Name: isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments
Uploaded: 2021-10-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Mittel der National Institutes of Health-Zuschüsse HL119798, HL095070 und HL139757 an HJ unterstützt. HJ wird auch von der Wallace H. Coulter Distinguished Faculty Chair Professorship unterstützt. Die Dienstleistungen des Emory Integrated Genomics Core (EIGC) wurden von der Emory University School of Medicine subventioniert und teilweise auch von der Georgia Clinical and Translational Science Alliance der National Institutes of Health unter der Award-Nr. UL1TR002378. Der oben bereitgestellte Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und spiegelt nicht die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health wider.

Alle unten beschriebenen Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Emory University genehmigt. Nicht-hypercholesterinämische, alters- und geschlechtsangepasste C57BL/6-Mäuse wurden verwendet, um geschlechtsabhängige Variationen zu mildern und Komplikationen hypercholesterinämischer Zustände auszugleichen.
1. Partielle Karotisligatur (PCL)
HINWEIS: Die partielle Karotis-Ligatur der LCA wurde wie zuvor beschrieben und demonstriert<sup...

<ol>
	<li>Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+atherosclerosis+development+in+C57Bl6+mice+by+overexpressing+AAV-mediated+PCSK9+and+partial+carotid+ligation.">Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation.</a> Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).</li><li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+carotid+ligation+is+a+model+of+acutely+induced+disturbed+flow,+leading+to+rapid+endothelial+dysfunction+and+atherosclerosis.">Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).</li><li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+disturbed+flow-induced+atherosclerosis+in+mouse+carotid+artery+by+partial+ligation+and+a+simple+method+of+RNA+isolation+from+carotid+endothelium.">A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861 (2010).</li><li>Dunn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-dependent+epigenetic+DNA+methylation+regulates+endothelial+gene+expression+and+atherosclerosis.">Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).</li><li>Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-dependent+regulation+of+genome-wide+mRNA+and+microRNA+expression+in+endothelial+cells+in+vivo.">Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo.</a> Scientific Data. 1 (1), 140039 (2014).</li><li>Ni, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+novel+mechanosensitive+genes+in+vivo+using+mouse+carotid+artery+endothelium+exposed+to+disturbed+flow.">Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow.</a> Blood. 116 (15), 66-73 (2010).</li><li>Son, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atypical+mechanosensitive+microRNA-712+derived+from+pre-ribosomal+RNA+induces+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis.">The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Communications. 4, 3000 (2013).</li><li>Andueza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+reprogramming+by+disturbed+flow+revealed+by+single-cell+RNA+and+chromatin+accessibility+study.">Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study.</a> Cell Reports. 33 (11), 108491 (2020).</li><li>Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+single-cell+chromatin+analysis+with+Signac.">Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+integration+of+single-cell+data.">Comprehensive integration of single-cell data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li><li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cell+death+by+trypan+blue+uptake+and+light+microscopy.">Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+cellular+heterogeneity+of+mouse+carotid+artery+under+disturbed+flow.">Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow.</a> Cell Death and Discovery. 7 (1), 180 (2021).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+activated+cell+populations+using+single-cell+RNA-seq.">Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li><li>O'Flanagan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+solid+tumor+tissues+with+cold+active+protease+for+single-cell+RNA-seq+minimizes+conserved+collagenase-associated+stress+responses.">Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.</a> Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).</li></ol>

Dieses Papier enthält ein detailliertes Protokoll zur Isolierung von Einzelzellpräparaten aus den Halsschlagadern der Maus. Der Einfluss von d-flow auf die Endothelzellen kann genau untersucht werden, wenn die PCL-Operation korrekt durchgeführt wird. Es ist wichtig, die Äste der gewöhnlichen Halsschlagader, wie die äußere Halsschlagader, die innere Halsschlagader, die Okzipitalarterie und die Arteria thyroidea superior, korrekt zu identifizieren. Die Validierung von Strömungsmustern durch Ultraschall val...

