Name: isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments
Uploaded: 2021-10-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments at JoVE.com

इस काम को एचजे को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान अनुदान एचएल 119798, एचएल095070 और एचएल 139757 से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था। एचजे को वालेस एच कूल्टर प्रतिष्ठित संकाय चेयर प्रोफेसरशिप द्वारा भी समर्थित किया जाता है। एमोरी इंटीग्रेटेड जीनोमिक्स कोर (ईआईजीसी) द्वारा प्रदान की गई सेवाओं को एमोरी यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन द्वारा सब्सिडी दी गई थी और आंशिक रूप से नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ के जॉर्जिया क्लिनिकल एंड ट्रांसलेशनल साइंस एलायंस द्वारा भी समर्थित किया गया था। UL1TR002378. ऊपर दी गई सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के आधिकारिक विचारों को प्रतिबिंबित नहीं करती है।

नीचे वर्णित सभी पशु प्रक्रियाओं को एमोरी विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। गैर-हाइपरकोलेस्ट्रोलेमिक, आयु- और लिंग-मिलान सी 57बीएल /6 चूहों का उपयोग सेक्?...

<ol>
	<li>Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+atherosclerosis+development+in+C57Bl6+mice+by+overexpressing+AAV-mediated+PCSK9+and+partial+carotid+ligation.">Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation.</a> Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).</li><li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+carotid+ligation+is+a+model+of+acutely+induced+disturbed+flow,+leading+to+rapid+endothelial+dysfunction+and+atherosclerosis.">Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).</li><li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+disturbed+flow-induced+atherosclerosis+in+mouse+carotid+artery+by+partial+ligation+and+a+simple+method+of+RNA+isolation+from+carotid+endothelium.">A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861 (2010).</li><li>Dunn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-dependent+epigenetic+DNA+methylation+regulates+endothelial+gene+expression+and+atherosclerosis.">Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).</li><li>Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-dependent+regulation+of+genome-wide+mRNA+and+microRNA+expression+in+endothelial+cells+in+vivo.">Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo.</a> Scientific Data. 1 (1), 140039 (2014).</li><li>Ni, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+novel+mechanosensitive+genes+in+vivo+using+mouse+carotid+artery+endothelium+exposed+to+disturbed+flow.">Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow.</a> Blood. 116 (15), 66-73 (2010).</li><li>Son, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atypical+mechanosensitive+microRNA-712+derived+from+pre-ribosomal+RNA+induces+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis.">The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Communications. 4, 3000 (2013).</li><li>Andueza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+reprogramming+by+disturbed+flow+revealed+by+single-cell+RNA+and+chromatin+accessibility+study.">Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study.</a> Cell Reports. 33 (11), 108491 (2020).</li><li>Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+single-cell+chromatin+analysis+with+Signac.">Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+integration+of+single-cell+data.">Comprehensive integration of single-cell data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li><li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cell+death+by+trypan+blue+uptake+and+light+microscopy.">Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+cellular+heterogeneity+of+mouse+carotid+artery+under+disturbed+flow.">Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow.</a> Cell Death and Discovery. 7 (1), 180 (2021).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+activated+cell+populations+using+single-cell+RNA-seq.">Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li><li>O'Flanagan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+solid+tumor+tissues+with+cold+active+protease+for+single-cell+RNA-seq+minimizes+conserved+collagenase-associated+stress+responses.">Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.</a> Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).</li></ol>

यह पेपर माउस कैरोटिड धमनियों से एकल-सेल तैयारी को अलग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है। एंडोथेलियल कोशिकाओं पर डी-प्रवाह के प्रभाव का सटीक अध्ययन किया जा सकता है यदि पीसीएल सर्जरी सह...

