Name: isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments
Uploaded: 2021-10-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מימון מהמכונים הלאומיים לבריאות מענקים HL119798, HL095070 ו- HL139757 ל- HJ. HJ נתמך גם על ידי פרופסוריית הקתדרה על שם וואלאס ה. קולטר לפקולטה. השירותים הניתנים על ידי ליבת הגנומיקה המשולבת של אמורי (EIGC) סובסדו על ידי בית הספר לרפואה של אוניברסיטת אמורי ונתמכו חלקית גם על ידי הברית המדעית הקלינית והתרגומית של ג'ורג'יה של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר. UL1TR002378. התוכן המובא לעיל הוא באחריות המחברים בלבד ואינו משקף את העמדות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

כל הנהלים המתוארים להלן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אמורי. עכברי C57BL/6 שאינם תואמי היפרכולסטרולמי, תואמי גיל ומין, שימשו כדי למתן שונות תלוית מין ולקזז כל סיבוך של מצבים היפרכולסטרולמיים.
1. ניתוח קשירת קרוטיד חלקית (PCL)
הערה:...

<ol>
	<li>Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+atherosclerosis+development+in+C57Bl6+mice+by+overexpressing+AAV-mediated+PCSK9+and+partial+carotid+ligation.">Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation.</a> Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).</li><li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+carotid+ligation+is+a+model+of+acutely+induced+disturbed+flow,+leading+to+rapid+endothelial+dysfunction+and+atherosclerosis.">Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).</li><li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+disturbed+flow-induced+atherosclerosis+in+mouse+carotid+artery+by+partial+ligation+and+a+simple+method+of+RNA+isolation+from+carotid+endothelium.">A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861 (2010).</li><li>Dunn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-dependent+epigenetic+DNA+methylation+regulates+endothelial+gene+expression+and+atherosclerosis.">Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).</li><li>Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-dependent+regulation+of+genome-wide+mRNA+and+microRNA+expression+in+endothelial+cells+in+vivo.">Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo.</a> Scientific Data. 1 (1), 140039 (2014).</li><li>Ni, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+novel+mechanosensitive+genes+in+vivo+using+mouse+carotid+artery+endothelium+exposed+to+disturbed+flow.">Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow.</a> Blood. 116 (15), 66-73 (2010).</li><li>Son, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atypical+mechanosensitive+microRNA-712+derived+from+pre-ribosomal+RNA+induces+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis.">The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Communications. 4, 3000 (2013).</li><li>Andueza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+reprogramming+by+disturbed+flow+revealed+by+single-cell+RNA+and+chromatin+accessibility+study.">Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study.</a> Cell Reports. 33 (11), 108491 (2020).</li><li>Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+single-cell+chromatin+analysis+with+Signac.">Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+integration+of+single-cell+data.">Comprehensive integration of single-cell data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li><li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cell+death+by+trypan+blue+uptake+and+light+microscopy.">Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+cellular+heterogeneity+of+mouse+carotid+artery+under+disturbed+flow.">Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow.</a> Cell Death and Discovery. 7 (1), 180 (2021).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+activated+cell+populations+using+single-cell+RNA-seq.">Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li><li>O'Flanagan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+solid+tumor+tissues+with+cold+active+protease+for+single-cell+RNA-seq+minimizes+conserved+collagenase-associated+stress+responses.">Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.</a> Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).</li></ol>

מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט לבידוד תכשירים חד-תאיים מעורק הצוואר של העכבר. ניתן לחקור במדויק את השפעת זרימת ה-d על תאי האנדותל אם ניתוח ה-PCL מבוצע כהלכה. חשוב לזהות נכונה את ענפי הצוואר המשותף, כגון הצוואר החיצוני, הצוואר הפנימי, העורק העורפי ועורק בלוטת התריס העליון. אימות דפוסי זרימה ע...

