Name: live imaging and quantification of viral infection in k18 hace2 transgenic mice using reporter-expressing recombinant sars-cov-2
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2 at JoVE.com

Vi vill tacka medlemmarna vid vårt institut (Texas Biomedical Research Institute) för deras ansträngningar för att hålla våra anläggningar fullt fungerande och säkra under COVID-19-pandemin. Vi vill också tacka vår institutionella biosäkerhetskommitté (IBC) och stavning (IACUC) för att ha granskat våra protokoll på ett tidseffektivt sätt. Vi tackar Dr. Thomas Moran vid Icahn School of Medicine vid Mount Sinai för att ha tillhandahållit SARS-CoV korsreaktiv 1C7C7 nukleokapsid (N) protein monoklonal antikropp. SARS-CoV-2-forskning i Martinez-Sobridos laboratorium stöds för närvarande av NIAID / NIH-bidrag RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 och R43AI165089-01; Försvarsdepartementet (DoD) beviljar W81XWH2110095 och W81XWH2110103; San Antonio-partnerskapet för Precision Therapeutic; Texas Biomedical Research Institute Forum; University of Texas Health Science Center i San Antonio; San Antonio Medical Foundation; och av Center for Research on Influenza Pathogenesis and Transmission (CRIPT), ett NIAID-finansierat Center of Excellence for Influenza Research and Response (CEIRR, kontrakt # 75N93021C00014).

Protokoll som involverar K18 hACE2 transgena möss godkändes av Texas Biomedical Research Institute (TBRI) Institutional Biosafety Committee (IBC) och Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Alla försök följer rekommendationerna i Forskningsrådets vägledning för vård och användning av försöksdjur40. Lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) krävs vid arbete med möss.
1. Användning av K18 hACE2 transgena möss
<ol><li>Köp oc...

