Name: isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments
Uploaded: 2021-10-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments at JoVE.com

تم دعم هذا العمل بتمويل من منح المعاهد الوطنية للصحة HL119798 و HL095070 و HL139757 إلى HJ. يتم دعم HJ أيضا من قبل Wallace H. Coulter Distinguished College Chair Professorship. تم دعم الخدمات التي تقدمها إيموري المتكاملة لعلم الجينوم الأساسي (EIGC) من قبل كلية الطب بجامعة إيموري وتم دعمها جزئيا من قبل تحالف جورجيا للعلوم السريرية والانتقالية التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم. UL1TR002378. المحتوى المقدم أعلاه هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يعكس وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية الموضحة أدناه من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة إيموري. تم استخدام الفئران C57BL/6 غير المتطابقة مع فرط الكوليسترول في الدم والعمر والجنس للتخفيف من التباين المعتمد على الجنس وتعويض أي مضاعفات لحالات فرط كوليستروليوم.
<p...

<ol>
	<li>Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+atherosclerosis+development+in+C57Bl6+mice+by+overexpressing+AAV-mediated+PCSK9+and+partial+carotid+ligation.">Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation.</a> Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).</li><li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+carotid+ligation+is+a+model+of+acutely+induced+disturbed+flow,+leading+to+rapid+endothelial+dysfunction+and+atherosclerosis.">Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).</li><li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+disturbed+flow-induced+atherosclerosis+in+mouse+carotid+artery+by+partial+ligation+and+a+simple+method+of+RNA+isolation+from+carotid+endothelium.">A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861 (2010).</li><li>Dunn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-dependent+epigenetic+DNA+methylation+regulates+endothelial+gene+expression+and+atherosclerosis.">Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).</li><li>Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-dependent+regulation+of+genome-wide+mRNA+and+microRNA+expression+in+endothelial+cells+in+vivo.">Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo.</a> Scientific Data. 1 (1), 140039 (2014).</li><li>Ni, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+novel+mechanosensitive+genes+in+vivo+using+mouse+carotid+artery+endothelium+exposed+to+disturbed+flow.">Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow.</a> Blood. 116 (15), 66-73 (2010).</li><li>Son, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atypical+mechanosensitive+microRNA-712+derived+from+pre-ribosomal+RNA+induces+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis.">The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Communications. 4, 3000 (2013).</li><li>Andueza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+reprogramming+by+disturbed+flow+revealed+by+single-cell+RNA+and+chromatin+accessibility+study.">Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study.</a> Cell Reports. 33 (11), 108491 (2020).</li><li>Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+single-cell+chromatin+analysis+with+Signac.">Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+integration+of+single-cell+data.">Comprehensive integration of single-cell data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li><li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cell+death+by+trypan+blue+uptake+and+light+microscopy.">Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+cellular+heterogeneity+of+mouse+carotid+artery+under+disturbed+flow.">Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow.</a> Cell Death and Discovery. 7 (1), 180 (2021).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+activated+cell+populations+using+single-cell+RNA-seq.">Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li><li>O'Flanagan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+solid+tumor+tissues+with+cold+active+protease+for+single-cell+RNA-seq+minimizes+conserved+collagenase-associated+stress+responses.">Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.</a> Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).</li></ol>

تقدم هذه الورقة بروتوكولا مفصلا لعزل مستحضرات الخلية الواحدة عن الشرايين السباتية للفأر. يمكن دراسة تأثير تدفق D على الخلايا البطانية بدقة إذا تم إجراء جراحة PCL بشكل صحيح. من الأهمية بمكان تحديد فروع الشريان السباتي الشائع بشكل صحيح ، مثل الشريان السباتي الخارجي والسباتي الداخلي وال?...