इस प्रयोगशाला ने पहले प्रदर्शित किया था कि डी-प्रवाह के प्रेरण से हाइपरलिपिडेमिक चूहोंमें त्वरित और ऊबड़-खाबड़ एथेरोस्क्लेरोसिस विकास होता है। डी-फ्लो-प्रेरित एथेरोस्क्लेरोसिस का नया माउस मॉडल आंशिक कैरोटिड लिगेशन (पीसीएल) सर्जरी 3 का उपयोग करके संभव था। पीसीएल सर्जरी लिगेटेड लेफ्ट कैरोटिड धमनी (एलसीए) में कम और ऑसिलेटरी रक्त प्रवाह की स्थिति या डी-फ्लो को प्रेरित करती है। इसके विपरीत, विपरीत दाईं कैरोटिड धमनी (आरसीए) स्थिर लैमिनार प्रवाह (एस-प्रवाह) का सामना करना जारी रखती है। इससे पहले, एंडोथेलियल कोशिकाओं पर डी-प्रवाह के प्रभाव को समझने के लिए, कैरोटिड धमनियों को आंशिक बंधाव सर्जरी के बाद विच्छेदित किया गया था और फिनोल और गुआनिडाइन आइसोथियोसाइनेट-आधारित लाइसिंग एजेंट (ल्यूमिनल आरएनए / डीएनए फ्लशिंग विधि) 2,4 के साथ फ्लश किया गया था, जो एंडोथेलियल-समृद्ध "पूल्ड बल्क" आरएनए या डीएनए प्रदान करता था। इन पूल किए गए थोक आरएनए या डीएनए को तब ट्रांसक्रिप्टोमिक अध्ययन या एपिजेनोमिक डीएनए मेथिलोम अध्ययन के लिए संसाधित किया गया था, क्रमशः 4,5,6। इन अध्ययनों ने कई प्रवाह-संवेदनशील जीन और माइक्रोआरएनए की खोज मेंमदद की, जिनकी एंडोथेलियल जीव विज्ञान और एथेरोस्क्लेरोसिस में भूमिकाओं की बड़े पैमाने पर जांच की गई थी।
हालांकि, एंडोथेलियल संवर्धन के बावजूद, ये थोक आरएनए / डीएनए अध्ययन डी-प्रवाह-प्रेरित एथेरोस्क्लेरोसिस में धमनी की दीवार में प्रत्येक सेल प्रकार की विशिष्ट भूमिका को अलग नहीं कर सके। एंडोथेलियल-समृद्ध एकल-कोशिका (एससी) अलगाव और एससीआरएनए और एससीएटीएसी अनुक्रमण अध्ययन इस सीमाको दूर करने के लिए किए गए थे। इसके लिए, सी 57 बीएल 6 चूहों को नियंत्रण के रूप में एस-फ्लो-उजागर आरसीए का उपयोग करते हुए एलसीए में डी-फ्लो को प्रेरित करने के लिए पीसीएल सर्जरी के अधीन किया गया था। पीसीएल सर्जरी के दो दिन या दो सप्ताह बाद, चूहों की बलि दी गई, और कैरोटिड्स को विच्छेदित और साफ किया गया। एलसीए और आरसीए दोनों के लुमेन को कोलेजनेज के साथ जोड़ा गया था, और ल्यूमिनल कोलेजनेज डाइजेस्ट जिसमें ईसी एक महत्वपूर्ण अंश के रूप में और अन्य धमनी कोशिकाओं को एकत्र किया गया था। एकल-कोशिका निलंबन (scRNAAseq) या एकल-नाभिक निलंबन (scATACseq) तैयार किया गया था और 10x जीनोमिक्स सेटअप का उपयोग करके प्रत्येक कोशिका या नाभिक के लिए अद्वितीय पहचानकर्ताओं के साथ बारकोड किया गया था। आरएनए को सीडीएनए लाइब्रेरी तैयार करने और अनुक्रमित करने के अधीन किया गया था।
एससीआरएनएसेक और एससीएटीएसीक्यू डेटासेट को सेल रेंजर सिंगल-सेल सॉफ्टवेयर का उपयोग करके संसाधित किया गया था और आगे सेरेट और सिग्नैक आर पैकेज 9,10 द्वारा विश्लेषण किया गया था। प्रत्येक कोशिका और नाभिक को इन विश्लेषणों से एक सेल प्रकार सौंपा गया था और मार्कर जीन और अद्वितीय जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के आधार पर सेल प्रकार में क्लस्टर किया गया था। scRNAAseq और scATACseq के परिणामों से पता चला है कि ये एकल-कोशिका तैयारी ईसी से समृद्ध होती हैं और इसमें चिकनी मांसपेशी कोशिकाएं (एसएमसी), फाइब्रोब्लास्ट और प्रतिरक्षा कोशिकाएं भी होती हैं।
आगे के विश्लेषण से पता चला है कि ल्यूमिनल पाचन में ईसी आबादी अत्यधिक भिन्न और प्लास्टिक (8 अलग-अलग ईसी क्लस्टर) और रक्त प्रवाह के प्रति उत्तरदायी है। सबसे महत्वपूर्ण बात, इन परिणामों से पता चला है कि डी-फ्लो एक एथेरो-संरक्षित एंटी-इंफ्लेमेटरी फेनोटाइप से प्रो-एथेरोजेनिक फेनोटाइप ्स में ईसी को पुन: प्रोग्राम करता है, जिसमें प्रो-इंफ्लेमेटरी, एंडोथेलियल-टू-मेसेनकाइमल संक्रमण, एंडोथेलियल स्टेम / पूर्वज सेल संक्रमण और सबसे आश्चर्यजनक रूप से, एंडोथेलियल-टू-इम्यून सेल जैसे संक्रमण शामिल हैं। इसके अलावा, एससीएटीएसीक्यू डेटा जीनोम-व्यापक तरीके से नए प्रवाह-निर्भर क्रोमैटिन पहुंच परिवर्तन और प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी साइटों को प्रकट करता है, जो कई नई परिकल्पनाओं का आधार बनाते हैं। माउस कैरोटिड धमनियों से एकल-कोशिका बहु-ओमिक्स अध्ययन के लिए एकल एंडोथेलियल कोशिकाओं को तैयार करने के लिए पद्धति और प्रोटोकॉल नीचे विस्तृत हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (Cell Culture Grade)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21040CMX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022-43-108-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile</td>
			<td>Fablab</td>
