Name: isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments
Uploaded: 2021-10-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door financiering van national institutes of health subsidies HL119798, HL095070 en HL139757 aan HJ. HJ wordt ook ondersteund door het Wallace H. Coulter Distinguished Faculty Chair Professorship. De diensten van de Emory Integrated Genomics Core (EIGC) werden gesubsidieerd door de Emory University School of Medicine en werden ook gedeeltelijk ondersteund door de Georgia Clinical and Translational Science Alliance van de National Institutes of Health onder toekenningsnummer. UL1TR002378. De hierboven verstrekte inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en weerspiegelt niet de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Alle hieronder beschreven dierprocedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee aan de Emory University. Niet-hypercholesterolemische, leeftijds- en geslachtsgematchte C57BL/6-muizen werden gebruikt om geslachtsafhankelijke variatie te verminderen en eventuele complicaties van hypercholesterolemische aandoeningen te compenseren.
1. Gedeeltelijke carotisligatie (PCL) chirurgie
OPMERKING: Gedeeltelijke halsslagaderligatie van LCA werd uitge...

<ol>
	<li>Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+atherosclerosis+development+in+C57Bl6+mice+by+overexpressing+AAV-mediated+PCSK9+and+partial+carotid+ligation.">Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation.</a> Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).</li><li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+carotid+ligation+is+a+model+of+acutely+induced+disturbed+flow,+leading+to+rapid+endothelial+dysfunction+and+atherosclerosis.">Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).</li><li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+disturbed+flow-induced+atherosclerosis+in+mouse+carotid+artery+by+partial+ligation+and+a+simple+method+of+RNA+isolation+from+carotid+endothelium.">A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861 (2010).</li><li>Dunn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-dependent+epigenetic+DNA+methylation+regulates+endothelial+gene+expression+and+atherosclerosis.">Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).</li><li>Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-dependent+regulation+of+genome-wide+mRNA+and+microRNA+expression+in+endothelial+cells+in+vivo.">Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo.</a> Scientific Data. 1 (1), 140039 (2014).</li><li>Ni, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+novel+mechanosensitive+genes+in+vivo+using+mouse+carotid+artery+endothelium+exposed+to+disturbed+flow.">Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow.</a> Blood. 116 (15), 66-73 (2010).</li><li>Son, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atypical+mechanosensitive+microRNA-712+derived+from+pre-ribosomal+RNA+induces+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis.">The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Communications. 4, 3000 (2013).</li><li>Andueza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+reprogramming+by+disturbed+flow+revealed+by+single-cell+RNA+and+chromatin+accessibility+study.">Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study.</a> Cell Reports. 33 (11), 108491 (2020).</li><li>Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+single-cell+chromatin+analysis+with+Signac.">Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+integration+of+single-cell+data.">Comprehensive integration of single-cell data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li><li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cell+death+by+trypan+blue+uptake+and+light+microscopy.">Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+cellular+heterogeneity+of+mouse+carotid+artery+under+disturbed+flow.">Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow.</a> Cell Death and Discovery. 7 (1), 180 (2021).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+activated+cell+populations+using+single-cell+RNA-seq.">Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li><li>O'Flanagan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+solid+tumor+tissues+with+cold+active+protease+for+single-cell+RNA-seq+minimizes+conserved+collagenase-associated+stress+responses.">Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.</a> Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).</li></ol>

Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol om eencellige preparaten te isoleren uit de halsslagaders van de muis. De invloed van d-flow op de endotheelcellen kan nauwkeurig worden bestudeerd als de PCL-operatie correct wordt uitgevoerd. Het is cruciaal om de takken van de gemeenschappelijke halsslagader correct te identificeren, zoals de externe halsslagader, interne halsslagader, occipitale slagader en superieure schildklierslagader. Validatie van stromingspatronen door echografie valideert verder het succesv...