מעבדה זו הראתה בעבר כי אינדוקציה של זרימת d מובילה להתפתחות מהירה ומחוספסת של טרשת עורקים בעכברים היפרליפידמיים 1,2. מודל העכבר החדשני של טרשת עורקים הנגרמת על ידי זרימת d התאפשר באמצעות ניתוח קשירת קרוטיד חלקית (PCL) 3. ניתוח PCL גורם למצב של זרימת דם נמוכה ותנודתית או זרימת d בעורק הצוואר השמאלי הכבול (LCA). לעומת זאת, עורק הצוואר הימני הנגדי (RCA) ממשיך להתמודד עם זרימה למינרית יציבה (s-flow). בעבר, כדי להבין את ההשפעה של זרימת d על תאי האנדותל, עורקי הצוואר נותחו החוצה לאחר ניתוח קשירת חלקי ונשטפו באמצעות חומר ליסינג מבוסס פנול וגואנידין איזותיוציאנט (שיטת שטיפת RNA/DNA לומינלית)2,4, אשר סיפקה RNA מועשר באנדותל "בתפזורת" או DNAs. רנ"א או דנ"א בתפזורת אלה עובדו לאחר מכן למחקרי תעתיק או למחקרי מתילום DNA אפיגנומיים,בהתאמה 4,5,6. מחקרים אלה סייעו לגלות גנים ומיקרו-רנ"א רבים הרגישים לזרימה, שתפקידיהם בביולוגיה של האנדותל ובטרשת עורקים נחקרו בהרחבהב-4,6,7.
עם זאת, למרות העשרת האנדותל, מחקרי RNA/DNA בתפזורת אלה לא הצליחו להבחין בתפקיד הספציפי של כל סוג תא בדופן העורק בטרשת עורקים הנגרמת על ידי זרימת d. בידוד חד-תאי מועשר באנדותל (sc) ומחקרי ריצוף scRNA ו-scATAC בוצעו כדי להתגבר על מגבלה זו8. לשם כך, עכברי C57Bl6 היו נתונים לניתוח PCL כדי לגרום לזרימת d ב-LCA תוך שימוש ב-RCA החשוף ל-s-flow כבקרה. יומיים או שבועיים לאחר ניתוח ה-PCL, העכברים הוקרבו, והקרוטיפים נותחו ונוקו. לומן של LCAs ו- RCAs הוחדר עם קולגןאז, ועיכול הקולגן הלומינלי המכיל ECs כשבריר משמעותי ותאי עורקים אחרים נאספו. ההשעיה החד-תאית (scRNAseq) או ההשעיה החד-גרעינית (scATACseq) הוכנה וברקודה עם מזהים ייחודיים עבור כל תא או גרעין באמצעות מערך גנומיקה 10x. הרנ"א היו נתונים להכנה וריצוף של ספריית cDNA.
מערכי הנתונים scRNAseq ו-scATACseq עובדו באמצעות התוכנה החד-תאית Cell Ranger ונותחו עוד יותר על ידי חבילות Seurat ו-Signac R 9,10. לכל תא וגרעין הוקצה סוג תא מניתוחים אלה והוא הוכנס לסוג התא בהתבסס על הגנים של הסמן ודפוסי ביטוי גנים ייחודיים. התוצאות של ה-scRNAseq וה-scATACseq הראו שהתכשירים החד-תאיים האלה מועשרים ב-ECs ומכילים גם תאי שריר חלק (SMCs), פיברובלסטים ותאי מערכת החיסון.
ניתוח נוסף גילה כי אוכלוסיית ה- EC בעיכול הלומינלי שונה מאוד ופלסטית (8 אשכולות EC שונים) ומגיבה לזרימת הדם. והכי חשוב, התוצאות האלה הראו ש-d-flow מתכנת מחדש את ה-ECs מפנוטיפ אנטי-דלקתי המוגן על-ידי athero לפנוטיפים פרו-אתרוגניים, כולל פרו-דלקתיים, מעבר אנדותל-אל-מזנכימלי, מעבר גזע אנדותל/תא אב, ובאופן מפתיע ביותר, מעבר דמוי אנדותל לתא חיסון. בנוסף, נתוני scATACseq חושפים שינויים חדשניים בנגישות כרומטין תלויי זרימה ואתרי קשירה של גורמי שעתוק באופן כלל-גנומי, המהווים בסיס למספר השערות חדשות. המתודולוגיה והפרוטוקול להכנת תאי אנדותל בודדים למחקרים רב-תאיים חד-תאיים מעוקי הצוואר של העכברים מפורטים להלן.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (Cell Culture Grade)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21040CMX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022-43-108-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile</td>
			<td>Fablab</td>
			<td>FL4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL SuperClear Centrifuge Tubes</td>
			<td>Labcon</td>
			<td>3191-335-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk Suture Sterile</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>s-1172 c2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged</td>
			<td>Thermo Fisher Scientic</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase solution,sterile-filtered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000123/ 2000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>RXBUPRENOR5-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Controller &#38; Next GEM Accessory Kit</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#39; Reagent Kits v3.1</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2100502.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D141-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co</td>
			<td>RS-5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase1</td>
			<td>New England Biolabs Inc</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Benchtop-Model # 5425)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620444230VR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium Select</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed Angle Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>FA-45-24-11-Kit Rotor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffered saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>51558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson vet</td>
			<td>789 313 89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACs Smart Strainers (30 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (100 &#181;m)</td>
			<td>&#160;Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline (0.9% sodium chloride)</td>
			<td>Baxter International Inc</td>
			<td>2B1323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei Buffer (20x)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN 2000153/2000207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientic</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co</td>
			<td>RS-5675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-5480</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Mend II</td>
			<td>Webster Veteinanry</td>
			<td>07-856-7946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II Collagenase</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>2100502.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deposited Data</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scATACseq FastQ files</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scRNAseq FastQ files</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Ranger 3.1.0</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cicero</td>
			<td>Pliner et al., 2018</td>
			<td>https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ggplot2 v3.2.1</td>
			<td>Hadley Wickham</td>
			<td>https://cran.r-project.org</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony</td>
			<td>Korsunsky et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/immunogenomics/harmony</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Schneider et al., 2012</td>
			<td>https://imagej.nih.gov</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocle 2.8.0</td>
			<td>Qiu et al., 2017</td>
			<td>https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 3.6.2</td>
			<td>R Foundation</td>
			<td>https://www.r-project.org</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seurat 3.1.3</td>
			<td>Stuart et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/satijalab/seurat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signac 0.2.5</td>
			<td>Stuart et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/timoast/signac</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments

טרשת עורקים היא מחלה דלקתית של אזורי העורקים החשופים לזרימת דם מופרעת (d-flow). זרימת D מווסתת את ביטוי הגנים באנדותל ברמות השעתוק והאפיגנומיה, וכתוצאה מכך תגובות פרואתרוגניות. לאחרונה, בוצעו מחקרי ריצוף RNA חד-תאי (scRNAseq) ו-Assay חד-תאי לריצוף כרומטין נגיש של טרנספוזות (scATACseq) כדי לקבוע את השינויים בנגישות של תעתיק וכרומטין ברזולוציה של תא יחיד באמצעות מודל קשירת הקרוטיד החלקית של העכבר (PCL). מכיוון שתאי אנדותל (ECs) מייצגים חלק קטן מכלל אוכלוסיות התאים בדופן העורק, נעשה שימוש בשיטת עיכול לומינלית כדי להשיג תכשירים חד-תאיים מועשרים ב-EC. לצורך מחקר זה, עכברים עברו ניתוח PCL כדי לגרום לזרימת d בעורק הצוואר השמאלי (LCA) תוך שימוש בעורק הצוואר הימני (RCA) כבקרה. עורקי הצוואר נותחו יומיים או שבועיים לאחר ניתוח PCL. לומן של כל קרוטיד היה נתון לעיכול קולגןאז, והתקבלו תאים בודדים מועשרים באנדותל או גרעינים בודדים. תכשירים אלה, המכילים תאים בודדים וגרעינים בודדים, רוכזו לאחר מכן באמצעות מערך מיקרופלואידי של 10x Genomics. לאחר מכן נוצלו התאים הבודדים והגרעינים הבודדים הברקודים להכנת רנ"א, ליצירת ספרייה ולריצוף על רצף דנ"א בעל תפוקה גבוהה. לאחר עיבוד ביואינפורמטיקה, מערכי הנתונים scRNAseq ו- scATACseq זיהו סוגי תאים שונים מהעיכול הלומינלי, המורכב בעיקר מ- ECs. היו גם תאי שריר חלק, פיברובלסטים ותאי מערכת החיסון. שיטת העשרת EC זו סייעה בהבנת ההשפעה של זרימת הדם על האנדותל, מה שיכול היה להיות קשה עם שיטת העיכול הכוללת של העורקים. ניתן להשתמש בשיטת ההכנה החד-תאית המועשרת ב-EC כדי לבצע מחקרי אומיקה חד-תאיים בנוקאאוטים של EC ובעכברים מהונדסים שבהם השפעת זרימת הדם על גנים אלה לא נחקרה. חשוב לציין כי ניתן להתאים טכניקה זו כדי לבודד תאים בודדים מועשרים ב-EC מצמחי עורקים אנושיים כדי לבצע מחקרים מכניסטיים דומים.