			<td>FL4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL SuperClear Centrifuge Tubes</td>
			<td>Labcon</td>
			<td>3191-335-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk Suture Sterile</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>s-1172 c2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged</td>
			<td>Thermo Fisher Scientic</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase solution,sterile-filtered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000123/ 2000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>RXBUPRENOR5-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Controller &#38; Next GEM Accessory Kit</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#39; Reagent Kits v3.1</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2100502.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D141-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co</td>
			<td>RS-5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase1</td>
			<td>New England Biolabs Inc</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Benchtop-Model # 5425)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620444230VR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium Select</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed Angle Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>FA-45-24-11-Kit Rotor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffered saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>51558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson vet</td>
			<td>789 313 89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACs Smart Strainers (30 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (100 &#181;m)</td>
			<td>&#160;Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline (0.9% sodium chloride)</td>
			<td>Baxter International Inc</td>
			<td>2B1323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei Buffer (20x)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN 2000153/2000207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientic</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co</td>
			<td>RS-5675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-5480</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Mend II</td>
			<td>Webster Veteinanry</td>
			<td>07-856-7946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II Collagenase</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>2100502.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deposited Data</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scATACseq FastQ files</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scRNAseq FastQ files</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Ranger 3.1.0</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cicero</td>
			<td>Pliner et al., 2018</td>
			<td>https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ggplot2 v3.2.1</td>
			<td>Hadley Wickham</td>
			<td>https://cran.r-project.org</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony</td>
			<td>Korsunsky et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/immunogenomics/harmony</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Schneider et al., 2012</td>
			<td>https://imagej.nih.gov</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocle 2.8.0</td>
			<td>Qiu et al., 2017</td>
			<td>https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 3.6.2</td>
			<td>R Foundation</td>
			<td>https://www.r-project.org</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seurat 3.1.3</td>
			<td>Stuart et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/satijalab/seurat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signac 0.2.5</td>
			<td>Stuart et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/timoast/signac</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments

एथेरोस्क्लेरोसिस अशांत रक्त प्रवाह (डी-प्रवाह) के संपर्क में आने वाले धमनी क्षेत्रों की एक भड़काऊ बीमारी है। डी-फ्लो ट्रांसक्रिप्टोमिक और एपिजेनोमिक स्तरों पर एंडोथेलियम में जीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रोथेरोजेनिक प्रतिक्रियाएं होती हैं। हाल ही में, माउस आंशिक कैरोटिड लिगेशन (पीसीएल) मॉडल का उपयोग करके एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन पर ट्रांसक्रिप्टोमिक और क्रोमैटिन एक्सेसिबिलिटी परिवर्तनों को निर्धारित करने के लिए ट्रांसपोसेज एक्सेसिबल क्रोमैटिन सीक्वेंसिंग (एससीएटीएसीक्यू) अध्ययन के लिए सिंगल-सेल आरएनए सीक्वेंसिंग (एससीआरएनएसेक) और सिंगल-सेल परख का प्रदर्शन किया गया था। चूंकि एंडोथेलियल कोशिकाएं (ईसी) धमनी की दीवार में कुल कोशिका आबादी के एक मामूली अंश का प्रतिनिधित्व करती हैं, ईसी-समृद्ध एकल-कोशिका तैयारी प्राप्त करने के लिए एक ल्यूमिनल पाचन विधि का उपयोग किया गया था। इस अध्ययन के लिए, चूहों को नियंत्रण के रूप में दाईं कैरोटिड धमनी (आरसीए) का उपयोग करते हुए बाएं कैरोटिड धमनी (एलसीए) में डी-प्रवाह को प्रेरित करने के लिए पीसीएल सर्जरी के अधीन किया गया था। पीसीएल सर्जरी के दो दिन या दो सप्ताह बाद कैरोटिड धमनियों को विच्छेदित किया गया था। प्रत्येक कैरोटिड के लुमेन को कोलेजनेज पाचन के अधीन किया गया था, और एंडोथेलियल-समृद्ध एकल कोशिकाओं या एकल नाभिक प्राप्त किए गए थे। इन एकल-कोशिका और एकल-नाभिक तैयारियों को बाद में 10x जीनोमिक्स माइक्रोफ्लुइडिक सेटअप का उपयोग करके बारकोड किया गया था। बारकोडेड एकल-कोशिकाओं और एकल-नाभिक का उपयोग तब आरएनए तैयारी, पुस्तकालय उत्पादन और उच्च-थ्रूपुट डीएनए अनुक्रमक पर अनुक्रमण के लिए किया गया था। जैव सूचना विज्ञान प्रसंस्करण के बाद, एससीआरएनएसेक और एससीएटीएसीक्यू डेटासेट ने ल्यूमिनल पाचन से विभिन्न सेल प्रकारों की पहचान की, जिसमें मुख्य रूप से ईसी शामिल थे। चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाएं, फाइब्रोब्लास्ट और प्रतिरक्षा कोशिकाएं भी मौजूद थीं। इस ईसी-संवर्धन विधि ने एंडोथेलियम पर रक्त प्रवाह के प्रभाव को समझने में सहायता की, जो कुल धमनी पाचन विधि के साथ मुश्किल हो सकता था। ईसी-समृद्ध एकल-कोशिका तैयारी विधि का उपयोग ईसी-नॉकआउट और ट्रांसजेनिक चूहों में एकल-सेल ओमिक्स अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जहां इन जीनों पर रक्त प्रवाह के प्रभाव का अध्ययन नहीं किया गया है। महत्वपूर्ण रूप से, इस तकनीक को समान यांत्रिक अध्ययन करने के लिए मानव धमनी खोजों से ईसी-समृद्ध एकल कोशिकाओं को अलग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

