Name: isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments
Uploaded: 2021-10-04T15:00:00
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この研究は、国立衛生研究所からの助成金HL119798、HL095070、およびHL139757からのHJへの資金提供によってサポートされました。HJは、ウォレスH.コールター特別教授の教授職によってもサポートされています。エモリー統合ゲノミクスコア(EIGC)によって提供されるサービスは、エモリー大学医学部によって助成され、また、賞番号の下で国立衛生研究所のジョージア臨床およびトランスレーショナルサイエンスアライアンスによって部分的にサポートされました。UL1TR002378。上記の内容は著者の責任であり、国立衛生研究所の公式見解を反映したものではありません。

以下に説明するすべての動物の手順は、エモリー大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。非高コレステロール血症、年齢および性別が一致したC57BL / 6マウスを使用して、性依存的な変動を軽減し、高コレステロール血症状態の合併症を相殺しました。
1.部分頸動脈結紮術(PCL)手術
注:LCAの部分頸動脈結紮は前述のように実施され...

<ol>
	<li>Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+atherosclerosis+development+in+C57Bl6+mice+by+overexpressing+AAV-mediated+PCSK9+and+partial+carotid+ligation.">Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation.</a> Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).</li><li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+carotid+ligation+is+a+model+of+acutely+induced+disturbed+flow,+leading+to+rapid+endothelial+dysfunction+and+atherosclerosis.">Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).</li><li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+disturbed+flow-induced+atherosclerosis+in+mouse+carotid+artery+by+partial+ligation+and+a+simple+method+of+RNA+isolation+from+carotid+endothelium.">A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861 (2010).</li><li>Dunn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-dependent+epigenetic+DNA+methylation+regulates+endothelial+gene+expression+and+atherosclerosis.">Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).</li><li>Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-dependent+regulation+of+genome-wide+mRNA+and+microRNA+expression+in+endothelial+cells+in+vivo.">Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo.</a> Scientific Data. 1 (1), 140039 (2014).</li><li>Ni, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+novel+mechanosensitive+genes+in+vivo+using+mouse+carotid+artery+endothelium+exposed+to+disturbed+flow.">Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow.</a> Blood. 116 (15), 66-73 (2010).</li><li>Son, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atypical+mechanosensitive+microRNA-712+derived+from+pre-ribosomal+RNA+induces+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis.">The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Communications. 4, 3000 (2013).</li><li>Andueza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+reprogramming+by+disturbed+flow+revealed+by+single-cell+RNA+and+chromatin+accessibility+study.">Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study.</a> Cell Reports. 33 (11), 108491 (2020).</li><li>Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+single-cell+chromatin+analysis+with+Signac.">Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+integration+of+single-cell+data.">Comprehensive integration of single-cell data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li><li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cell+death+by+trypan+blue+uptake+and+light+microscopy.">Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+cellular+heterogeneity+of+mouse+carotid+artery+under+disturbed+flow.">Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow.</a> Cell Death and Discovery. 7 (1), 180 (2021).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+activated+cell+populations+using+single-cell+RNA-seq.">Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li><li>O'Flanagan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+solid+tumor+tissues+with+cold+active+protease+for+single-cell+RNA-seq+minimizes+conserved+collagenase-associated+stress+responses.">Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.</a> Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).</li></ol>

この論文は、マウス頸動脈から単一細胞製剤を単離するための詳細なプロトコルを提供します。PCL手術が正しく行われれば、内皮細胞に対する d-flow の影響を正確に研究することができます。外頸動脈、内頸動脈、後頭動脈、上甲状腺動脈など、一般的な頸動脈の枝を正しく識別することが重要です。超音波検査によるフローパターンの検証は、 dフロー 条件の正常な発症をさ?...