<ol>
	<li>V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronavirus+biology+and+replication:+implications+for+SARS-CoV-2.">Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).</li><li>Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus-2+(SARS-CoV-2):+An+update.">Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2): An update.</a> Cureus. 12 (3), 7423 (2020).</li><li>Su, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology,+genetic+recombination,+and+pathogenesis+of+coronaviruses.">Epidemiology, genetic recombination, and pathogenesis of coronaviruses.</a> Trends in Microbiology. 24 (6), 490-502 (2016).</li><li>Cui, J., Li, F., Shi, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+evolution+of+pathogenic+coronaviruses.">Origin and evolution of pathogenic coronaviruses.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (3), 181-192 (2019).</li><li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+characterisation+and+epidemiology+of+2019+novel+coronavirus:+implications+for+virus+origins+and+receptor+binding.">Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding.</a> Lancet. 395 (10224), 565-574 (2020).</li><li>Evans, J. P., Liu, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+host+factors+in+SARS-CoV-2+entry.">Role of host factors in SARS-CoV-2 entry.</a> Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100847 (2021).</li><li>Petersen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+SARS-CoV-2+with+SARS-CoV+and+influenza+pandemics.">Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics.</a> Lancet Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).</li><li>Alfaraj, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+predictors+of+mortality+of+Middle+East+Respiratory+Syndrome+Coronavirus+(MERS-CoV)+infection:+A+cohort+study.">Clinical predictors of mortality of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) infection: A cohort study.</a> Travel Medicine and Infectious Disease. 29, 48-50 (2019).</li><li>Harvey, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+variants,+spike+mutations+and+immune+escape.">SARS-CoV-2 variants, spike mutations and immune escape.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (7), 409-424 (2021).</li><li>Dong, E., Du, H., Gardner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interactive+web-based+dashboard+to+track+COVID-19+in+real+time.">An interactive web-based dashboard to track COVID-19 in real time.</a> Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 533-534 (2020).</li><li>Bar-On, Y. M., Flamholz, A., Phillips, R., Milo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARS-CoV-2+(COVID-19)+by+the+numbers.">ARS-CoV-2 (COVID-19) by the numbers.</a> Elife. 9, 57309 (2020).</li><li>Roussel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2:+fear+versus+data.">SARS-CoV-2: fear versus data.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 55 (5), 105947 (2020).</li><li>Scialo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2:+One+year+in+the+pandemic.+What+have+we+learned,+the+new+vaccine+era+and+the+threat+of+SARS-CoV-2+variants.">SARS-CoV-2: One year in the pandemic. What have we learned, the new vaccine era and the threat of SARS-CoV-2 variants.</a> Biomedicines. 9 (6), 611 (2021).</li><li>. Coronavirus (COVID-19) update: FDA authorizes additional monoclonal antibody for treatment of COVID-19 Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-additional-monoclonal-antibody-treatment-covid-19">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-additional-monoclonal-antibody-treatment-covid-19</a> (2021)</li><li>Dougan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bamlanivimab+plus+Etesevimab+in+Mild+or+Moderate+Covid-19.">Bamlanivimab plus Etesevimab in Mild or Moderate Covid-19.</a> New England Journal of Medicine. 385 (15), 1382-1392 (2021).</li><li>Ledford, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID+antibody+treatments+show+promise+for+preventing+severe+disease.">COVID antibody treatments show promise for preventing severe disease.</a> Nature. 591 (7851), 513-514 (2021).</li><li>Tuccori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+preclinical+discovery+and+development+of+bamlanivimab+for+the+treatment+of+novel+coronavirus+infection+(COVID-19):+reasons+for+limited+clinical+use+and+lessons+for+the+future.">An overview of the preclinical discovery and development of bamlanivimab for the treatment of novel coronavirus infection (COVID-19): reasons for limited clinical use and lessons for the future.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. , 1-12 (2021).</li><li>Phan, A. T., Gukasyan, J., Arabian, S., Wang, S., Neeki, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+inpatient+administration+of+casirivimab+and+imdevimab+antibody+cocktail+for+the+treatment+of+COVID-19+pneumonia.">Emergent inpatient administration of casirivimab and imdevimab antibody cocktail for the treatment of COVID-19 pneumonia.</a> Cureus. 13 (5), 15280 (2021).</li><li>O'Brien, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+REGEN-COV+antibody+combination+in+early+SARS-CoV-2+infection.">Subcutaneous REGEN-COV antibody combination in early SARS-CoV-2 infection.</a> medRxiv. , (2021).</li><li>Beigel, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remdesivir+for+the+treatment+of+Covid-19+-+Final+report.">Remdesivir for the treatment of Covid-19 - Final report.</a> New England Journal of Medicine. 383 (19), 1813-1826 (2020).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+convalescent+plasma+therapy+on+time+to+clinical+improvement+in+patients+with+severe+and+life-threatening+COVID-19:+A+randomized+clinical+trial.">Effect of convalescent plasma therapy on time to clinical improvement in patients with severe and life-threatening COVID-19: A randomized clinical trial.</a> Journal of the American Medical Association. 324 (5), 460-470 (2020).