ניתוחי קשירת קרוטיד חלקיים בוצעו על 44 עכברים, ותחילת זרימת d ב- LCA אומתה על ידי ביצוע אולטרה-סאונד יום אחד לאחר ניתוח קשירה חלקית. ניתוח קשירה חלקית מוצלח גורם למהירות זרימת דם מופחתת והופך את זרימת הדם (זרימה מופרעת) ב- LCA3. עורקי הצוואר נותחו ביומיים או בשבועיים לאחר הקשירה....

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments at JoVE.com

Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments

אנו מציגים שיטה לבידוד תאי אנדותל וגרעינים מלומן של עורקי הצוואר של עכברים החשופים לתנאי זרימה יציבים או מופרעים כדי לבצע ניסויים באומיקה חד-תאית.

בידוד תאי אנדותל מהלומן של עורקי הצוואר של עכברים לניסויים רב-תאיים חד-תאיים

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in ...

בכלי דם, מספר תאי האנדותל נמוך מאוד, מה שמקשה על חקירתם. הפרוטוקול שלנו מבטל את המגבלה הזו, ומאפשר לנו לחקור מסלולים מולקולריים וטיפולים חדשניים. הפרוטוקול שלנו מאפשר לנו לקבל דגימות מועשרות באנדותל, ולחקור כיצד זרימה מופרעת חריפה וכרונית משפיעה על סוג תא זה.היכולת לחקור תאי אנדותל בפירוט רב יותר מאפשרת להגדיר גני מטרה, ולכן טיפולים פוטנציאליים לטרשת עורקים המכוונים לתאי אנדותל. בידוד עורקי הצוואר הוא מסובך, ודורש סבלנות וניסיון. כדי להתחיל, להכין את החיה על ידי הזרקת 0.05 מיליגרם לק"ג של buprenorphine תת עורית.לעקר את האזור האפילציה באמצעות תמיסת בטאדין ואיזופרופנול שלוש פעמים. בצע חתך בקו האמצע הגחוני של כסנטימטר אחד באזור הצוואר. לאחר מכן חשוף את נקודת ההסתעפות של LCA על ידי דיסקציה קהה.Ligate את הצוואר הפנימי השמאלי, הצוואר החיצוני, ואת העורקים העורפיים עם 6-0 תפרים, משאיר את עורק בלוטת התריס העליון ללא מגע. סגור את החתך עם דבק רקמות או תפרים. העבירו את העכבר לכלוב התאוששות שחומם מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.הניחו את העכבר על מגבת נקייה למשך עד שעה כדי למנוע היפותרמיה לאחר הניתוח. יש להחדיר מחט בעלת 21 מד לקו האינפוזיה המחובר דרך קצה הלב לחדר השמאלי. יש לאפשר זלוף מדרדר למשך 2-3 דקות באמצעות תמיסת מלח רגילה בטמפרטורת החדר.שמרו על קצב זרימה קבוע על ידי הפעלת לחץ קבוע בזמן הזרקה או שימוש בקו IV, ושמירה על שקית המלח בגובה של שמונה עד תשעה מטרים. הסר את העור מאזור הצוואר עם כל השומן, השרירים ורקמות החיבור כדי לחשוף את עורקי הצוואר. לאחר מכן להסיר את הרקמות periadventitial סביב הקרוטידים משאיר את הקרוטיד מחובר לגוף.בצע חתך מתחת לאתר הקשירה ב- LCA כדי לאפשר זילוף. יש למזג את ה-LCA דרך החדר השמאלי למשך דקה נוספת כדי להסיר עקבות דם. לשטוף את החלק החיצוני של עורקי הצוואר עם תמיסת מלח רגילה כדי להסיר כל עקבות של דם.השתמש מזרק אינסולין עם מחט 29 מד כדי להזריק 50 microliters של חיץ העיכול לתוך לומן של הקצה הדיסטלי של עורק הצוואר השמאלי. השתמש בתפס מיקרו כדי להדק את הקצה הפרוקסימלי של עורק הצוואר המלא בחיץ עיכול. הוסיפו 15 עד 20 מיקרוליטרים של חיץ עיכול ללומן, וחתכו את הקצה הדיסטלי כדי למנוע שחרור של חיץ עיכול.מעבירים את עורקי הצוואר מהעכבר לכלים של 35 מילימטרים המכילים תמיסת מלח חמה של 37 מעלות צלזיוס HEPES. ולדגור אותם במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם נדנדה לסירוגין. הסר את עורק הצוואר עם מלחציים מן צלחת 35 מ"מ לאחר עיכול אנזימטי לומינלי הושלמה.נתק את המהדקים בזהירות, כך שמאגר העיכול לא ידלוף. החזיקו קצה אחד של עורק הצוואר על גבי צינור מיקרו-צנטריפוגה בקוטר 1.5 מיליליטר. הוסף 100 מיקרוליטר של חיץ עיכול חם לומן על ידי החדרת מחט 29 מד מצויד מזרק אינסולין.