44 चूहों पर आंशिक कैरोटिड बंधाव सर्जरी की गई थी, और एलसीए में डी-फ्लो की शुरुआत को आंशिक बंधाव सर्जरी के एक दिन बाद अल्ट्रासोनोग्राफी करके मान्य किया गया था। सफल आंशिक बंधाव सर्जरी रक्त प्रवाह वेग को ?...

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Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments

हम एकल-कोशिका ओमिक्स प्रयोगों को करने के लिए स्थिर या परेशान प्रवाह स्थितियों के संपर्क में आने वाले माउस कैरोटिड धमनियों के लुमेन से एंडोथेलियल कोशिकाओं और नाभिक को अलग करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं।

एकल-कोशिका मल्टी-ओमिक्स प्रयोगों के लिए माउस कैरोटिड धमनियों के लुमेन से एंडोथेलियल कोशिकाओं का अलगाव

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in ...

एक रक्त वाहिका में, एंडोथेलियल कोशिकाओं की संख्या बहुत कम होती है, जिससे उनका अध्ययन करना मुश्किल हो जाता है। हमारा प्रोटोकॉल इस सीमा को समाप्त करता है, और हमें नए आणविक मार्गों और चिकित्सीय का अध्ययन करने की अनुमति देता है। हमारा प्रोटोकॉल हमें एंडोथेलियल समृद्ध नमूने प्राप्त करने की अनुमति देता है, और अध्ययन करता है कि तीव्र और पुरानी अशांत प्रवाह इस सेल प्रकार को कैसे प्रभावित करता है।एंडोथेलियल कोशिकाओं का अधिक विस्तार से अध्ययन करने की क्षमता लक्ष्य जीन को परिभाषित करना संभव बनाती है, और इसलिए एंडोथेलियल कोशिकाओं को लक्षित करने वाले एथेरोस्क्लेरोसिस के लिए संभावित चिकित्सीय। कैरोटिड धमनी अलगाव मुश्किल है, और धैर्य और अनुभव की आवश्यकता होती है। शुरू करने के लिए, 0.05 मिलीग्राम प्रति किलोग्राम ब्यूप्रेनोर्फिन को चमड़े के नीचे इंजेक्ट करके जानवर को तैयार करें।बीटाडाइन और आइसोप्रोपेनोल समाधान का उपयोग करके एपिलेटेड क्षेत्र को तीन बार निष्फल करें। गर्दन के क्षेत्र में लगभग एक सेंटीमीटर का उदर मध्य रेखा चीरा लगाएं। फिर कुंद विच्छेदन द्वारा एलसीए शाखा बिंदु को उजागर करें।बाएं आंतरिक कैरोटिड, बाहरी कैरोटिड और ओसीसीपटल धमनियों को 6-0 सीवन के साथ लपेटें, जिससे बेहतर थायरॉयड धमनी अछूती रह जाती है। ऊतक गोंद या सीवन के साथ चीरा बंद करें। माउस को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखे गए प्री-वार्म्ड रिकवरी पिंजरे में स्थानांतरित करें।सर्जरी के बाद हाइपोथर्मिया से बचने के लिए माउस को एक घंटे तक एक साफ तौलिया पर रखें। बाएं वेंट्रिकल में हृदय के शीर्ष के माध्यम से जुड़ी आईवी लाइन में एक 21 गेज सुई डालें। कमरे के तापमान पर सामान्य खारा का उपयोग करके दो से तीन मिनट के लिए प्रतिगामी छिड़काव की अनुमति दें।इंजेक्शन लगाते समय या आईवी लाइन का उपयोग करते समय स्थिर दबाव लगाकर और खारा बैग को आठ से नौ फीट की ऊंचाई पर रखकर एक निरंतर प्रवाह दर बनाए रखें। कैरोटिड धमनियों को उजागर करने के लिए सभी वसा, मांसपेशियों और संयोजी ऊतकों के साथ गर्दन क्षेत्र से त्वचा को हटा दें। फिर शरीर से जुड़े कैरोटिड को छोड़कर कैरोटिड के आसपास पेरिएडवेंटियल ऊतकों को हटा दें।छिड़काव की अनुमति देने के लिए एलसीए में लिगेशन साइट के नीचे एक चीरा लगाएं। किसी भी रक्त के निशान को हटाने के लिए एक और मिनट के लिए बाएं वेंट्रिकल के माध्यम से एलसीए को दबाएं। रक्त के किसी भी निशान को हटाने के लिए कैरोटिड धमनियों के बाहरी हिस्से को सामान्य खारा घोल से धोएं।