</li><li>Polack, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+the+BNT162b2+mRNA+Covid-19+vaccine.">Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine.</a> New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).</li><li>Oliver, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advisory+committee+on+immunization+practices'+interim+recommendation+for+use+of+Pfizer-BioNTech+COVID-19+vaccine+-+United+States,+December+2020.">The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Pfizer-BioNTech COVID-19 vaccine - United States, December 2020.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (50), 1922-1924 (2020).</li><li>Oliver, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advisory+committee+on+immunization+practices'+interim+recommendation+for+use+of+Janssen+COVID-19+vaccine+-+United+States,+February+2021.">The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Janssen COVID-19 vaccine - United States, February 2021.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 70 (9), 329-332 (2021).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emission+spectra+of+bioluminescent+reporters+and+interaction+with+mammalian+tissue+determine+the+sensitivity+of+detection+in+vivo.">Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo.</a> Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210 (2005).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li><li>Nogales, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+fluorescent+and+bioluminescent+bireporter+Influenza+A+Virus+to+evaluate+viral+infections.">A novel fluorescent and bioluminescent bireporter Influenza A Virus to evaluate viral infections.</a> Journal of Virology. 93 (10), 00032 (2019).</li><li>Nogales, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-competent+fluorescent-expressing+influenza+B+virus.">Replication-competent fluorescent-expressing influenza B virus.</a> Virus Research. 213, 69-81 (2016).</li><li>Welsh, D. K., Noguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+bioluminescence+imaging.">Cellular bioluminescence imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).</li><li>Tran, V., Moser, L. A., Poole, D. S., Mehle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+real-time+in+vivo+imaging+of+an+influenza+reporter+virus+reveals+dynamics+of+replication+and+spread.">Highly sensitive real-time in vivo imaging of an influenza reporter virus reveals dynamics of replication and spread.</a> Journal of Virology. 87 (24), 13321-13329 (2013).</li><li>Schoggins, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dengue+reporter+viruses+reveal+viral+dynamics+in+interferon+receptor-deficient+mice+and+sensitivity+to+interferon+effectors+in+vitro.">Dengue reporter viruses reveal viral dynamics in interferon receptor-deficient mice and sensitivity to interferon effectors in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14610-14615 (2012).</li><li>Luker, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescence+imaging+of+herpes+simplex+virus+type+1+infection+and+therapy+in+living+mice.">Noninvasive bioluminescence imaging of herpes simplex virus type 1 infection and therapy in living mice.</a> Journal of Virology. 76 (23), 12149-12161 (2002).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+antiviral+screening+assay+based+on+eGFP+reporter+virus+of+Mayaro+virus.">Development of a rapid antiviral screening assay based on eGFP reporter virus of Mayaro virus.</a> Antiviral Research. 168, 82-90 (2019).</li><li>Kirui, J., Freed, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+validation+of+a+highly+sensitive+bioluminescent+HIV-1+reporter+vector+that+simplifies+measurement+of+virus+release.">Generation and validation of a highly sensitive bioluminescent HIV-1 reporter vector that simplifies measurement of virus release.</a> Retrovirology. 17 (1), 12 (2020).</li><li>Shang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+stable+eGFP+enterovirus+71+for+antiviral+screening.">Development and characterization of a stable eGFP enterovirus 71 for antiviral screening.</a> Antiviral Research. 97 (2), 198-205 (2013).</li><li>Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+stable+luciferase+dengue+virus+for+high-throughput+screening.">Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening.</a> Antiviral Research. 91 (1), 11-19 (2011).</li><li>Ye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+SARS-CoV-2+from+a+single+bacterial+artificial+chromosome.">Rescue of SARS-CoV-2 from a single bacterial artificial chromosome.</a> mBio. 11 (5), 02168 (2020).</li><li>Avila-Perez, G., Park, J. G., Nogales, A., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+recombinant+Zika+virus+from+a+bacterial+artificial+chromosome+cDNA+clone.">Rescue of recombinant Zika virus from a bacterial artificial chromosome cDNA clone.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59537 (2019).</li><li>Chiem, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bifluorescent-based+assay+for+the+identification+of+neutralizing+antibodies+against+SARS-CoV-2+variants+of+concern+in+vitro+and+in+vivo.">A bifluorescent-based assay for the identification of neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 variants of concern in vitro and in vivo.</a> Journal of Virology. , (2021).</li><li>Committee for the update of the guide for the care and use of laboratory animals., Institute for laboratory animal research (U.S) &amp; National Academies Press (U.S.). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+for+the+care+and+use+of+laboratory+animals.+8th+edn.">Guide for the care and use of laboratory animals. 8th edn.</a> National Research Council (US). , (2011).</li><li>Ye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+SARS-CoV-2+infection+dynamic+in+vivo+using+reporter-expressing+viruses.">Analysis of SARS-CoV-2 infection dynamic in vivo using reporter-expressing viruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), (2021).</li></ol>