أثبت هذا المختبر سابقا أن تحريض تدفق D يؤدي إلى تطور تصلب الشرايين السريع والوعرة في الفئران شديدة الدهون 1,2. كان نموذج الفأر الجديد لتصلب الشرايين الناجم عن التدفق D ممكنا باستخدام جراحة ربط الشريان السباتي الجزئي (PCL) 3. تحفز جراحة PCL حالة تدفق الدم المنخفضة والمتذبذبة أو تدفق d في الشريان السباتي الأيسر المربوط (LCA). في المقابل، لا يزال الشريان السباتي الأيمن المقابل (RCA) يواجه تدفقا صفائحيا مستقرا (s-flow). في السابق ، لفهم تأثير تدفق D على الخلايا البطانية ، تم تشريح الشرايين السباتية بعد جراحة الربط الجزئي ومسحها بعامل تحلل قائم على الفينول والجوانيدين إيزوثيوسيانات (طريقة تدفق الحمض النووي الريبي / الحمض النووي) 2,4 ، والتي وفرت الحمض النووي الريبي "السائب المجمع" المخصب البطاني أو الحمض النووي. ثم تمت معالجة هذه الحمض النووي الريبي السائب المجمع أو الحمض النووي لدراسات النسخ أو دراسات ميثيلوم الحمض النووي فوق الجينومي ، على التوالي4،5،6. ساعدت هذه الدراسات في اكتشاف العديد من الجينات الحساسة للتدفق والحمض النووي الريبي الميكروي الذي تم التحقيق على نطاق واسع في أدواره في البيولوجيا البطانية وتصلب الشرايين4،6،7.
ومع ذلك ، على الرغم من التخصيب البطاني ، لم تتمكن دراسات الحمض النووي الريبي / الحمض النووي السائبة هذه من التمييز بين الدور المحدد لكل نوع من الخلايا في جدار الشريان في تصلب الشرايين الناجم عن التدفق D. تم إجراء عزل الخلية الواحدة المخصب البطاني (sc) ودراسات تسلسل scRNA و scATAC للتغلب على هذا القيد8. لهذا ، خضعت الفئران C57Bl6 لجراحة PCL للحث على تدفق d في LCA أثناء استخدام RCA المكشوف للتدفق s كعنصر تحكم. بعد يومين أو أسبوعين من جراحة PCL ، تم التضحية بالفئران ، وتم تشريح السباتيدات وتنظيفها. تم غرس تجويف كل من LCAs و RCAs مع الكولاجيناز ، وتم جمع هضمات الكولاجيناز المضيئة التي تحتوي على ECs كجزء كبير والخلايا الشريانية الأخرى. تم إعداد التعليق أحادي الخلية (scRNAseq) أو التعليق أحادي النواة (scATACseq) وتم ترميزه بمعرفات فريدة لكل خلية أو نواة باستخدام إعداد 10x Genomics. تم إخضاع الحمض النووي الريبي لإعداد مكتبة cDNA وتسلسلها.
تمت معالجة مجموعات بيانات scRNAseq و scATACseq باستخدام برنامج Cell Ranger أحادي الخلية وتم تحليلها بشكل أكبر بواسطة حزم Seurat و Signac R 9,10. تم تعيين نوع خلية لكل خلية ونواة من هذه التحليلات وتم تجميعها في نوع الخلية بناء على جينات العلامات وأنماط التعبير الجيني الفريدة. أظهرت نتائج scRNAseq و scATACseq أن هذه المستحضرات أحادية الخلية غنية ب ECs وتحتوي أيضا على خلايا العضلات الملساء (SMCs) والخلايا الليفية والخلايا المناعية.
وكشف مزيد من التحليل أن مجموعة EC في عملية الهضم المضيئة متباعدة للغاية وبلاستيكية (8 مجموعات EC مختلفة) وتستجيب لتدفق الدم. الأهم من ذلك ، أظهرت هذه النتائج أن تدفق D يعيد برمجة ECs من النمط الظاهري المضاد للالتهابات المحمي من الثيرو إلى الأنماط الظاهرية المؤيدة لتصلب الشرايين ، بما في ذلك الانتقال المؤيد للالتهابات ، والانتقال البطاني إلى اللحمة المتوسطة ، وانتقال الخلايا الجذعية / السلفية البطانية ، والأكثر إثارة للدهشة ، الانتقال الشبيه بالخلية البطانية إلى المناعة. بالإضافة إلى ذلك، تكشف بيانات scATACseq عن تغييرات جديدة في إمكانية الوصول إلى الكروماتين تعتمد على التدفق ومواقع ربط عامل النسخ بطريقة على نطاق الجينوم، والتي تشكل الأساس للعديد من الفرضيات الجديدة. منهجية وبروتوكول إعداد الخلايا البطانية المفردة للدراسات متعددة الخلايا أحادية الخلية من الشرايين السباتية للفأر مفصلة أدناه.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (Cell Culture Grade)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21040CMX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022-43-108-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile</td>
			<td>Fablab</td>
			<td>FL4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL SuperClear Centrifuge Tubes</td>
			<td>Labcon</td>
			<td>3191-335-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk Suture Sterile</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>s-1172 c2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged</td>
			<td>Thermo Fisher Scientic</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase solution,sterile-filtered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000123/ 2000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>RXBUPRENOR5-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Controller &#38; Next GEM Accessory Kit</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#39; Reagent Kits v3.1</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2100502.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D141-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co</td>
			<td>RS-5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase1</td>
			<td>New England Biolabs Inc</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Benchtop-Model # 5425)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620444230VR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium Select</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed Angle Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>FA-45-24-11-Kit Rotor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffered saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>51558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson vet</td>
			<td>789 313 89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACs Smart Strainers (30 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (100 &#181;m)</td>
			<td>&#160;Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline (0.9% sodium chloride)</td>
			<td>Baxter International Inc</td>
			<td>2B1323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei Buffer (20x)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN 2000153/2000207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientic</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co</td>
			<td>RS-5675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-5480</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Mend II</td>
			<td>Webster Veteinanry</td>
			<td>07-856-7946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II Collagenase</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>2100502.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deposited Data</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scATACseq FastQ files</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scRNAseq FastQ files</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Ranger 3.1.0</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cicero</td>
			<td>Pliner et al., 2018</td>
			<td>https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ggplot2 v3.2.1</td>
			<td>Hadley Wickham</td>
			<td>https://cran.r-project.org</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony</td>
			<td>Korsunsky et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/immunogenomics/harmony</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Schneider et al., 2012</td>
			<td>https://imagej.nih.gov</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocle 2.8.0</td>
			<td>Qiu et al., 2017</td>
			<td>https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 3.6.2</td>
			<td>R Foundation</td>
			<td>https://www.r-project.org</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seurat 3.1.3</td>
			<td>Stuart et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/satijalab/seurat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signac 0.2.5</td>
			<td>Stuart et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/timoast/signac</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments

تصلب الشرايين هو مرض التهابي في المناطق الشريانية المعرضة لتدفق الدم المضطرب (d-flow). ينظم D-flow التعبير عن الجينات في البطانة على مستويات النسخ وفوق الجينوم ، مما يؤدي إلى استجابات برواثيروجينيك. في الآونة الأخيرة ، تم إجراء دراسات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNAseq) وفحص الخلية الواحدة لتسلسل الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه عبر Transposase (scATACseq) لتحديد تغييرات إمكانية الوصول إلى النسخ والكروماتين بدقة خلية واحدة باستخدام نموذج ربط الشريان السباتي الجزئي للفأر (PCL). نظرا لأن الخلايا البطانية (ECs) تمثل جزءا صغيرا من إجمالي مجموعات الخلايا في جدار الشريان ، فقد تم استخدام طريقة هضم لمعانية للحصول على مستحضرات أحادية الخلية غنية ب EC. في هذه الدراسة ، خضعت الفئران لجراحة PCL للحث على تدفق D في الشريان السباتي الأيسر (LCA) أثناء استخدام الشريان السباتي الأيمن (RCA) كعنصر تحكم. تم تشريح الشرايين السباتية بعد يومين أو أسبوعين من جراحة PCL. تعرض تجويف كل سباتي لهضم الكولاجيناز ، وتم الحصول على خلايا مفردة غنية بالبطانة أو نوى واحدة. تم ترميز هذه المستحضرات أحادية الخلية وأحادية النوى في وقت لاحق باستخدام إعداد الموائع الدقيقة 10x Genomics. ثم تم استخدام الخلايا الأحادية المشفرة والنوى المفردة لإعداد الحمض النووي الريبي ، وتوليد المكتبة ، والتسلسل على جهاز تسلسل الحمض النووي عالي الإنتاجية. بعد معالجة المعلوماتية الحيوية ، حددت مجموعات بيانات scRNAseq و scATACseq أنواعا مختلفة من الخلايا من الهضم المضيء ، والتي تتكون في المقام الأول من ECs. كانت خلايا العضلات الملساء والخلايا الليفية والخلايا المناعية موجودة أيضا. ساعدت طريقة التخصيب EC هذه في فهم تأثير تدفق الدم على البطانة ، والتي كان من الممكن أن تكون صعبة مع طريقة هضم الشريان الكلي. يمكن استخدام طريقة تحضير الخلية الواحدة المخصب ب EC لإجراء دراسات omics أحادية الخلية في EC-knockouts والفئران المعدلة وراثيا حيث لم تتم دراسة تأثير تدفق الدم على هذه الجينات. الأهم من ذلك ، يمكن تكييف هذه التقنية لعزل الخلايا المفردة المخصب ب EC من الشريان البشري لإجراء دراسات ميكانيكية مماثلة.