बाएं कैरोटिड धमनी के डिस्टल छोर के लुमेन में 50 माइक्रोलीटर पाचन बफर इंजेक्ट करने के लिए 29 गेज सुई के साथ इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करें। पाचन बफर से भरे कैरोटिड धमनी के समीपस्थ छोर को दबाने के लिए एक माइक्रो क्लिप का उपयोग करें। लुमेन में पाचन बफर के 15 से 20 माइक्रोलीटर जोड़ें, और पाचन बफर की किसी भी रिहाई से बचने के लिए डिस्टल छोर को क्लिप करें।माउस से कैरोटिड धमनियों को 35 मिलीमीटर व्यंजनों में स्थानांतरित करें जिसमें गर्म 37 डिग्री सेल्सियस एचईपीईएस बफर्ड सलाइन सॉल्यूशन हो। और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए आंतरायिक रॉकिंग के साथ इनक्यूबेट करें। ल्यूमिनल एंजाइमेटिक पाचन पूरा होने के बाद 35 मिलीमीटर डिश से क्लैंप के साथ कैरोटिड धमनी को हटा दें।क्लैंप को सावधानी से अलग करें, ताकि पाचन बफर लीक न हो। 1.5 मिलीलीटर माइक्रो सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के शीर्ष पर कैरोटिड धमनी के एक छोर को पकड़ें। इंसुलिन सिरिंज से लैस 29 गेज सुई डालकर लुमेन में गर्म पाचन बफर के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें।माइक्रो सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में कैरोटिड धमनी के लुमेन को जल्दी से फ्लश करें, फिर प्रतिक्रिया को रोकने के लिए ट्यूब में एफबीएस के 0.3 माइक्रोलीटर जोड़ें। माइक्रो सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को बर्फ पर रखें। एक निश्चित कोण रोटर से लैस सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 500 ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनैटेंट को छोड़ दें।कोशिका पृथक्करण अभिकर्मक युक्त पाचन बफर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और उन्हें एकल कोशिकाओं में अलग करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 0.5 मिलीलीटर ट्यूब में 0.15 मिलीलीटर एफबीएस जोड़कर एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया को अवरुद्ध करें, और सेंट्रीफ्यूजेशन को दोहराएं। सुपरनैटेंट को छोड़ दें, और 0.2 मिलीलीटर माइक्रो सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पीबीएस में बर्फ के ठंडे 1% बीएसए समाधान के 100 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।एकल कोशिका विश्लेषण के लिए, 0.2 मिलीलीटर ट्यूब में पीबीएस में 100 माइक्रोलीटर बर्फ ठंडा 1% बीएसए के साथ गोली को फिर से निलंबित करें। एकल नाभिक विश्लेषण के लिए, बर्फ के ठंडे पीबीएस में 0.04% बीएसए के 100 माइक्रोलीटर में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें, और पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 500 जी पर एकल सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। एकल कोशिका निलंबन को बर्फ ठंडे लाइसिस बफर के साथ विघटित करें, और बर्फ पर पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।लाइसेट को पी 20 पिपेट के साथ मिलाएं, और एक और 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। बाद में, लाइसेट को 0.