Detta protokoll visar möjligheten att använda dessa rSARS-CoV-2 som uttrycker reportergener för att övervaka virusinfektioner in vivo. Båda reporteruttryckande rekombinanta virus ger ett utmärkt verktyg för att studera SARS-CoV-2-infektioner in vivo. De beskrivna bildsystemen ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) och in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) utgör ett utmärkt alternativ för att förstå dynamiken i SARS-CoV-2-infektion, viral patogenes och för att identifiera infekterade celler/orga...

Allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) är ett omslutet, positivt, enkelsträngat RNA-virus som tillhör Betacoronavirus-härstamningen i Coronaviridae-familjen 1. Denna virala familj är uppdelad i Alpha-, Beta-, Gamma- och Delta-coronavirus1. Alfa- och betacoronavirus infekterar främst däggdjur, medan Gamma- och Deltacoronavirus nästan uteslutande infekterar fåglar2. Hittills har sju coronavirus (CoV) korsat artbarriärer och dykt upp som mänskliga coronavirus (HCoV): två alfa-CoV (HCoV-229E och HCoV-NL63) och fem beta-CoV (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, Mellanöstern respiratoriskt syndrom coronavirus [MERS-CoV] och SARS-CoV-2) 3,4,5,6. SARS-CoV, MERS-CoV och SARS-CoV-2 är högpatogena och orsakar allvarlig infektion i nedre luftvägarna7. Före uppkomsten av SARS-CoV-2 fanns det två epidemiska utbrott orsakade av CoVs: SARS-CoV i Guangdong Providence, Kina, från 2002-2003, med en falldödlighet (CFR) på cirka 9,7%; och MERS-CoV i Mellanöstern från 2012 till idag, med en CFR på cirka 34% 7,8. SARS-CoV-2 har en övergripande CFR mellan 3,4% -49%, med underliggande tillstånd som bidrar till en högre CFR 8,9. Sedan upptäckten i december 2019, i Wuhan, Kina, har SARS-CoV-2 varit ansvarig för över 242 miljoner mänskliga infektioner och mer än 4,9 miljoner mänskliga dödsfall över hela världen 7,10,11,12. Sedan slutet av 2020 har nya SARS-CoV-2-varianter av oro (VoC) och varianter av intresse (VoI) påverkat virusegenskaperna, inklusive överföring och antigenicitet 9,13, och den övergripande riktningen för COVID-19-pandemin. För behandling av SARS-CoV-2-infektioner finns det för närvarande bara ett USA (USA) Food and Drug Administration (FDA) terapeutiskt antiviralt (remdesivir) och ett emergency use authorization (EUA) läkemedel (baricitinib, som ska administreras i kombination med remdesivir)14. Det finns också 6 godkända EUA monoklonala antikroppar: REGEN-COV (casirivimab och imdevimab, administreras tillsammans), sotrovimab, tocilizumab och bamlanivimab och etesevimab administreras tillsammans 15,16,17,18,19. Det finns för närvarande endast ett FDA-godkänt profylaktiskt vaccin, Pfizer-BioNTech, och två andra profylaktiska vacciner (Moderna och Janssen) har godkänts av EUA 20,21,22,23,24. Men med den okontrollerade infektionshastigheten och uppkomsten av VoC och VoI utgör SARS-CoV-2 fortfarande ett hot mot människors hälsa. Därför behövs det omgående nya tillvägagångssätt för att identifiera effektiva profylaktiska medel och terapier för att kontrollera SARS-CoV-2-infektion och den fortfarande pågående COVID-19-pandemin.
Att studera SARS-CoV-2 kräver mödosamma tekniker och sekundära metoder för att identifiera förekomsten av viruset i infekterade celler och / eller validerade djurmodeller av infektion. Användningen av omvänd genetik har gjort det möjligt för generering av rekombinanta virus att svara på viktiga frågor i biologin för virusinfektioner. Till exempel har omvänd genetikteknik gett medel för att avslöja och förstå mekanismerna för virusinfektion, patogenes och sjukdom. På samma sätt har omvänd genetik tillvägagångssätt banat väg för att konstruera rekombinanta virus som saknar virala proteiner för att förstå deras bidrag i viral patogenes. Dessutom har omvänd genetik använts för att generera rekombinanta virus som uttrycker reportergener för in vitro- och in vivo-applikationer, inklusive identifiering av profylaktiska och/eller terapeutiska metoder för behandling av virusinfektioner. Fluorescerande och bioluminescerande proteiner är de vanligaste reportergenerna på grund av deras känslighet, stabilitet och enkla detektion baserat på förbättring av ny teknik25,26. In vitro har fluorescerande proteiner visat sig fungera som ett bättre alternativ för lokalisering av virus i infekterade celler, medan luciferaser är mer praktiska för kvantifieringsstudier 27,28,29. In vivo föredras luciferaser framför fluorescerande proteiner för avbildning av hela djur, medan fluorescerande proteiner föredras för identifiering av infekterade celler eller ex vivo-avbildning 30,31,32. Användningen av reporteruttryckande rekombinanta virus har fungerat som ett kraftfullt verktyg för studier av virus i många familjer, inklusive bland annat flavivirus, enterovirus, alfavirus, lentivirus, arenavirus och influensavirus 28,33,34,35,36.