Dit laboratorium toonde eerder aan dat inductie van d-flow leidt tot snelle en robuuste atheroscleroseontwikkeling bij hyperlipidemische muizen 1,2. Het nieuwe muismodel van d-flow-geïnduceerde atherosclerose was mogelijk met behulp van partiële carotisligatie (PCL) chirurgie 3. PCL-chirurgie induceert een lage en oscillerende bloedstroomconditie of d-flow in de ligatie linker halsslagader (LCA). Daarentegen blijft de contralaterale rechter halsslagader (RCA) te maken hebben met een stabiele laminaire stroming (s-flow). Om het effect van d-flow op endotheelcellen te begrijpen, werden de halsslagaders eerder na een gedeeltelijke ligatieoperatie ontleed en gespoeld met een op fenol en guanidine isothiocyanaat gebaseerd lysingmiddel (luminale RNA / DNA-spoelmethode)2,4, die endotheelverrijkte "gepoolde bulk" RNA's of DNA's leverden. Deze gepoolde bulk-RNA's of DNA's werden vervolgens verwerkt voor transcriptomische studies of epigenomische DNA-methyloomstudies, respectievelijk 4,5,6. Deze studies hielpen bij het ontdekken van meerdere stroomgevoelige genen en microRNA's waarvan de rol in endotheelbiologie en atherosclerose uitgebreid werd onderzocht 4,6,7.
Ondanks endotheelverrijking konden deze bulk RNA/ DNA-studies echter niet de specifieke rol van elk celtype in de slagaderwand onderscheiden bij d-flow-geïnduceerde atherosclerose. Endotheelverrijkte eencellige (sc) isolatie en scRNA- en scATAC-sequencingstudies werden uitgevoerd om deze beperking te overwinnen8. Hiervoor werden C57Bl6-muizen onderworpen aan de PCL-operatie om d-flow in de LCA te induceren terwijl de s-flow-blootgestelde RCA als controle werd gebruikt. Twee dagen of twee weken na de PCL-operatie werden de muizen geofferd en werden de halsslagaders ontleed en opgeruimd. Het lumen van zowel LCA's als RCA's werd doordrenkt met collagenase en de luminale collagenase-digesten die EC's bevatten als een significante fractie en andere arteriële cellen werden verzameld. De single-cell suspension (scRNAseq) of single-nuclei suspensie (scATACseq) werden voorbereid en voorzien van barcodes met unieke identifiers voor elke cel of kern met behulp van een 10x Genomics setup. De RNA's werden onderworpen aan cDNA-bibliotheekvoorbereiding en gesequenced.
De scRNAseq en scATACseq datasets werden verwerkt met behulp van de Cell Ranger Single-Cell Software en verder geanalyseerd door Seurat en Signac R pakketten 9,10. Elke cel en kern kreeg een celtype toegewezen uit deze analyses en geclusterd in het celtype op basis van de markergenen en unieke genexpressiepatronen. De resultaten van de scRNAseq en scATACseq toonden aan dat deze eencellige preparaten verrijkt zijn met EC's en ook gladde spiercellen (SMC's), fibroblasten en immuuncellen bevatten.
Verdere analyse toonde aan dat de EG-populatie in de luminale vertering zeer divergent en plastisch is (8 verschillende EC-clusters) en reageert op de bloedstroom. Het belangrijkste is dat deze resultaten aantoonden dat d-flow EC's herprogrammeert van een athero-beschermd ontstekingsremmend fenotype naar pro-atherogene fenotypen, waaronder pro-inflammatoire, endotheel-naar-mesenchymale overgang, endotheelstam / voorlopercelovergang en het meest verrassend, endotheel-naar-immuuncelachtige overgang. Bovendien onthullen scATACseq-gegevens nieuwe stroomafhankelijke chromatinetoegankelijkheidsveranderingen en transcriptiefactorbindingsplaatsen op een genoombrede manier, die de basis vormen van verschillende nieuwe hypothesen. De methodologie en het protocol voor het voorbereiden van enkelvoudige endotheelcellen voor eencellige multi-omics-studies van de muiscarotisslagaders worden hieronder beschreven.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (Cell Culture Grade)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21040CMX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022-43-108-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile</td>
			<td>Fablab</td>
			<td>FL4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL SuperClear Centrifuge Tubes</td>
			<td>Labcon</td>
			<td>3191-335-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk Suture Sterile</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>s-1172 c2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged</td>
			<td>Thermo Fisher Scientic</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase solution,sterile-filtered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000123/ 2000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>RXBUPRENOR5-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Controller &#38; Next GEM Accessory Kit</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#39; Reagent Kits v3.1</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2100502.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D141-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co</td>
			<td>RS-5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase1</td>
			<td>New England Biolabs Inc</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Benchtop-Model # 5425)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620444230VR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium Select</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed Angle Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>FA-45-24-11-Kit Rotor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffered saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>51558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson vet</td>
			<td>789 313 89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACs Smart Strainers (30 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (100 &#181;m)</td>
			<td>&#160;Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline (0.9% sodium chloride)</td>
			<td>Baxter International Inc</td>
			<td>2B1323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei Buffer (20x)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN 2000153/2000207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientic</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co</td>
			<td>RS-5675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-5480</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Mend II</td>
			<td>Webster Veteinanry</td>
			<td>07-856-7946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II Collagenase</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>2100502.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deposited Data</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scATACseq FastQ files</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scRNAseq FastQ files</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Ranger 3.1.0</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cicero</td>
			<td>Pliner et al., 2018</td>
			<td>https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ggplot2 v3.2.1</td>
			<td>Hadley Wickham</td>
			<td>https://cran.r-project.org</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony</td>
			<td>Korsunsky et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/immunogenomics/harmony</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Schneider et al., 2012</td>
			<td>https://imagej.nih.gov</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocle 2.8.0</td>
			<td>Qiu et al., 2017</td>
			<td>https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 3.6.2</td>
			<td>R Foundation</td>
			<td>https://www.r-project.org</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seurat 3.1.3</td>
			<td>Stuart et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/satijalab/seurat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signac 0.2.5</td>
			<td>Stuart et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/timoast/signac</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments

Atherosclerose is een ontstekingsziekte van de arteriële gebieden die worden blootgesteld aan een verstoorde bloedstroom (d-flow). D-flow reguleert de expressie van genen in het endotheel op transcriptomisch en epigenomisch niveau, wat resulteert in proatherogene responsen. Onlangs werden single-cell RNA sequencing (scRNAseq) en single-cell Assay for Transposase Accessible Chromatin sequencing (scATACseq) studies uitgevoerd om de transcriptomische en chromatine toegankelijkheidsveranderingen te bepalen bij een single-cell resolutie met behulp van het muis partiële carotis ligatie (PCL) model. Aangezien endotheelcellen (EC's) een klein deel van de totale celpopulaties in de slagaderwand vertegenwoordigen, werd een luminale verteringsmethode gebruikt om EC-verrijkte eencellige preparaten te verkrijgen. Voor deze studie werden muizen onderworpen aan PCL-chirurgie om d-flow in de linker halsslagader (LCA) te induceren terwijl de rechter halsslagader (RCA) als controle werd gebruikt. De halsslagaders werden twee dagen of twee weken na de PCL-operatie ontleed. Het lumen van elke halsslagader werd onderworpen aan collagenasevertering en endotheelverrijkte enkele cellen of enkele kernen werden verkregen. Deze eencellige en eenkernige preparaten werden vervolgens gecodeerd met behulp van een 10x Genomics microfluïdische opstelling. De single-cells en single-nuclei met streepjescode werden vervolgens gebruikt voor RNA-voorbereiding, bibliotheekgeneratie en sequencing op een HIGH-throughput DNA-sequencer. Na de verwerking van bioinformatica identificeerden de datasets scRNAseq en scATACseq verschillende celtypen uit de luminale vertering, voornamelijk bestaande uit EC's. Gladde spiercellen, fibroblasten en immuuncellen waren ook aanwezig. Deze EC-verrijkingsmethode hielp bij het begrijpen van het effect van de bloedstroom op het endotheel, wat moeilijk had kunnen zijn met de totale slagaderverteringsmethode. De EC-verrijkte eencellige bereidingsmethode kan worden gebruikt om eencellige omics-studies uit te voeren bij EC-knock-outs en transgene muizen waarbij het effect van de bloedstroom op deze genen niet is bestudeerd. Belangrijk is dat deze techniek kan worden aangepast om EC-verrijkte enkele cellen te isoleren van menselijke arterie-explantaten om vergelijkbare mechanistische studies uit te voeren.