לשטוף במהירות את לומן של עורק הצוואר בצינור צנטריפוגה מיקרו, ולאחר מכן להוסיף 0.3 microliters של FBS לתוך הצינור כדי לעצור את התגובה. הניחו את צינור הצנטריפוגה הזעיר על קרח. צנטריפוגה התאים ב 500 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, באמצעות צנטריפוגה מצויד רוטור זווית קבועה להשליך את supernatant.להשעות מחדש את התאים במאגר העיכול, המכיל מגיב דיסוציאציה של תאים, ולדגור אותם במשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי להפריד אותם לתאים בודדים. לחסום את התגובה האנזימטית על ידי הוספת 0.15 מיליליטר של FBS לצינור 0.5 מיליליטר, ולחזור על הצנטריפוגה. השליכו את הסופר-נטנט, והניחו מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטרים של תמיסת 1%BSA קרה כקרח ב-PBS בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 0.2 מיליליטר.לניתוח תאים בודדים, יש להשהות את הכדור עם 100 מיקרוליטר של 1%BSA קר כקרח ב-PBS בצינור של 0.2 מיליליטר. לניתוח גרעין יחיד, יש להשעות את כדור התא ב-100 מיקרוליטרים של 0.04% BSA ב-PBS קר כקרח, ולבצע צנטריפוגה של תרחיף התא הבודד ב-500G בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. מפרקים את תרחיף התא הבודד עם חיץ ליזיס קר כקרח, ודוגרים במשך חמש דקות על קרח.מערבבים את הליזאט עם פיפטה P20, ודוגרים עוד 10 דקות. לאחר מכן, להעביר את ליזאט בצינור 0.5 מיליליטר. לשטוף את התאים ly עם 500 microliters של חיץ, ומערבבים אותם באמצעות פיפטה.לאחר מכן חזור על הצנטריפוגה. השליכו את הסופר-נטנט, והחזירו את כדור הגרעינים ב-150 מיקרוליטרים של מאגר הגרעינים המדולל. לספור את ההכנות גרעינים בודדים באמצעות hemocytometer.בעקבות מחקר ריצוף גרעינים בודדים, תאים בודדים וגרעינים בודדים התקבלו והודגמו על ידי מיקרוסקופיה של שדה בהיר וניגודיות פאזה. כמו כן הודגמה היעילות של הכנת גרעינים בודדים מתלייה של תא בודד. לאחר מחקר ריצוף הרנ"א של התא הבודד, התקבלו פרמטרים שונים כגון התפלגות גנים לכל תא, מזהה מולקולרי ייחודי לכל תא, קריאות מיטוכונדריאליות לכל תא ונתוני רוויית ריצוף.עבור מחקר רצף ATAC של תא בודד, נצפתה התפלגות גודל התוספת, כולל תבנית הפסים של הנוקלאוזום. כמו כן נצפה ציון העשרת TSS המנורמל. בנוסף, קטע האחוזים קורא בפסגות.נקבעו שברי אזורי שיא, ציון העשרת TSS, יחס הקריאות באתרים הגנומיים ברשימה השחורה ויחס אות נוקלאוזום. העיכול האנזימטי מהווה לחץ עבור התאים, ולכן חיוני לשמור על הדגימות על הקרח, ולבצע את ההליך מהר ככל האפשר. אנו יכולים להשתמש בשיטה זו כדי להשיג ולצבוע תאי אנדותל מעכברים.אנו יכולים גם להשתמש בטכניקה זו כדי לבצע מחקרים מבוססי Omix בתפזורת. טכניקה זו סללה את הדרך לחקר ההשפעה של הפרעה בזרימת הדם על תאי אנדותל in vivo באופן חד-תאי.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

בידוד של תאים אנדותל valvular

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

בידוד של גזע תאים רשתית העין של העכבר

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

בידוד של כלי הדם האנדותל צינורות מעורקי עכבר התנגדות

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

בידוד של תאי האנדותל העכבר כלילי

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

בידוד ואפיון של תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד של עכבר

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

בידוד של תאי אנדותל גלומרולריים של עכברים מותנים עם מיטוכונדריה פלואורסצנטית

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...