För att övervinna behovet av sekundära metoder för att studera SARS-CoV-2 och karakterisera SARS-CoV-2-infektion i realtid in vivo har vi genererat replikationskompetenta rekombinanta (r) SARS-CoV-2 som uttrycker bioluminescerande (nanoluciferas, Nluc) eller fluorescerande (Venus) proteiner med hjälp av våra tidigare beskrivna bakteriella artificiella kromosomer (BAC) -baserade omvänd genetik, som upprätthålls som en enda kopia i E. coli för att minimera toxiciteten hos virussekvenser under dess förökning i bakterier 37,38. I synnerhet visade rSARS-CoV-2 / Nluc och rSARS-CoV-2 / Venus rSARS-CoV-2 / WT-liknande patogenicitet in vivo. Den höga nivån av Venus-uttryck från rSARS-CoV-2 / Venus gjorde det möjligt att upptäcka virusinfektion i lungorna hos infekterade K18 hACE2-transgena möss med hjälp av ett in vivo-bildsystem (IVIS)39. Nivåerna av Venus-uttryck korrelerade väl med virala titrar som detekterades i lungorna, vilket visar möjligheten att använda Venus-uttryck som ett giltigt surrogat av SARS-CoV-2-infektion. Med hjälp av rSARS-CoV-2 / Nluc kunde vi spåra dynamiken i virusinfektion i realtid och longitudinellt bedöma SARS-CoV-2-infektion in vivo med samma IVIS-tillvägagångssätt i K18 hACE2 transgena möss.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Triton X-100</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>X198-07</td>
			<td>Store at room temperature (RT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% DEAE-Dextran</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>195133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin solution, neutral buffered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S-5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>655-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>African green monkey kidney epithelial cells (Vero E6)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ami HT</td>
			<td>Spectral Instruments Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aura Imaging Software 3.2.0</td>
			<td>Spectral Instruments Imaging</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), 35%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-055-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia gas machine</td>
			<td>Veterinary Anesthesia Systems, Inc.</td>
			<td>VAS 2001R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>1500-050</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four- to six-week-old female K18-hACE2 transgenic mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism Version 9.1.0</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>1001936040</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MARS Data Analysis Software</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MB10 tablets</td>
			<td>QUIP Laboratories</td>
			<td>MBTAB1.5</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-Glo Luciferase Assay Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N1110</td>
			<td>This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well Microplates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>269620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well Microplates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>269620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-009-CI</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHERAstar FSX</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td>PHERAstar FSX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precelleys Evolution homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000062-PEVO0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft tissue homogenizing CK14 &#8211; 7 mL</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000940-LYSK0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 EasYFlask</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN ABC-HRP Kit, Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-4002</td>
			<td>ABC kit and DAB Peroxidase Substrate kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging and quantification of viral infection in k18 hace2 transgenic mice using reporter-expressing recombinant sars-cov-2

