Name: isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments
Uploaded: 2021-10-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da finanziamenti da sovvenzioni del National Institutes of Health HL119798, HL095070 e HL139757 a HJ. HJ è anche supportato dalla Wallace H. Coulter Distinguished Faculty Chair Professorship. I servizi forniti dall'Emory Integrated Genomics Core (EIGC) sono stati sovvenzionati dalla Emory University School of Medicine e sono stati anche parzialmente supportati dalla Georgia Clinical and Translational Science Alliance del National Institutes of Health con il premio no. UL1TR002378. Il contenuto fornito sopra è di esclusiva responsabilità degli autori e non riflette le opinioni ufficiali del National Institutes of Health.

Tutte le procedure animali descritte di seguito sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Emory University. I topi C57BL / 6 non ipercolesterolemizzanti, abbinati all'età e al sesso sono stati utilizzati per mitigare la variazione dipendente dal sesso e compensare qualsiasi complicanza delle condizioni ipercolesterolemiche.
1. Chirurgia della legatura parziale della carotide (PCL)
NOTA: La legatura parziale dell'arteria carotide dell...

<ol>
	<li>Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+atherosclerosis+development+in+C57Bl6+mice+by+overexpressing+AAV-mediated+PCSK9+and+partial+carotid+ligation.">Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation.</a> Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).</li><li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+carotid+ligation+is+a+model+of+acutely+induced+disturbed+flow,+leading+to+rapid+endothelial+dysfunction+and+atherosclerosis.">Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).</li><li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+disturbed+flow-induced+atherosclerosis+in+mouse+carotid+artery+by+partial+ligation+and+a+simple+method+of+RNA+isolation+from+carotid+endothelium.">A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861 (2010).</li><li>Dunn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-dependent+epigenetic+DNA+methylation+regulates+endothelial+gene+expression+and+atherosclerosis.">Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).</li><li>Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-dependent+regulation+of+genome-wide+mRNA+and+microRNA+expression+in+endothelial+cells+in+vivo.">Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo.</a> Scientific Data. 1 (1), 140039 (2014).</li><li>Ni, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+novel+mechanosensitive+genes+in+vivo+using+mouse+carotid+artery+endothelium+exposed+to+disturbed+flow.">Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow.</a> Blood. 116 (15), 66-73 (2010).</li><li>Son, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atypical+mechanosensitive+microRNA-712+derived+from+pre-ribosomal+RNA+induces+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis.">The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Communications. 4, 3000 (2013).</li><li>Andueza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+reprogramming+by+disturbed+flow+revealed+by+single-cell+RNA+and+chromatin+accessibility+study.">Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study.</a> Cell Reports. 33 (11), 108491 (2020).</li><li>Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+single-cell+chromatin+analysis+with+Signac.">Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+integration+of+single-cell+data.">Comprehensive integration of single-cell data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li><li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cell+death+by+trypan+blue+uptake+and+light+microscopy.">Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+cellular+heterogeneity+of+mouse+carotid+artery+under+disturbed+flow.">Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow.</a> Cell Death and Discovery. 7 (1), 180 (2021).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+activated+cell+populations+using+single-cell+RNA-seq.">Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li><li>O'Flanagan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+solid+tumor+tissues+with+cold+active+protease+for+single-cell+RNA-seq+minimizes+conserved+collagenase-associated+stress+responses.">Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.</a> Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).</li></ol>

Questo documento fornisce un protocollo dettagliato per isolare i preparati unicellulari dalle arterie carotidi del topo. L'influenza del d-flow sulle cellule endoteliali può essere accuratamente studiata se la chirurgia PCL viene eseguita correttamente. È fondamentale identificare correttamente i rami della carotide comune, come la carotide esterna, la carotide interna, l'arteria occipitale e l'arteria tiroidea superiore. La convalida dei modelli di flusso mediante ecografia convalida ulteriormente l'insorgen...

