 для преодоления необходимости вторичных подходов, необходимых для изучения инфекций SARS-CoV-2 in vivo.

Живая визуализация и количественная оценка вирусной инфекции у трансгенных мышей K18 hACE2 с использованием репортер-экспрессирующего рекомбинантного SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Наш протокол описывал использование флуоресцентных или люминесцентно-экспрессирующих рекомбинантных SARS-CoV-2 для обнаружения вирусов in vivo и ex vivo в живой визуализации и вирусного отслеживания в трансгенной мышиной модели SARS-CoV-2 K18 человека ACE2. Основным преимуществом этого метода является применение и осуществимость обнаружения и отслеживания вируса для исследований IN vivo и ex vivo SARS-CoV-2 в трансгенной мышиной модели K18 ACE2 человека. Использование визуализации IN VIVO SARS-CoV-2 в трансгенной мышиной модели K18 ACE2 человека представляет собой отличный вариант для оценки терапевтических средств для лечения инфекции SARS-CoV-2 in vivo.Внедрение репортеров SARS-CoV-2 представляет собой отличный вариант для оценки патогенности, репликации вируса и трофики in vivo. Для исследований in vivo с люциферазой, экспрессирующей SARS-CoV-2, рекомендуется бритье мышей и быстрая визуализация после инъекции субстрата для улучшения сигнала биолюминесценции. Начните мониторинг биолюминесценции, запустив систему визуализации in vivo или IVIS, и настроив параметры, щелкните режим изображения в режиме Биолюминесценция, затем откройте фильтр и установите время экспозиции в Auto.Затем удалите уже выбритую и обезболенную мышь из изоляционной камеры и используйте иглу 25 калибра для ретроорбитального введения 100 микролитров субстрата люциферазы, разбавленного от 1 до 10 в PBS, мыши. Затем поместите мышь обратно в изоляционную камеру, перенесите изоляционную камеру на машину IVIS, которая оснащена нагревательным компонентом для предотвращения переохлаждения, и закройте дверцу тепловизора IVIS для инициализации изображения, выбрав Acquire в программном обеспечении. Чтобы проанализировать полученные изображения биолюминесценции, используйте инструмент ROI или область интереса в программном обеспечении для обозначения точного сигнала и измерения потока.Запустите программное обеспечение для создания образов и настройте параметры. Нажмите режим изображения на Флуоресценция, установите возбуждение на 500 нанометров и эмиссионные фильтры на 530 нанометров и установите время экспозиции на Auto. Проведите некроскопию и иссекните легкие у мышей.Поместите иссеченные легкие в 6-луночную пластину, содержащую два миллилитра 1X PBS, и промойте, чтобы удалить избыток крови. Дезинфекция и очистка хирургических инструментов между образцами с использованием 70% этанола. После инициализации аппарата IVIS поместите легкие на черный лист и отделите ткани друг от друга.Затем поместите лоток внутрь изоляционной камеры внутри шкафа биобезопасности, а затем перенесите изоляционную камеру в IVIS. Закройте дверцу тепловизора IVIS и нажмите «Получить», чтобы запустить систему обработки изображений. Чтобы проанализировать флуоресценцию, используйте инструмент ROI и нарисуйте ROI вокруг каждого из отдельных легких.Измерьте каждую рентабельность инвестиций вручную, а затем используйте средние значения эффективности излучения и вычтите из зараженных мышей. Как только визуализация будет завершена, поместите ткани в криотрубу для замораживания сухого льда, чтобы хранить при минус 80 градусах Цельсия для последующей обработки. Используя супернат, полученный из тканевых гомогенатов, выполняют десятикратное последовательное разбавление и заражают сливающиеся монослои клеток Vero E6 одним миллилитром каждого внебиржевого разведения в трех.Дайте вирусу адсорбироваться в течение одного часа при 37 градусах Цельсия в увлажненном 5% инкубаторе углекислого газа. После этого промыть клетки одним миллилитром 1X PBS, а затем инкубировать клетки в двух миллилитрах постинфекционной среды, содержащей 1% агара, в увлажненном инкубаторе 5% углекислого газа при 37 градусах Цельсия в течение 72 часов. После инкубации инактивируйте пластины в 10% нейтральном буферизованном формалине в течение 24 часов при четырех градусах Цельсия, гарантируя, что вся пластина погружена.