Coronavirussjukdomen 2019 (COVID-19) pandemi har orsakats av allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Hittills har SARS-CoV-2 varit ansvarig för över 242 miljoner infektioner och mer än 4,9 miljoner dödsfall över hela världen. I likhet med andra virus kräver studier av SARS-CoV-2 användning av experimentella metoder för att detektera förekomsten av virus i infekterade celler och / eller i djurmodeller. För att övervinna denna begränsning genererade vi replikationskompetenta rekombinanta (r) SARS-CoV-2 som uttrycker bioluminescerande (nanoluciferas, Nluc) eller fluorescerande (Venus) proteiner. Dessa reporteruttryckande rSARS-CoV-2 gör det möjligt att spåra virusinfektioner in vitro och in vivo baserat på uttrycket av Nluc- och Venus-reportergener. Här beskriver studien användningen av rSARS-CoV-2/Nluc och rSARS-CoV-2/Venus för att detektera och spåra SARS-CoV-2-infektion i den tidigare beskrivna K18 humana angiotensinkonverterande enzym 2 (hACE2) transgena musmodellen för infektion med hjälp av in vivo-avbildningssystem (IVIS). Denna rSARS-CoV-2 / Nluc och rSARS-CoV-2 / Venus visar rSARS-CoV-2 / WT-liknande patogenicitet och viral replikation in vivo. Viktigt är att Nluc och Venus uttryck tillåter oss att direkt spåra virusinfektioner in vivo och ex vivo, hos infekterade möss. Dessa rSARS-CoV-2 / Nluc och rSARS-CoV-2 / Venus representerar ett utmärkt alternativ för att studera biologin hos SARS-CoV-2 in vivo, för att förstå virusinfektion och tillhörande COVID-19-sjukdom och för att identifiera effektiva profylaktiska och / eller terapeutiska behandlingar för att bekämpa SARS-CoV-2-infektion.