Gedeeltelijke carotisligatieoperaties werden uitgevoerd op 44 muizen en het begin van d-flow in de LCA werd gevalideerd door echografie uit te voeren een dag na gedeeltelijke ligatiechirurgie. Succesvolle gedeeltelijke ligatiechirurgie veroorzaakt een verminderde bloedstroomsnelheid en keert de bloedstroom (verstoorde stroom) in de LCA3 om. De halsslagaders werden ontleden na twee dagen of twee weken na ligatie. Het lumen van elke halsslagader werd onderworpen aan collagenasevertering en ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments at JoVE.com

Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments

We presenteren een methode voor het isoleren van endotheelcellen en kernen uit het lumen van muiscarotisslagaders die zijn blootgesteld aan stabiele of verstoorde stroomomstandigheden om eencellige omics-experimenten uit te voeren.

Isolatie van endotheelcellen uit het lumen van muisslagaders voor eencellige multi-omics-experimenten

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in ...

In een bloedvat is het aantal endotheelcellen erg laag, waardoor het moeilijk is om ze te bestuderen. Ons protocol elimineert deze beperking en stelt ons in staat om nieuwe moleculaire routes en therapeutica te bestuderen. Ons protocol stelt ons in staat om endotheelverrijkte monsters te verkrijgen en te bestuderen hoe acute en chronisch verstoorde stroom dit celtype beïnvloedt.Het vermogen om endotheelcellen in meer detail te bestuderen, maakt het mogelijk om doelgenen te definiëren, en dus potentiële therapieën voor atherosclerose gericht op endotheelcellen. Isolatie van de halsslagader is lastig en vereist geduld en ervaring. Bereid het dier om te beginnen voor door 0,05 milligram per kilogram buprenorfine subcutaan te injecteren.Steriliseer het geëpileerde gebied met betadine en isopropanoloplossing driemaal. Maak een ventrale middenlijnincisie van ongeveer een centimeter in het nekgebied. Leg vervolgens het LCA-vertakkingspunt bloot door stompe dissectie.Ligaat de linker interne halsslagader, externe halsslagader en occipitale slagaders met 6-0 hechtingen, waardoor de superieure schildklierslagader onaangeroerd blijft. Sluit de incisie met weefsellijm of hechtingen. Breng de muis over naar een voorverwarmde herstelkooi die op 37 graden Celsius wordt gehouden.Plaats de muis maximaal een uur op een schone handdoek om onderkoeling na de operatie te voorkomen. Steek een naald van 21 gauge in de infuuslijn die via de top van het hart in de linker ventrikel is aangesloten. Laat retrograde perfusie twee tot drie minuten toe met behulp van een normale zoutoplossing bij kamertemperatuur.Zorg voor een constant debiet door een constante druk uit te oefenen tijdens het injecteren of gebruiken van een infuuslijn en de zoutzak op een hoogte van acht tot negen voet te houden. Verwijder de huid uit het nekgebied met al het vet, spieren en bindweefsel om de halsslagaders bloot te leggen. Verwijder vervolgens de periadventitiale weefsels rond de halsslagaders en laat de halsslagader aan het lichaam vastzitten.Maak een incisie onder de ligatieplaats in de LCA om perfusie mogelijk te maken. Perfuseer de LCA nog een minuut door de linker ventrikel om eventuele bloedsporen te verwijderen. Was de buitenkant van de halsslagaders met een normale zoutoplossing om eventuele bloedsporen te verwijderen.Gebruik een insulinespuit met een naald van 29 gauge om 50 microliter digestiebuffer in het lumen van het distale uiteinde van de linker halsslagader te injecteren. Gebruik een microclip om het proximale uiteinde van de halsslagader gevuld met de digestiebuffer te klemmen. Voeg 15 tot 20 microliter digestiebuffer toe aan het lumen en klem het distale uiteinde om te voorkomen dat de spijsverteringsbuffer vrijkomt.Breng de halsslagaders van de muis over in schotels van 35 millimeter met warme 37 graden Celsius HEPES Gebufferde Zoutoplossing. En incubeer ze gedurende 45 minuten bij 37 graden Celsius met intermitterend schommelen. Verwijder de halsslagader met de klemmen uit de schaal van 35 millimeter nadat de luminale enzymatische vertering is voltooid.Maak de klemmen voorzichtig los, zodat de digestiebuffer niet lekt. Houd het ene uiteinde van de halsslagader bovenop een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg 100 microliter warme verteringsbuffer