تم إجراء جراحات ربط الشريان السباتي الجزئي على 44 فأرا ، وتم التحقق من صحة بداية تدفق D في LCA عن طريق إجراء التصوير بالموجات فوق الصوتية بعد يوم واحد من جراحة الربط الجزئي. تؤدي جراحة الربط الجزئي الناجحة إلى انخفاض سرعة تدفق الدم وعكس تدفق الدم (التدفق المضطرب) في LCA3. تم تشر?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments at JoVE.com

Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments

نقدم طريقة لعزل الخلايا البطانية والنوى عن تجويف الشرايين السباتية للفئران المعرضة لظروف تدفق مستقرة أو مضطربة لإجراء تجارب omics أحادية الخلية.

عزل الخلايا البطانية عن تجويف الشرايين السباتية للفئران لإجراء تجارب متعددة الخلايا أحادية الخلية

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in ...

في الأوعية الدموية ، يكون عدد الخلايا البطانية منخفضا جدا ، مما يجعل من الصعب دراستها. بروتوكولنا يلغي هذا القيد ، ويسمح لنا بدراسة المسارات الجزيئية والعلاجات الجديدة. يسمح لنا بروتوكولنا بالحصول على عينات مخصبة بطانية ، ودراسة كيفية تأثير التدفق المضطرب الحاد والمزمن على هذا النوع من الخلايا.إن القدرة على دراسة الخلايا البطانية بمزيد من التفصيل تجعل من الممكن تحديد الجينات المستهدفة ، وبالتالي العلاجات المحتملة لتصلب الشرايين التي تستهدف الخلايا البطانية. عزل الشريان السباتي أمر صعب ، ويتطلب الصبر والخبرة. للبدء ، قم بإعداد الحيوان عن طريق حقن 0.05 ملليغرام لكل كيلوغرام من البوبرينورفين تحت الجلد.تعقيم المنطقة المزيلة باستخدام محلول بيتادين والأيزوبروبانول ثلاث مرات. قم بعمل شق خط الوسط البطني يبلغ حوالي سنتيمتر واحد في منطقة الرقبة. ثم فضح نقطة فرع LCA عن طريق تشريح حاد.قم بربط الشرايين السباتية الداخلية اليسرى والسباتية الخارجية والقذالي بخيوط 6-0 ، تاركا الشريان الدرقي العلوي دون مساس. أغلق الشق باستخدام غراء الأنسجة أو الغرز. انقل الماوس إلى قفص استرداد تم تسخينه مسبقا عند 37 درجة مئوية.ضع الماوس على منشفة نظيفة لمدة تصل إلى ساعة واحدة لتجنب انخفاض حرارة الجسم بعد الجراحة. أدخل إبرة قياس 21 في الخط الوريدي المتصل عبر قمة القلب إلى البطين الأيسر. اسمح بالتروية الرجعية لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق باستخدام محلول ملحي عادي في درجة حرارة الغرفة.حافظ على معدل تدفق ثابت من خلال تطبيق ضغط ثابت أثناء الحقن أو استخدام خط IV ، والحفاظ على الكيس الملحي على ارتفاع ثمانية إلى تسعة أقدام. إزالة الجلد من منطقة الرقبة مع جميع الدهون والعضلات والأنسجة الضامة لفضح الشرايين السباتية. ثم قم بإزالة الأنسجة المحيطة بالقناة حول السباتيدات تاركا السباتي متصلا بالجسم.قم بعمل شق أسفل موقع الربط في LCA للسماح بالتروية. قم بدمج LCA من خلال البطين الأيسر لمدة دقيقة أخرى لإزالة أي آثار دموية. اغسل الجزء الخارجي من الشرايين السباتية بمحلول ملحي طبيعي لإزالة أي آثار للدم.استخدم حقنة الأنسولين مع إبرة قياس 29 لحقن 50 ميكرولتر من مخزن الهضم العازل في تجويف الطرف البعيد من الشريان السباتي الأيسر. استخدم مشبكا صغيرا لتثبيت الطرف القريب من الشريان السباتي المليء بمخزن الهضم. أضف 15 إلى 20 ميكرولترا من المخزن المؤقت للهضم إلى التجويف ، وقم بقص الطرف البعيد لتجنب أي إطلاق للمخزن المؤقت للهضم.انقل الشرايين السباتية من الفأر إلى أطباق 35 ملم تحتوي على محلول ملحي دافئ 37 درجة مئوية HEPES. واحتضنها لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع هزاز متقطع. قم بإزالة الشريان السباتي باستخدام المشابك من طبق 35 ملم بعد اكتمال الهضم الأنزيمي المضيء.افصل المشابك بعناية ، بحيث لا يتسرب المخزن المؤقت للهضم. امسك أحد طرفي الشريان السباتي فوق أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 ملليلتر. أضف 100 ميكرولتر من مخزن الهضم الدافئ إلى التجويف عن طريق إدخال إبرة قياس 29 مجهزة بحقنة أنسولين.اغسل تجويف الشريان السباتي بسرعة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق، ثم أضف 0.3 ميكرولتر من FBS إلى الأنبوب لوقف التفاعل. ضع أنبوب الطرد المركزي الصغير على الجليد. قم بطرد الخلايا مركزيا عند 500 G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، باستخدام جهاز طرد مركزي مجهز بدوار ثابت الزاوية وتخلص من السوبرنات.