rSARS-CoV-2/Nluc-infektion hos K18 hACE2 transgena möss (figur 1 och 2) Figur 1A visar en schematisk representation av rSARS-CoV-2/WT (överst) och rSARS-CoV-2/Nluc (nederst) som används för att bedöma infektioner in vivo. Figur 1B visar det schematiska flödesschemat som används för att bedöma rSARS-CoV-2/Nluc-infektionsdynamiken hos K18 hACE2 transgena möss. Fyra till sex vecko...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2 at JoVE.com

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Detta protokoll beskriver dynamiken hos virusinfektioner med användning av luciferas- och fluorescensuttryckande rekombinant (r) SARS-CoV-2 och ett in vivo-bildsystem (IVIS) i K18 hACE2 transgena möss för att övervinna behovet av sekundära metoder som krävs för att studera SARS-CoV-2-infektioner in vivo.

Levande avbildning och kvantifiering av virusinfektion i K18 hACE2 transgena möss med reporteruttryckande rekombinant SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Vårt protokoll beskrev användningen av fluorescerande eller självlysande uttryckande rekombinant SARS-CoV-2 för in vivo och ex vivo live imaging viral detektion och viral spårning i K18 human ACE2 transgen musmodell av SARS-CoV-2-infektion. Den största fördelen med denna teknik är tillämpningen och genomförbarheten av viral detektion och spårning för in vivo- och ex vivo-studier av SARS-CoV-2 i den humana ACE2-transgena musmodellen. Användningen av in vivo-avbildning av SARS-CoV-2 i K18 human ACE2 transgen musmodell representerar ett utmärkt alternativ för att utvärdera terapier för behandling av SARS-CoV-2-infektion in vivo.Implementering av reportrar SARS-CoV-2 representerar ett utmärkt alternativ för att bedöma patogenicitet, viral replikation och trofism in vivo. För in vivo-studier med luciferas som uttrycker SARS-CoV-2 rekommenderas rakning av mössen och snabb avbildning efter substratinjektion för att förbättra bioluminescenssignalen. Börja bioluminescensövervakningen genom att initiera in vivo-bildsystemet, eller IVIS, och ställa in parametrarna, klicka på bildläget till Bioluminescence och öppna sedan filtret och ställ in exponeringstiden till Auto.Ta sedan bort en redan rakad och bedövad mus från isoleringskammaren och använd en 25 gauge nål för att retro-orbitalt administrera 100 mikroliter av luciferassubstratet utspätt 1 till 10 i PBS till musen. Placera sedan musen tillbaka i isoleringskammaren, överför isoleringskammaren till IVIS-maskinen, som är utrustad med en värmekomponent för att förhindra hypotermi, och stäng IVIS-bilddörren för att initiera avbildning genom att välja Förvärva i programvaran. För att analysera de förvärvade bioluminescensbilderna, använd ROI- eller intresseområdesverktyget i programvaran för att ange den exakta signalen och mäta flödet.Starta bildprogramvaran och ställ in parametrarna. Klicka på bildläget till Fluorescens, ställ in excitation på 500 nanometer och emissionsfilter på 530 nanometer och ställ in exponeringstiden för Auto.Placera utskurna lungor i en 6-brunnsplatta som innehåller två milliliter 1X PBS och skölj för att ta bort överflödigt blod. Desinficera och rengör kirurgiska verktyg mellan proverna med 70% etanol. Efter initialisering av IVIS-maskinen, placera lungorna på ett svart ark och separera vävnaderna från varandra.Placera sedan brickan inuti isoleringskammaren inuti biosäkerhetsskåpet och överför sedan isoleringskammaren till IVIS. Stäng IVIS-bilddörren och klicka på Skaffa för att starta bildsystemet. För att analysera fluorescens, använd ROI-verktyget och rita ROI runt var och en av de enskilda lungorna.Mät varje ROI manuellt och använd sedan de genomsnittliga strålningseffektivitetsvärdena som ges och subtrahera från de mock-infekterade mössen. När avbildning är klar, placera vävnaderna i ett kryorör för torrisfrysning för att lagra vid minus 80 grader Celsius för senare bearbetning. Med hjälp av supernat erhållet från vävnadshomogenaten, utför tiofaldig seriell utspädning och infektera sammanflytande monolager av Vero E6-celler med en milliliter av varje supernatantutspädning i tredubblar.Låt viruset adsorbera i en timme vid 37 grader Celsius i en fuktad 5% koldioxidinkubator. När du är klar, tvätta cellerna med en milliliter 1X PBS och inkubera sedan cellerna i två milliliter postinfektionsmedier som innehåller 1% agar i den fuktade 5% koldioxidinkubatorn vid 37 grader Celsius i 72 timmar. Efter inkubationen, inaktivera plattorna i 10% neutralt buffrat formalin