Выньте пластины из третьего уровня биобезопасности и трижды промывайте клетки одним миллилитом 0,5% Тритона Х-100 в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем блокируют пермеабилизированные клетки одним миллилитром 2,5 бычьего сывороточного альбумина или BSA и PBS в течение одного часа при 37 градусах Цельсия с последующей инкубацией в одном миллилитре одного микрограмма на миллилитр белка SARS-CoV кросс-реактивного моноклонального антитела 1C7C7, разбавленного в 2,5 BSA в течение одного часа при 37 градусах Цельсия. Промыть клетки три раза одним миллилитром 1X PBS и разработать бляшки с использованием наборов субстрата ABC и диаминобензола или DAB, пероксидазы в соответствии с инструкциями производителя, а затем рассчитать вирусные титры как единицы образования бляшек на миллилитр.В исследовании было замечено, что биолюминесцентная нанолюцифераза, или Nluc, была легко обнаружена и мыши, инфицированные rSARS-CoV-2 Nluc, но не те, кто инфицирован rSARS-CoV-2 дикого типа или имитация заражения. Количественные анализы показали интенсивность Nluc в разные дни после заражения. Грубые поражения на поверхности легких мышей, инфицированных rSARS-CoV-2 Nluc, были сопоставимы с таковыми в группе инфицированных rSARS-CoV-2 дикого типа.Кроме того, обнаруженные вирусные титры и инфицированные rSARS-CoV-2 Nluc мыши были сопоставимы с теми, кто был инфицирован rSARS-CoV-2 дикого типа во всех органах в разные дни после заражения. В то же время активность Nluc была обнаружена только в органах у мышей, инфицированных rSARS-CoV-2 Nluc. Отдельная группа инфицированных и инфицированных вирусом мышей контролировалась в течение 12 дней на предмет изменений массы тела и выживаемости.Мыши, инфицированные rSARS-CoV-2 Nluc и rSARS-CoV-2 дикого типа, потеряли до 25% массы тела и все они поддаются вирусной инфекции в период от семи до восьми дней после заражения. После заражения rSARS-CoV-2 Венерой экспрессия Венеры была легко обнаружена во всех легких у мышей, инфицированных rSARS-CoV-2 Venus, но не у мышей, инфицированных rSARS-CoV-2 дикого типа или имитационных инфицированных. Количественные анализы показали, что интенсивность Венеры достигает пика через два дня после заражения и уменьшается в течение инфекции и легких инфицированных мышей.Изображения поверхности легких показали грубые поражения мышей, инфицированных rSARS-CoV-2 Venus, были сопоставимы с поражениями инфицированных rSARS-CoV-2 диких мышей. Кроме того, заражение rSARS-CoV-2 Venus привело к сопоставимым вирусным титрам с теми, которые наблюдались у мышей, инфицированных rSARS-CoV-2 дикого типа во всех органах. Мыши, инфицированные rSARS-CoV-2 Venus и rSARS-CoV-2 дикого типа, потеряли до 25% массы тела и умерли от вирусной инфекции к девятому дню после заражения без выживания.Результаты репортерской экспрессии SARS-CoV-2 показали, что они являются действительными суррогатами вирусной инфекции. Таким образом, это может привести к быстрому выявлению и оценке контрмер для лечения инфекции SARS-CoV-2.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

В естественных изображений трансгенных Паразиты Leishmania в реальный хост

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Производство и Titering рекомбинантных адено-ассоциированные вирусные векторы

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

Люциферазе-флуоресцентный вирус гриппа репортер для живой визуализации и количественной оценки вирусной инфекции

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Визуализация ТОРС-КоВ-2 с использованием иммуноРНК-флуоресценции в гибридизации Ситус

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

Обнаружение нейтрализующих антител SARS-CoV-2 с использованием высокопроизводительной флуоресцентной визуализации псевдовирусной инфекции

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

Экспресс-мультиплексный двойной репортер IgG и IgM SARS-CoV-2 нейтрализуя для мультиплексированной системы анализа потоков на основе шариков

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Обнаружение рецептор-связывающего домена антитела SARS-CoV-2 с помощью биорепортера на основе HiBiT

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Эффективная sars-CoV-2 количественная обратная транскриптаза ПЦР стратегия диагностики слюны с использованием роботов для пипетирования с открытым исходным кодом

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (Video) | JoVE

Псевдотипированные вирусы как молекулярный инструмент мониторинга гуморальных иммунных реакций против SARS-CoV-2 с помощью нейтрализационного анализа

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...