Questo laboratorio ha precedentemente dimostrato che l'induzione del d-flow porta a uno sviluppo rapido e robusto dell'aterosclerosi nei topi iperlipidemici 1,2. Il nuovo modello murino di aterosclerosi indotta da d-flow è stato possibile utilizzando la chirurgia della legatura parziale della carotide (PCL) 3. La chirurgia PCL induce condizioni di flusso sanguigno basso e oscillatorio o d-flow nell'arteria carotide sinistra legata (LCA). Al contrario, l'arteria carotide destra controlaterale (RCA) continua ad affrontare un flusso laminare stabile (s-flow). In precedenza, per comprendere l'effetto del d-flow sulle cellule endoteliali, le arterie carotidi venivano sezionate dopo un intervento chirurgico di legatura parziale e lavate con un agente lisante a base di fenolo e guanidina isotiocianato (metodo di lavaggio del DNA / RNA luminale)2,4, che forniva RNA o DNA "pooled bulk" arricchiti con endotelio. Questi aggregati di RNA o DNA bulk sono stati quindi elaborati per studi trascrittomici o studi epigenomici sul metiloma del DNA, rispettivamente 4,5,6. Questi studi hanno contribuito a scoprire più geni sensibili al flusso e microRNA i cui ruoli nella biologia endoteliale e nell'aterosclerosi sono stati ampiamente studiati 4,6,7.
Tuttavia, nonostante l'arricchimento endoteliale, questi studi di massa RNA / DNA non hanno potuto distinguere il ruolo specifico di ciascun tipo di cellula nella parete arteriosa nell'aterosclerosi indotta da d-flow. Sono stati eseguiti studi di isolamento a singola cellula arricchita di endotelio (sc) e di sequenziamento di scRNA e scATAC per superare questa limitazione8. Per questo, i topi C57Bl6 sono stati sottoposti alla chirurgia PCL per indurre il d-flow nella LCA mentre utilizzavano l'RCA esposto al flusso s come controllo. Due giorni o due settimane dopo l'intervento chirurgico PCL, i topi sono stati sacrificati e le carotidi sono state sezionate e ripulite. Il lume di entrambe le LCA e RCA è stato infuso con collagenasi e sono stati raccolti i digesti di collagenasi luminale contenenti EC come frazione significativa e altre cellule arteriose. La sospensione a singola cellula (scRNAseq) o la sospensione a nucleo singolo (scATACseq) sono state preparate e codificate a barre con identificatori univoci per ogni cellula o nucleo utilizzando una configurazione genomica 10x. Gli RNA sono stati sottoposti alla preparazione della libreria di cDNA e sequenziati.
I set di dati scRNAseq e scATACseq sono stati elaborati utilizzando il software Cell Ranger Single-Cell e ulteriormente analizzati dai pacchetti Seurat e Signac R 9,10. Ad ogni cellula e nucleo è stato assegnato un tipo di cellula da queste analisi e raggruppato nel tipo di cellula in base ai geni marcatori e ai modelli di espressione genica unici. I risultati di scRNAseq e scATACseq hanno dimostrato che questi preparati unicellulari sono arricchiti con EC e contengono anche cellule muscolari lisce (SMC), fibroblasti e cellule immunitarie.
Ulteriori analisi hanno rivelato che la popolazione EC nella digestione luminale è altamente divergente e plastica (8 diversi cluster EC) e reattiva al flusso sanguigno. Ancora più importante, questi risultati hanno dimostrato che il d-flow riprogramma le EC da un fenotipo antinfiammatorio protetto dall'atero a fenotipi pro-aterogeni, tra cui la transizione pro-infiammatoria, endoteliale-mesenchimale, la transizione delle cellule staminali / progenitrici endoteliali e, più sorprendentemente, la transizione da cellule endoteliali a cellule immunitarie. Inoltre, i dati di scATACseq rivelano nuovi cambiamenti di accessibilità della cromatina dipendenti dal flusso e siti di legame del fattore di trascrizione in modo genomico, che costituiscono la base di diverse nuove ipotesi. La metodologia e il protocollo per la preparazione di singole cellule endoteliali per studi multi-omici a singola cellula dalle arterie carotidi di topo sono dettagliati di seguito.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (Cell Culture Grade)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21040CMX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022-43-108-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile</td>
			<td>Fablab</td>
			<td>FL4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL SuperClear Centrifuge Tubes</td>
			<td>Labcon</td>
			<td>3191-335-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk Suture Sterile</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>s-1172 c2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged</td>
			<td>Thermo Fisher Scientic</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase solution,sterile-filtered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000123/ 2000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>RXBUPRENOR5-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Controller &#38; Next GEM Accessory Kit</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#39; Reagent Kits v3.1</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2100502.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D141-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co</td>
			<td>RS-5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase1</td>
			<td>New England Biolabs Inc</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Benchtop-Model # 5425)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620444230VR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium Select</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed Angle Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>FA-45-24-11-Kit Rotor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffered saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>51558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson vet</td>
			<td>789 313 89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACs Smart Strainers (30 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (100 &#181;m)</td>
			<td>&#160;Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline (0.9% sodium chloride)</td>
			<td>Baxter International Inc</td>
			<td>2B1323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei Buffer (20x)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN 2000153/2000207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientic</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co</td>
			<td>RS-5675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-5480</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Mend II</td>
			<td>Webster Veteinanry</td>
			<td>07-856-7946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II Collagenase</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>2100502.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deposited Data</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scATACseq FastQ files</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scRNAseq FastQ files</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Ranger 3.1.0</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cicero</td>
			<td>Pliner et al., 2018</td>
			<td>https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ggplot2 v3.2.1</td>
			<td>Hadley Wickham</td>
			<td>https://cran.r-project.org</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony</td>
			<td>Korsunsky et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/immunogenomics/harmony</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Schneider et al., 2012</td>
			<td>https://imagej.nih.gov</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocle 2.8.0</td>
			<td>Qiu et al., 2017</td>
			<td>https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 3.6.2</td>
			<td>R Foundation</td>
			<td>https://www.r-project.org</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seurat 3.1.3</td>
			<td>Stuart et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/satijalab/seurat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signac 0.2.5</td>
			<td>Stuart et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/timoast/signac</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments

L'aterosclerosi è una malattia infiammatoria delle regioni arteriose esposte a flussi sanguigni disturbati (d-flow). Il D-flow regola l'espressione dei geni nell'endotelio a livello trascrittomico ed epigenomico, con conseguente risposta proaterogena. Recentemente, sono stati eseguiti studi di sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNAseq) e test a singola cellula per il sequenziamento della cromatina accessibile alla trasposasi (scATACseq) per determinare i cambiamenti di accessibilità trascrittomica e cromatina a una risoluzione a singola cellula utilizzando il modello di legatura parziale della carotide (PCL) del topo. Poiché le cellule endoteliali (ECs) rappresentano una frazione minore delle popolazioni cellulari totali nella parete arteriosa, è stato utilizzato un metodo di digestione luminale per ottenere preparati monocellulari arricchiti con EC. Per questo studio, i topi sono stati sottoposti a chirurgia PCL per indurre il flusso d nell'arteria carotide sinistra (LCA) mentre utilizzavano l'arteria carotide destra (RCA) come controllo. Le arterie carotidi sono state sezionate due giorni o due settimane dopo l'intervento chirurgico PCL. Il lume di ciascuna carotide è stato sottoposto alla digestione della collagenasi e sono state ottenute singole cellule arricchite con endotelio o singoli nuclei. Questi preparati monocellulari e mononuclei sono stati successivamente codificati a barre utilizzando una configurazione microfluidica 10x Genomics. Le singole cellule e i singoli nuclei con codice a barre sono stati quindi utilizzati per la preparazione dell'RNA, la generazione della libreria e il sequenziamento su un sequenziatore di DNA ad alto rendimento. Dopo l'elaborazione bioinformatica, i set di dati scRNAseq e scATACseq hanno identificato vari tipi di cellule dalla digestione luminale, costituite principalmente da EC . Erano presenti anche cellule muscolari lisce, fibroblasti e cellule immunitarie. Questo metodo di arricchimento CE ha aiutato a comprendere l'effetto del flusso sanguigno sull'endotelio, che avrebbe potuto essere difficile con il metodo di digestione totale delle arterie. Il metodo di preparazione a singola cellula arricchito con EC può essere utilizzato per eseguire studi omici a singola cellula in topi EC-knockout e transgenici in cui l'effetto del flusso sanguigno su questi geni non è stato studiato. È importante sottolineare che questa tecnica può essere adattata per isolare singole cellule arricchite di EC da espianti di arterie umane per eseguire studi meccanicistici simili.