i 24 timmar vid fyra grader Celsius, vilket säkerställer att hela plattan är nedsänkt.Ta plattor ur biosäkerhetsnivå tre och tvätta cellerna tre gånger med en milliliter 0,5% Triton X-100 i 10 minuter vid rumstemperatur. Blockera sedan de permeabiliserade cellerna med en milliliter 2,5 bovint serumalbumin eller BSA och PBS i en timme vid 37 grader Celsius följt av inkubation i en milliliter ett mikrogram per milliliter av SARS-CoV-nukleokapsidproteinet korsreaktiv monoklonal antikropp 1C7C7 utspädd i 2,5 BSA i en timme vid 37 grader Celsius. Tvätta cellerna tre gånger med en milliliter 1X PBS och utveckla placken med abc och diaminobenzen, eller DAB, peroxidassubstratsatser enligt tillverkarens instruktioner och beräkna sedan virustitrarna som plackbildande enheter per milliliter.I studien observerades att det bioluminescerande nanoluciferaset, eller Nluc, lätt detekterades och möss infekterade med rSARS-CoV-2 Nluc, men inte de som var infekterade med rSARS-CoV-2 vildtyp eller mock infekterade. De kvantitativa analyserna visade Nluc-intensitet vid olika dagar efter infektion. Grova lesioner på lungytan hos möss infekterade med rSARS-CoV-2 Nluc var jämförbara med dem i den vildtypsinfekterade gruppen rSARS-CoV-2.Dessutom detekterades virala titrar och de rSARS-CoV-2 Nluc-infekterade mössen var jämförbara med de som infekterades med rSARS-CoV-2 vildtyp i alla organ vid olika dagar efter infektion. Samtidigt detekterades Nluc-aktivitet endast i organen från rSARS-CoV-2 Nluc-infekterade möss. En separat grupp mockinfekterade och virusinfekterade möss övervakades i 12 dagar för förändringar i kroppsvikt och överlevnad.Möss infekterade med rSARS-CoV-2 Nluc och rSARS-CoV-2 vildtyp förlorade upp till 25% av sin kroppsvikt och alla gav efter för virusinfektion mellan sju till åtta dagar efter infektion. Efter rSARS-CoV-2 Venus-infektion upptäcktes Venus-uttryck lätt i alla lungor från möss infekterade med rSARS-CoV-2 Venus men inte de som var infekterade med rSARS-CoV-2 vildtyp eller mock-infekterade. De kvantitativa analyserna visade att Venus intensitet toppar vid två dagar efter infektion och minskar under infektionsförloppet och lungorna hos infekterade möss.Bilder av lungytan avslöjade grova lesioner av möss infekterade med rSARS-CoV-2 Venus var jämförbara med rSARS-CoV-2 vildtypsinfekterade möss. Infektion med rSARS-CoV-2 Venus resulterade också i jämförbara virala titrar med de som observerades hos möss infekterade med rSARS-CoV-2 vildtyp i alla organ. Mössen infekterade med rSARS-CoV-2 Venus och rSARS-CoV-2 vildtyp förlorade upp till 25% av sin kroppsvikt och gav efter för virusinfektion vid dag nio efter infektion utan överlevnad.Resultaten från reporter som uttrycker SARS-CoV-2 har visat sig vara giltiga surrogater av virusinfektion. Således kan detta leda till snabb identifiering och utvärdering av motåtgärder för behandling av SARS-CoV-2-infektion.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo avbildning av Transgena Leishmania parasiter i ett Live-värd

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Produktion och Titering av rekombinanta Adeno-associerad virala vektorer

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

En Luciferase-fluorescerande reporter influensa virus för levande avbildning och kvantifiering av virusinfektion

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Visualisering av SARS-CoV-2 med immun RNA-fluorescens i Situ hybridisering

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

Påvisande av SARS-CoV-2 neutraliserande antikroppar med hjälp av fluorescerande avbildning med hög genomströmning av pseudovirusinfektion

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

En snabb, Multiplex Dual Reporter IgG och IgM SARS-CoV-2 neutraliseringsanalys för ett multiplexerat pärlbaserat flödesanalyssystem

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Detektion av SARS-CoV-2 receptorbindande domänantikropp med hjälp av en Hibit-baserad bioreportör

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Effektiv SARS-CoV-2 Kvantitativ omvänd transkriptas PCR Saliva Diagnostisk strategi med hjälp av öppen källkod pipettering robotar

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Studying Host-Virus Interactions with Pseudotyped Viruses (Video) | JoVE

Pseudotypade virus som ett molekylärt verktyg för att övervaka humana immunsvar mot SARS-CoV-2 via neutralisationsanalys

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...