toe aan het lumen door een naald van 29 gauge in te brengen die is uitgerust met een insulinespuit.Spoel snel het lumen van de halsslagader in de microcentrifugebuis en voeg vervolgens 0,3 microliter FBS toe aan de buis om de reactie te stoppen. Plaats de microcentrifugebuis op ijs. Centrifugeer de cellen op 500 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius, met behulp van een centrifuge uitgerust met een rotor met vaste hoek en gooi het supernatant weg.Suspensieer de cellen opnieuw in de digestiebuffer, die celdissociatiereagens bevat, en incubeer ze gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius om ze in afzonderlijke cellen te scheiden. Blokkeer de enzymatische reactie door 0,15 milliliter FBS toe te voegen aan de buis van 0,5 milliliter en herhaal de centrifugatie. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de cellen in 100 microliter ijskoude 1% BSA-oplossing in PBS in een microcentrifugebuis van 0,2 milliliter.Voor eencellige analyse resuspendeert u de pellet met 100 microliter ijskoude 1% BSA in PBS in een buis van 0,2 milliliter. Voor analyse van één kern resuspenseert u de celpellet in 100 microliter van 0,04% BSA in ijskoude PBS en centrifugeert u de suspensie van één cel bij 500 G bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Ontleed de eencellige suspensie met ijskoude lysisbuffer en incubeer gedurende vijf minuten op ijs.Meng het lysaat met een P20-pipet en incubeer nog eens 10 minuten. Breng daarna het lysaat over in een buis van 0,5 milliliter. Was de ly-cellen met 500 microliter buffer en meng ze met een pipet.Herhaal vervolgens de centrifugatie. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de kernkorrel in 150 microliter van de verdunde kernenbuffer. Tel de enkele kernpreparaten met behulp van een hemocytometer.Na de single nuclei sequencing studie werden single cell en single nuclei verkregen en gevisualiseerd door bright-field en fasecontrast microscopie. De efficiëntie van een enkelkernpreparaat uit de eencellige suspensie werd ook aangetoond. Na de single cell RNA sequencing studie werden verschillende parameters verkregen, zoals de verdeling van genen per cel, unieke moleculaire identificatie per cel, mitochondriale reads per cel en sequencing saturatiegegevens.Voor de single cell ATAC sequence studie werd de insert size distribution, inclusief het nucleosoom banding patroon waargenomen. De genormaliseerde TSS-verrijkingsscore werd ook waargenomen. Daarnaast leest het procentenfragment in de pieken.Piekgebiedfragmenten, TSS-verrijkingsscore, verhouding van reads in de zwarte lijst genomische sites en nucleosoomsignaalverhouding werden bepaald. De enzymatische spijsvertering is een stress voor de cellen, daarom is het cruciaal om de monsters op ijs te houden en de procedure zo snel mogelijk uit te voeren. We kunnen deze methode gebruiken om endotheelcellen van muizen te verkrijgen en te platen.We kunnen deze techniek ook gebruiken om bulkstudies op Basis van Omix uit te voeren. Deze techniek maakte de weg vrij voor het bestuderen van het effect van verstoorde bloedstroom op endotheelcellen in vivo op een enkele cel manier.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Isolatie van Valvulaire endotheelcellen

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Isolatie van het netvlies stamcellen van de muis Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Isolatie en Cultuur van Pulmonary endotheelcellen van neonatale muizen

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generatie van Muizen Afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

Isolatie van microvasculaire endotheelcellen Buizen van Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolatie van Murine Valve endotheelcellen

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolatie en Primaire Cultuur van de muis endotheelcellen

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Isolatie van muis coronaire endotheelcellen

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Isolatie en karakterisering van primaire leverbijholteelcellen van muizen

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

Isolatie van voorwaardelijk vereeuwigde glomerulaire endotheelcellen van de muis met fluorescerende mitochondriën

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...