Sono stati eseguiti interventi chirurgici di legatura parziale della carotide su 44 topi e l'inizio del flusso d nella LCA è stato convalidato eseguendo l'ecografia un giorno dopo l'intervento chirurgico di legatura parziale. La chirurgia di legatura parziale di successo provoca una riduzione della velocità del flusso sanguigno e inverte il flusso sanguigno (flusso disturbato) nella LCA3. Le arterie carotidi sono state sezionate a due giorni o due settimane dopo la legatura. Il lume di ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments at JoVE.com

Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments

Presentiamo un metodo per isolare cellule e nuclei endoteliali dal lume delle arterie carotidi di topo esposte a condizioni di flusso stabili o disturbate per eseguire esperimenti omici a singola cellula.

Isolamento delle cellule endoteliali dal lume delle arterie carotidi di topo per esperimenti multi-omici a singola cellula

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in ...

In un vaso sanguigno, il numero di cellule endoteliali è molto basso, il che rende difficile studiarle. Il nostro protocollo elimina questa limitazione e ci consente di studiare nuovi percorsi molecolari e terapie. Il nostro protocollo ci consente di ottenere campioni arricchiti endoteliali e studiare come il flusso disturbato acuto e cronico influisce su questo tipo di cellula.La capacità di studiare le cellule endoteliali in modo più dettagliato consente di definire i geni bersaglio, e quindi potenziali terapie per l'aterosclerosi che prendono di mira le cellule endoteliali. L'isolamento dell'arteria carotide è complicato e richiede pazienza ed esperienza. Per iniziare, preparare l'animale iniettando 0,05 milligrammi per chilogrammo di buprenorfina per via sottocutanea.Sterilizzare l'area epilata usando Betadine e soluzione di isopropanolo tre volte. Fare un'incisione ventrale della linea mediana di circa un centimetro nella regione del collo. Quindi esporre il punto di diramazione LCA mediante dissezione smussata.Ligare la carotide interna sinistra, la carotide esterna e le arterie occipitali con 6-0 punti di sutura, lasciando intatta l'arteria tiroidea superiore. Chiudere l'incisione con colla di tessuto o punti di sutura. Trasferire il mouse in una gabbia di recupero preriscaldata mantenuta a 37 gradi Celsius.Posizionare il mouse su un asciugamano pulito per un massimo di un'ora per evitare l'ipotermia post-operatoria. Inserire un ago di calibro 21 nella linea IV collegata attraverso l'apice del cuore nel ventricolo sinistro. Lasciare la perfusione retrograda per due o tre minuti utilizzando soluzione salina normale a temperatura ambiente.Mantenere una portata costante applicando una pressione costante durante l'iniezione o l'utilizzo di una linea IV e mantenendo la sacca salina ad un'altezza di otto-nove piedi. Rimuovere la pelle dalla regione del collo con tutto il grasso, i muscoli e i tessuti connettivi per esporre le arterie carotidi. Quindi rimuovere i tessuti periavventiziali intorno alle carotidi lasciando la carotide attaccata al corpo.Fare un'incisione sotto il sito di legatura nella LCA per consentire la perfusione. Perfondere l'LCA attraverso il ventricolo sinistro per un altro minuto per rimuovere eventuali tracce di sangue. Lavare l'esterno delle arterie carotidi con una normale soluzione salina per rimuovere eventuali tracce di sangue.Utilizzare una siringa da insulina con un ago da 29 gauge per iniettare 50 microlitri di tampone digestivo nel lume dell'estremità distale dell'arteria carotide sinistra. Utilizzare una micro clip per bloccare l'estremità prossimale dell'arteria carotide piena di tampone digestivo. Aggiungere da 15 a 20 microlitri di tampone di digestione nel lume e tagliare l'estremità distale per evitare qualsiasi rilascio di tampone di digestione.Trasferire le arterie carotidi dal topo in piatti da 35 millimetri contenenti soluzione salina tamponata HEPES calda a 37 gradi Celsius. E incubarli per 45 minuti a 37 gradi Celsius con oscillazioni intermittenti. Rimuovere l'arteria carotide con i morsetti dal piatto di 35 millimetri dopo aver completato la digestione enzimatica luminale.Staccare accuratamente i morsetti, in modo che il tampone di digestione non perda. Tenere un'estremità dell'arteria carotide sopra un tubo da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere 100 microlitri di tampone di digestione caldo al lume inserendo un ago da 29 gauge dotato di una siringa da insulina.Lavare rapidamente il lume dell'arteria carotide nel tubo della microcentrifuga, quindi aggiungere 0,3 microlitri di FBS nel tubo per fermare la reazione. Posizionare il tubo della microcentrifuga sul ghiaccio. Centrifugare le celle a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius, utilizzando una centrifuga dotata di rotore ad angolo fisso e scartare il surnatante.Risospendere le cellule nel tampone di digestione, contenente il reagente di dissociazione cellulare, e incubarle per cinque minuti a 37 gradi Celsius per separarle in singole cellule. Bloccare la reazione enzimatica aggiungendo 0,15 millilitri di FBS al tubo da 0,5 millilitri e ripetere la centrifugazione. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 100 microlitri di soluzione ghiacciata all'1% BSA in PBS in una provetta da microcentrifuga da 0,2 millilitri.Per l'analisi a cella singola, risospendere il pellet con 100 microlitri di ghiaccio freddo 1% BSA in PBS in un tubo da 0,2 millilitri. Per l'analisi del singolo nucleo, risospendere il pellet cellulare in 100 microlitri di 0,04% BSA in PBS ghiacciato e centrifugare la sospensione a singola cellula a 500G a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scomporre la sospensione monocellulare con tampone di lisi ghiacciato e incubare per cinque minuti su ghiaccio.Mescolare il lisato con una pipetta P20 e incubare per altri 10 minuti. Successivamente, trasferire il lisato in un tubo da 0,5 millilitri. Lavare le celle con 500 microlitri di tampone e mescolarle con una pipetta.Quindi ripetere la centrifugazione. Scartare il surnatante e risospendere il pellet di nuclei in 150 microlitri del tampone nuclei diluiti. Contare i preparati di singoli nuclei usando un emocitometro.A seguito dello studio di sequenziamento di singoli nuclei, sono stati ottenuti nuclei singoli e singoli nuclei e visualizzati mediante microscopia a campo luminoso e a contrasto di fase. È stata anche dimostrata l'efficienza della preparazione di singoli nuclei dalla sospensione monocellulare. Dopo lo studio di sequenziamento dell'RNA a singola cellula, sono stati ottenuti vari parametri come la distribuzione dei geni per cellula, l'identificatore molecolare univoco per cellula, le letture mitocondriali per cellula e i dati di saturazione del sequenziamento.Per lo studio della sequenza ATAC a singola cellula, è stata osservata la distribuzione delle dimensioni dell'inserto, incluso il modello di banding del nucleosoma. È stato osservato anche il punteggio di arricchimento TSS normalizzato. Inoltre, il frammento percentuale legge nei picchi.Sono stati determinati i frammenti della regione di picco, il punteggio di arricchimento TSS, il rapporto delle letture nei siti genomici della lista nera e il rapporto del segnale dei nucleosomi. La digestione enzimatica è uno stress per le cellule, quindi è fondamentale mantenere i campioni sul ghiaccio ed eseguire la procedura il più rapidamente possibile. Possiamo usare questo metodo per ottenere e placcare le cellule endoteliali dai topi.Possiamo anche utilizzare questa tecnica per eseguire studi basati su Omix di massa. Questa tecnica ha aperto la strada allo studio dell'effetto del flusso sanguigno disturbato sulle cellule endoteliali in vivo in modo da una singola cellula.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Isolamento di cellule endoteliali valvolare

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Ricerca

Biologia

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Isolamento di cellule staminali della retina dalla Eye mouse

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Isolamento e la coltura di cellule endoteliali polmonari da topi neonati

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generazione di topi derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

Isolamento di microvascolare endoteliale tubi da arterie di resistenza mouse

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolamento di cellule murine endoteliali Valve

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolamento e colture primarie di cellule di topo aortica endoteliali

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Isolamento di cellule di topo coronarica endoteliali

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Isolamento e caratterizzazione di cellule endoteliali sinusoidali primarie del fegato di topo

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

Isolamento di cellule endoteliali glomerulari di topo condizionatamente immortalizzate con mitocondri fluorescenti

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...