Dieses Labor zeigte zuvor, dass die Induktion von d-flow zu einer schnellen und robusten Atheroskleroseentwicklung bei hyperlipidämischen Mäusen führt 1,2. Das neuartige Mausmodell der d-Flow-induzierten Atherosklerose wurde mittels partieller Carotisligatur (PCL) möglich 3. Die PCL-Chirurgie induziert einen niedrigen und oszillatorischen Blutfluss oder D-Fluss in der ligierten linken Halsschlagader (LCA). Im Gegensatz dazu ist die kontralaterale rechte Halsschlagader (RCA) weiterhin einer stabilen laminaren Strömung (s-flow) ausgesetzt. Um die Wirkung des d-Flusses auf Endothelzellen zu verstehen, wurden die Halsschlagadern nach einer partiellen Ligaturoperation seziert und mit einem auf Phenol- und Guanidinisothiocyanat basierenden Lysemittel (luminale RNA/DNA-Spülmethode)2,4 gespült, das endothelial angereicherte "gepoolte Bulk"-RNAs oder DNAs lieferte. Diese gepoolten Bulk-RNAs oder DNAs wurden dann für transkriptomische Studien oder epigenomische DNA-Methylom-Studien bzw. 4,5,6 verarbeitet. Diese Studien halfen, mehrere flussempfindliche Gene und microRNAs zu entdecken, deren Rolle in der Endothelbiologie und Atherosklerose umfassend untersucht wurde 4,6,7.
Trotz der endothelialen Anreicherung konnten diese RNA/DNA-Massenstudien jedoch nicht die spezifische Rolle jedes Zelltyps in der Arterienwand bei d-flow-induzierter Atherosklerose unterscheiden. Umdiese Einschränkung zu überwinden, wurden endothelial angereicherte Einzelzellisolierungen (sc) sowie scRNA- und scATAC-Sequenzierungsstudien durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden C57Bl6-Mäuse der PCL-Operation unterzogen, um einen d-Flow in der LCA zu induzieren, während die s-flow-exponierte RCA als Kontrolle verwendet wurde. Zwei Tage oder zwei Wochen nach der PCL-Operation wurden die Mäuse geopfert und die Halsschlagader seziert und gereinigt. Das Lumen sowohl von LCAs als auch von RCAs wurde mit Kollagenase infundiert, und die luminalen Kollagenase-Verdauungen, die ECs als signifikante Fraktion enthielten, und andere arterielle Zellen wurden gesammelt. Die Einzelzellsuspension (scRNAseq) oder Einzelkernsuspension (scATACseq) wurde hergestellt und mit eindeutigen Identifikatoren für jede Zelle oder jeden Kern unter Verwendung eines 10-fachen Genomics-Setups versehen. Die RNAs wurden einer cDNA-Bibliotheksvorbereitung unterzogen und sequenziert.
Die Datensätze scRNAseq und scATACseq wurden mit der Cell Ranger Single-Cell Software verarbeitet und von den Seurat und Signac R Paketen 9,10 weiter analysiert. Jeder Zelle und jedem Zellkern wurde aus diesen Analysen ein Zelltyp zugeordnet und basierend auf den Markergenen und einzigartigen Genexpressionsmustern in den Zelltyp gruppiert. Die Ergebnisse der scRNAseq und scATACseq zeigten, dass diese Einzelzellpräparate mit ECs angereichert sind und auch glatte Muskelzellen (SMCs), Fibroblasten und Immunzellen enthalten.
Weitere Analysen ergaben, dass die EC-Population in der luminalen Verdauung sehr divergent und plastisch (8 verschiedene EC-Cluster) ist und auf den Blutfluss reagiert. Am wichtigsten ist, dass diese Ergebnisse zeigten, dass d-flow ECs von einem athero-geschützten entzündungshemmenden Phänotyp zu pro-atherogenen Phänotypen umprogrammiert, einschließlich entzündungsförderndem, endothelialem zu mesenchymalem Übergang, endothelialem Stamm / Vorläuferzellübergang und überraschenderweise endothelial-zu-immunzellähnlichem Übergang. Darüber hinaus zeigen scATACseq-Daten genomweit neuartige flussabhängige Chromatin-Zugänglichkeitsänderungen und Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen, die die Grundlage für mehrere neue Hypothesen bilden. Die Methodik und das Protokoll zur Vorbereitung einzelner Endothelzellen für Einzelzell-Multi-Omics-Studien aus den Halsschlagadern der Maus sind unten aufgeführt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (Cell Culture Grade)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21040CMX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022-43-108-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile</td>
			<td>Fablab</td>
			<td>FL4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL SuperClear Centrifuge Tubes</td>
			<td>Labcon</td>
			<td>3191-335-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk Suture Sterile</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>s-1172 c2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged</td>
			<td>Thermo Fisher Scientic</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase solution,sterile-filtered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000123/ 2000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>RXBUPRENOR5-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Controller &#38; Next GEM Accessory Kit</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#39; Reagent Kits v3.1</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2100502.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D141-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co</td>
			<td>RS-5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase1</td>
			<td>New England Biolabs Inc</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Benchtop-Model # 5425)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620444230VR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium Select</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed Angle Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>FA-45-24-11-Kit Rotor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffered saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>51558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson vet</td>
			<td>789 313 89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACs Smart Strainers (30 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (100 &#181;m)</td>
			<td>&#160;Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline (0.9% sodium chloride)</td>
			<td>Baxter International Inc</td>
			<td>2B1323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei Buffer (20x)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN 2000153/2000207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientic</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co</td>
			<td>RS-5675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-5480</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Mend II</td>
			<td>Webster Veteinanry</td>
			<td>07-856-7946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II Collagenase</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>2100502.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deposited Data</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scATACseq FastQ files</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scRNAseq FastQ files</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Ranger 3.1.0</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cicero</td>
			<td>Pliner et al., 2018</td>
			<td>https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ggplot2 v3.2.1</td>
			<td>Hadley Wickham</td>
			<td>https://cran.r-project.org</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony</td>
			<td>Korsunsky et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/immunogenomics/harmony</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Schneider et al., 2012</td>
			<td>https://imagej.nih.gov</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocle 2.8.0</td>
			<td>Qiu et al., 2017</td>
			<td>https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 3.6.2</td>
			<td>R Foundation</td>
			<td>https://www.r-project.org</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seurat 3.1.3</td>
			<td>Stuart et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/satijalab/seurat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signac 0.2.5</td>
			<td>Stuart et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/timoast/signac</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments

Atherosklerose ist eine entzündliche Erkrankung der arteriellen Regionen, die einem gestörten Blutfluss (D-Flow) ausgesetzt sind. D-flow reguliert die Expression von Genen im Endothel auf transkriptomischer und epigenomischer Ebene, was zu proatherogenen Reaktionen führt. Vor kurzem wurden Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNAseq) und Einzelzell-Assay für Transposase Accessible Chromatin Sequencing (scATACseq) Studien durchgeführt, um die transkriptomischen und chromatin-Zugänglichkeitsänderungen bei einer Einzelzellauflösung unter Verwendung des Maus-PCL-Modells (Partial Carotisligation) zu bestimmen. Da Endothelzellen (ECs) nur einen geringen Teil der gesamten Zellpopulationen in der Arterienwand ausmachen, wurde eine luminale Verdauungsmethode verwendet, um EC-angereicherte Einzelzellpräparate zu erhalten. Für diese Studie wurden Mäuse einer PCL-Operation unterzogen, um einen d-Fluss in der linken Halsschlagader (LCA) zu induzieren, während die rechte Halsschlagader (RCA) als Kontrolle verwendet wurde. Die Halsschlagadern wurden zwei Tage oder zwei Wochen nach der PCL-Operation seziert. Das Lumen jeder Halsschlagader wurde einer Kollagenase-Verdauung unterzogen, und endothelial angereicherte Einzelzellen oder einzelne Kerne wurden erhalten. Diese Einzelzell- und Einzelkernpräparate wurden anschließend mit einem 10-fachen mikrofluidischen Aufbau von Genomics mit einem Barcode versehen. Die mit Barcodes versehenen Einzelzellen und Einzelkerne wurden dann für die RNA-Vorbereitung, Bibliotheksgenerierung und Sequenzierung auf einem Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierer verwendet. Nach der bioinformatischen Verarbeitung identifizierten die Datensätze scRNAseq und scATACseq verschiedene Zelltypen aus dem luminalen Aufschluss, die hauptsächlich aus ECs bestanden. Glatte Muskelzellen, Fibroblasten und Immunzellen waren ebenfalls vorhanden. Diese EC-Anreicherungsmethode half dabei, die Wirkung des Blutflusses auf das Endothel zu verstehen, was mit der Methode der Gesamtarterienverdauung schwierig gewesen sein könnte. Die EC-angereicherte Einzelzellpräparationsmethode kann verwendet werden, um Einzelzell-Omics-Studien an EC-Knockouts und transgenen Mäusen durchzuführen, bei denen die Wirkung des Blutflusses auf diese Gene nicht untersucht wurde. Wichtig ist, dass diese Technik angepasst werden kann, um EC-angereicherte Einzelzellen aus menschlichen Arterienexplantaten zu isolieren, um ähnliche mechanistische Studien durchzuführen.

Partielle Carotis-Ligaturoperationen wurden an 44 Mäusen durchgeführt, und der Beginn des d-Flows in der LCA wurde durch Ultraschall einen Tag nach der partiellen Ligatur validiert. Eine erfolgreiche partielle Ligatur bewirkt eine verminderte Durchblutungsgeschwindigkeit und kehrt den Blutfluss (gestörter Fluss) in der LCA3 um. Die Halsschlagadern wurden entweder zwei Tage oder zwei Wochen nach der Ligatur präpariert. Das Lumen jeder Halsschlagader wurde einer Kollagenase-Verdauung un...