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। 500 माइक्रोलीटर बफर के साथ लाइ कोशिकाओं को धोएं, और उन्हें पिपेट का उपयोग करके मिलाएं।फिर सेंट्रीफ्यूजेशन को दोहराएं। सुपरनैटेंट को छोड़ दें, और पतला नाभिक बफर के 150 माइक्रोलीटर में नाभिक गोली को फिर से निलंबित करें। हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके एकल नाभिक तैयारी की गणना करें।एकल नाभिक अनुक्रमण अध्ययन के बाद, एकल कोशिका और एकल नाभिक को उज्ज्वल-क्षेत्र, और चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त और कल्पना की गई थी। एकल कोशिका निलंबन से एकल नाभिक तैयारी की दक्षता भी प्रदर्शित की गई थी। एकल सेल आरएनए अनुक्रमण अध्ययन के बाद, विभिन्न पैरामीटर जैसे कि प्रति सेल जीन का वितरण, प्रति सेल अद्वितीय आणविक पहचानकर्ता, माइटोकॉन्ड्रियल रीड प्रति सेल, और अनुक्रमण संतृप्ति डेटा प्राप्त किए गए थे।एकल सेल एटीएसी अनुक्रम अध्ययन के लिए, न्यूक्लियोसोम बैंडिंग पैटर्न सहित सम्मिलित आकार वितरण देखा गया था। सामान्यीकृत टीएसएस संवर्धन स्कोर भी देखा गया था। इसके अलावा, प्रतिशत टुकड़ा चोटियों में पढ़ता है।पीक क्षेत्र के टुकड़े, टीएसएस संवर्धन स्कोर, ब्लैकलिस्ट जीनोमिक साइटों में पढ़ने का अनुपात और न्यूक्लियोसोम सिग्नल अनुपात निर्धारित किए गए थे। एंजाइमेटिक पाचन कोशिकाओं के लिए एक तनाव है, इसलिए बर्फ पर नमूने को बनाए रखना और जितनी जल्दी हो सके प्रक्रिया करना महत्वपूर्ण है। हम चूहों से एंडोथेलियल कोशिकाओं को प्राप्त करने और प्लेट करने के लिए इस विधि का उपयोग कर सकते हैं।हम थोक ओमिक्स आधारित अध्ययन करने के लिए भी इस तकनीक का उपयोग कर सकते हैं। इस तकनीक ने एकल कोशिका तरीके से विवो में एंडोथेलियल कोशिकाओं पर परेशान रक्त प्रवाह के प्रभाव का अध्ययन करने का मार्ग प्रशस्त किया।

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

वाल्वुलर endothelial कोशिकाओं के अलगाव

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

माउस आँखों से रेटिना स्टेम सेल के अलगाव

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

अलगाव और नवजात चूहे से फेफड़े endothelial कोशिकाओं की संस्कृति

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

प्रेरित pluripotent स्टेम सेल से व्युत्पन्न चूहों की पीढ़ी

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

माउस प्रतिरोध धमनियों से microvascular endothelial ट्यूब का अलगाव

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Murine वाल्व endothelial कोशिकाओं का अलगाव

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

अलगाव और माउस महाधमनी endothelial कोशिकाओं के प्राथमिक संस्कृति

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

माउस कोरोनरी endothelial कोशिकाओं के अलगाव

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

माउस प्राथमिक जिगर Sinusoidal endothelial कोशिकाओं के अलगाव और लक्षण वर्णन

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रिया के साथ सशर्त रूप से अमर माउस ग्लोमेरुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं का अलगाव

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...