أعد تعليق الخلايا في مخزن الهضم العازل ، الذي يحتوي على كاشف تفكك الخلايا ، واحتضنها لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية لفصلها إلى خلايا مفردة. منع التفاعل الإنزيمي عن طريق إضافة 0.15 ملليلتر من FBS إلى أنبوب 0.5 ملليلتر، وتكرار الطرد المركزي. تخلص من السوبرناتانت ، وأعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من محلول 1٪ BSA البارد في PBS في أنبوب طرد مركزي صغير 0.2 ملليلتر.لتحليل خلية واحدة ، أعد تعليق الكريات مع 100 ميكرولتر من الثلج البارد 1٪ BSA في PBS في أنبوب 0.2 ملليلتر. لتحليل النواة المفردة ، أعد تعليق حبيبة الخلية في 100 ميكرولتر من 0.04٪ BSA في PBS البارد الجليدي ، وقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية الواحدة عند 500G عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تحلل تعليق الخلية الواحدة باستخدام مخزن مؤقت للتحلل البارد المثلج ، واحتضنه لمدة خمس دقائق على الجليد.امزج الليزات مع ماصة P20 ، واحتضنها لمدة 10 دقائق أخرى. بعد ذلك ، انقل الليزات في أنبوب 0.5 ملليلتر. اغسل الخلايا ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت ، واخلطها باستخدام ماصة.ثم كرر الطرد المركزي. تخلص من السوبرناتانت ، وأعد تعليق حبيبات النوى في 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنوى المخففة. عد مستحضرات النوى المفردة باستخدام مقياس الدم.بعد دراسة تسلسل النوى المفردة ، تم الحصول على خلية واحدة ونوى واحدة وتصورها بواسطة مجهر المجال الساطع وتباين الطور. كما تم إثبات كفاءة إعداد النوى المفردة من تعليق الخلية الواحدة. بعد دراسة تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، تم الحصول على معلمات مختلفة مثل توزيع الجينات لكل خلية ، والمعرف الجزيئي الفريد لكل خلية ، وقراءات الميتوكوندريا لكل خلية ، وبيانات تشبع التسلسل.بالنسبة لدراسة تسلسل ATAC أحادية الخلية ، لوحظ توزيع حجم الإدراج ، بما في ذلك نمط النطاقات النيوكليوسومية. كما لوحظت درجة التخصيب TSS العادية. بالإضافة إلى ذلك ، يقرأ الجزء المئوي في القمم.تم تحديد شظايا منطقة الذروة ، ودرجة إثراء TSS ، ونسبة القراءات في مواقع الجينوم في القائمة السوداء ، ونسبة إشارة النيوكليوسومات. الهضم الأنزيمي هو إجهاد للخلايا ، لذلك من الأهمية بمكان الحفاظ على العينات على الجليد ، وتنفيذ الإجراء في أسرع وقت ممكن. يمكننا استخدام هذه الطريقة للحصول على الخلايا البطانية ولوحتها من الفئران.يمكننا أيضا استخدام هذه التقنية لإجراء دراسات قائمة على Omix بالجملة. مهدت هذه التقنية الطريق لدراسة تأثير تدفق الدم المضطرب على الخلايا البطانية في الجسم الحي بطريقة خلية واحدة.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

عزل الخلايا البطانية صمامي

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

عزل الخلايا الجذعية من شبكية العين بالعين ماوس

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

العزلة والثقافة في الخلايا البطانية الرئوي من الفئران حديثي الولادة

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

جيل من الفئران المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

عزل الاوعية الدموية الدقيقة البطانية أنابيب الشرايين ماوس المقاومة

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

عزل خلايا الفئران صمام غشائي

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

العزلة والثقافة الابتدائية من خلايا الفأر الأورطي غشائي

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

عزل خلايا الفأر التاجي غشائي

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

عزل وتوصيف الخلايا البطانية الجيبية الأولية للكبد الفأر

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

عزل الخلايا البطانية الكبيبية للفأر الخالدة المشروطة مع الميتوكوندريا الفلورية

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...