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Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments

Wir stellen eine Methode zur Isolierung von Endothelzellen und -kernen aus dem Lumen von Maus-Halsschlagadern vor, die stabilen oder gestörten Strömungsbedingungen ausgesetzt sind, um Einzelzell-Omics-Experimente durchzuführen.

Isolierung von Endothelzellen aus dem Lumen von Maus-Halsschlagadern für Einzelzell-Multi-Omics-Experimente

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in ...

In einem Blutgefäß ist die Anzahl der Endothelzellen sehr gering, was es schwierig macht, sie zu untersuchen. Unser Protokoll beseitigt diese Einschränkung und ermöglicht es uns, neuartige molekulare Wege und Therapeutika zu untersuchen. Unser Protokoll ermöglicht es uns, endothelial angereicherte Proben zu erhalten und zu untersuchen, wie akute und chronische Flussstörungen diesen Zelltyp beeinflussen.Die Fähigkeit, Endothelzellen genauer zu untersuchen, ermöglicht es, Zielgene und damit potenzielle Therapeutika für Atherosklerose zu definieren, die auf Endothelzellen abzielen. Die Isolierung der Halsschlagader ist schwierig und erfordert Geduld und Erfahrung. Um zu beginnen, bereiten Sie das Tier vor, indem Sie 0,05 Milligramm pro Kilogramm Buprenorphin subkutan injizieren.Sterilisieren Sie den epilierten Bereich dreimal mit Betadine und Isopropanollösung. Machen Sie einen ventralen Mittellinienschnitt von etwa einem Zentimeter im Halsbereich. Belichten Sie dann den LCA-Zweigpunkt durch stumpfe Dissektion.Ligieren Sie die linke innere Halsschlagader, die äußere Halsschlagader und die Hinterhauptsarterien mit 6-0 Nähten, wobei die obere Schilddrüsenarterie unberührt bleibt. Verschließen Sie den Schnitt mit Gewebekleber oder Nähten. Bringen Sie die Maus in einen vorgewärmten Erholungskäfig, der bei 37 Grad Celsius gehalten wird.Legen Sie die Maus bis zu einer Stunde lang auf ein sauberes Handtuch, um eine Unterkühlung nach der Operation zu vermeiden. Führen Sie eine 21-Gauge-Nadel in die IV-Linie ein, die durch die Herzspitze mit dem linken Ventrikel verbunden ist. Lassen Sie die retrograde Perfusion für zwei bis drei Minuten mit normaler Kochsalzlösung bei Raumtemperatur zu.Halten Sie eine konstante Durchflussrate aufrecht, indem Sie während der Injektion oder Verwendung einer IV-Leitung einen gleichmäßigen Druck ausüben und den Kochsalzbeutel in einer Höhe von acht bis neun Fuß halten. Entfernen Sie die Haut aus der Halsregion mit allem Fett, Muskeln und Bindegewebe, um die Halsschlagadern freizulegen. Entfernen Sie dann das periadventitiale Gewebe um die Halsschlagader herum, so dass die Halsschlagader am Körper befestigt bleibt.Machen Sie einen Schnitt unterhalb der Ligaturstelle in der LCA, um die Durchblutung zu ermöglichen. Durchbluten Sie die LCA durch den linken Ventrikel für eine weitere Minute, um Blutspuren zu entfernen. Waschen Sie die Außenseite der Halsschlagadern mit normaler Kochsalzlösung, um Blutspuren zu entfernen.Verwenden Sie eine Insulinspritze mit einer 29-Gauge-Nadel, um 50 Mikroliter Verdauungspuffer in das Lumen des distalen Endes der linken Halsschlagader zu injizieren. Verwenden Sie einen Mikroclip, um das proximale Ende der Halsschlagader mit Verdauungspuffer gefüllt zu klemmen. Fügen Sie 15 bis 20 Mikroliter Verdauungspuffer in das Lumen hinzu und schneiden Sie das distale Ende ab, um eine Freisetzung von Verdauungspuffer zu vermeiden.Übertragen Sie die Halsschlagadern von der Maus in 35-Millimeter-Schalen mit warmer 37 Grad Celsius HEPES-gepufferter Kochsalzlösung. Und brütet sie für 45 Minuten bei 37 Grad Celsius mit intermittierendem Schaukeln. Entfernen Sie die Halsschlagader mit den Klemmen aus der 35-Millimeter-Schale, nachdem die luminale enzymatische Verdauung abgeschlossen ist.Lösen Sie die Klemmen vorsichtig, damit der Verdauungspuffer nicht ausläuft. Halten Sie ein Ende der Halsschlagader auf ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie dem Lumen 100 Mikroliter warmen Verdauungspuffer hinzu, indem Sie eine 29-Gauge-Nadel einführen, die mit einer Insulinspritze ausgestattet ist.Spülen Sie schnell das Lumen der Halsschlagader in der Mikrozentrifugenröhre und fügen Sie dann 0,3 Mikroliter FBS in das Röhrchen hinzu, um die Reaktion zu stoppen. Legen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius mit einer Zentrifuge mit einem Rotor mit festem Winkel und verwerfen Sie den Überstand.Suspendieren Sie die Zellen im Verdauungspuffer, der ein Zelldissoziationsreagenz enthält, und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um sie in einzelne Zellen zu trennen. Blockieren Sie die enzymatische Reaktion, indem Sie 0,15 Milliliter FBS in das 0,5-Milliliter-Röhrchen geben und die Zentrifugation wiederholen. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern eiskalter 1% BSA-Lösung in PBS in einem 0,2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.Für die Einzelzellanalyse resuspendieren Sie das Pellet mit 100 Mikrolitern eiskaltem 1% BSA in PBS in einem 0,2-Milliliter-Röhrchen. Für die Einzelkernanalyse resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 Mikrolitern 0,04% BSA in eiskaltem PBS und zentrifugieren Sie die Einzelzellsuspension bei 500 g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Die Einzelzellsuspension mit eiskaltem Lysepuffer zersetzen und fünf Minuten auf Eis inkubieren.Mischen Sie das Lysat mit einer P20-Pipette und inkubieren Sie weitere 10 Minuten. Anschließend wird das Lysat in ein 0,5-Milliliter-Röhrchen überführt. Waschen Sie die Ly-Zellen mit 500 Mikrolitern Puffer und mischen Sie sie mit einer Pipette.Wiederholen Sie dann die Zentrifugation. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Kernpellet in 150 Mikrolitern des verdünnten Kernpuffers. Zählen Sie die Einzelkernpräparate mit einem Hämozytometer.Im Anschluss an die Einzelkernsequenzierungsstudie wurden Einzelzell- und Einzelkerne erhalten und mittels Hellfeld- und Phasenkontrastmikroskopie visualisiert. Die Wirksamkeit der Einzelkernpräparation aus der Einzelzellsuspension wurde ebenfalls nachgewiesen. Nach der Einzelzell-RNA-Sequenzierungsstudie wurden verschiedene Parameter wie die Verteilung von Genen pro Zelle, eindeutiger molekularer Identifikator pro Zelle, mitochondriale Messwerte pro Zelle und Sequenzierungssättigungsdaten erhalten.Für die Einzelzell-ATAC-Sequenzstudie wurde die Insertgrößenverteilung einschließlich des Nukleosomenbandenmusters beobachtet. Der normalisierte TSS-Anreicherungswert wurde ebenfalls beobachtet. Darüber hinaus liest das prozentuale Fragment in den Spitzenwerten.Die Fragmente der Spitzenregion, der TSS-Anreicherungswert, das Verhältnis der Lesevorgänge in den genomischen Stellen der Blacklist und das Nukleosomensignalverhältnis wurden bestimmt. Der enzymatische Aufschluss ist eine Belastung für die Zellen, daher ist es wichtig, die Proben auf Eis zu halten und das Verfahren so schnell wie möglich durchzuführen. Wir können diese Methode verwenden, um Endothelzellen aus Mäusen zu gewinnen und zu platten.Wir können diese Technik auch verwenden, um Omix-basierte Massenstudien durchzuführen. Diese Technik ebnete den Weg, um die Wirkung eines gestörten Blutflusses auf Endothelzellen in vivo in einer einzigen Zellweise zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Isolierung von Valvular Endothelzellen

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Forschung

Biologie

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Isolierung von Retinal Stammzellen aus der Maus Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Isolierung und Kultivierung von pulmonaler Endothelzellen aus neugeborenen Mäusen

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

Microvascular Endothelial Isolierung von Rohren aus Maus Widerstand Arterien

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolierung von murinen Ventil Endothelzellen

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Isolierung von Maus-Koronar-Endothelzellen

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Isolierung und Charakterisierung von primären Leber-Sinus-Endothelzellen der Maus

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

Isolierung von bedingt immortalisierten glomerulären Maus-Endothelzellen mit fluoreszierenden Mitochondrien

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...