この研究室は以前、d-flowの誘導が高脂血症マウスの迅速かつ頑丈なアテローム性動脈硬化症の発症につながることを実証しました1,2。dフロー誘発性アテローム性動脈硬化症の新しいマウスモデルは、部分頸動脈結紮(PCL)手術を使用して可能でした3。PCL手術は、結紮された左頸動脈(LCA)に低振動血流状態またはdフローを誘発します。対照的に、反対側の右頸動脈(RCA)は安定した層流(s流)に直面し続けています。以前は、内皮細胞に対するd-flowの影響を理解するために、部分結紮手術後に頸動脈を解剖し、フェノールおよびグアニジンイソチオシアネートベースの溶解剤(管腔RNA/DNAフラッシング法)2,4で洗い流し、内皮に富む「プールバルク」RNAまたはDNAを提供しました。次に、これらのプールされたバルクRNAまたはDNAを、トランスクリプトーム研究またはエピゲノムDNAメチローム研究のためにそれぞれ処理した4、5、6。これらの研究は、内皮生物学とアテローム性動脈硬化症における役割が広範囲に調査された複数の流れ感受性遺伝子とマイクロRNAを発見するのに役立ちました4,6,7。
しかし、内皮濃縮にもかかわらず、これらのバルクRNA/DNA研究は、d-flow誘発性アテローム性動脈硬化症における動脈壁における各細胞タイプの特定の役割を区別することができなかった。この制限を克服するために、内皮濃縮単一細胞(sc)単離およびscRNAおよびscATACシーケンシング研究を実施しました8。このために、C57Bl6マウスは、コントロールとしてsフロー曝露RCAを使用しながら、LCAにdフローを誘導するためのPCL手術を受けました。PCL手術の2日または2週間後、マウスを屠殺し、頸動脈を解剖してクリーンアップしました。LCAとRCAの両方の内腔にコラゲナーゼを注入し、ECを有意な画分として含む管腔コラゲナーゼ消化物および他の動脈細胞を採取した。シングルセル懸濁液(scRNAseq)またはシングルヌクレイ懸濁液(scATACseq)を調製し、10倍ゲノミクスセットアップを使用して各細胞または核の一意の識別子でバーコード化しました。RNAをcDNAライブラリー調製に供し、配列決定した。
scRNAseqおよびscATACseqデータセットは、Cell Ranger Single-Cell Softwareを使用して処理され、SeuratおよびSignac Rパッケージ9,10によってさらに分析された。各細胞と核には、これらの分析から細胞タイプが割り当てられ、マーカー遺伝子と固有の遺伝子発現パターンに基づいて細胞タイプにクラスター化されました。scRNAseqおよびscATACseqの結果は、これらの単一細胞調製物がECで濃縮され、平滑筋細胞(SMC)、線維芽細胞、および免疫細胞も含むことを示しました。
さらなる分析により、管腔消化におけるEC集団は非常に発散的で可塑性(8つの異なるECクラスター)であり、血流に反応することが明らかになりました。最も重要なことは、これらの結果は、 d-flow がECをアテロームで保護された抗炎症表現型から、炎症誘発性、内皮から間葉系への移行、内皮幹/前駆細胞への移行、そして最も驚くべきことに内皮から免疫細胞への移行を含むアテローム誘発性表現型に再プログラムすることを示しました。さらに、scATACseqデータは、新しいフロー依存性のクロマチンアクセシビリティの変化と転写因子結合部位をゲノムワイドに明らかにし、いくつかの新しい仮説の基礎を形成します。マウス頸動脈から単一細胞マルチオミクス研究のための単一内皮細胞を調製するための方法論とプロトコルを以下に詳述します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (Cell Culture Grade)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21040CMX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022-43-108-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile</td>
			<td>Fablab</td>
			<td>FL4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL SuperClear Centrifuge Tubes</td>
			<td>Labcon</td>
			<td>3191-335-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk Suture Sterile</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>s-1172 c2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged</td>
			<td>Thermo Fisher Scientic</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase solution,sterile-filtered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000123/ 2000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>RXBUPRENOR5-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Controller &#38; Next GEM Accessory Kit</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#39; Reagent Kits v3.1</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2100502.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D141-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co</td>
			<td>RS-5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase1</td>
			<td>New England Biolabs Inc</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Benchtop-Model # 5425)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620444230VR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium Select</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed Angle Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>FA-45-24-11-Kit Rotor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffered saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>51558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson vet</td>
			<td>789 313 89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACs Smart Strainers (30 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (100 &#181;m)</td>
			<td>&#160;Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline (0.9% sodium chloride)</td>
			<td>Baxter International Inc</td>
			<td>2B1323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei Buffer (20x)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN 2000153/2000207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientic</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co</td>
			<td>RS-5675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-5480</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Mend II</td>
			<td>Webster Veteinanry</td>
			<td>07-856-7946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II Collagenase</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>2100502.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deposited Data</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scATACseq FastQ files</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scRNAseq FastQ files</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Ranger 3.1.0</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cicero</td>
			<td>Pliner et al., 2018</td>
			<td>https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ggplot2 v3.2.1</td>
			<td>Hadley Wickham</td>
			<td>https://cran.r-project.org</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony</td>
			<td>Korsunsky et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/immunogenomics/harmony</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Schneider et al., 2012</td>
			<td>https://imagej.nih.gov</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocle 2.8.0</td>
			<td>Qiu et al., 2017</td>
			<td>https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 3.6.2</td>
			<td>R Foundation</td>
			<td>https://www.r-project.org</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seurat 3.1.3</td>
			<td>Stuart et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/satijalab/seurat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signac 0.2.5</td>
			<td>Stuart et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/timoast/signac</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments

アテローム性動脈硬化症は、血流障害(d-flow)にさらされる動脈領域の炎症性疾患です。 D-flow は、内皮における遺伝子の発現をトランスクリプトームおよびエピゲノムレベルで調節し、動脈硬化促進反応をもたらす。最近、マウス部分頸動脈結紮(PCL)モデルを使用して、トランスクリプトミクスおよびクロマチンアクセシビリティの変化を単一細胞分解能で決定するために、シングルセルRNAシーケンシング(scRNAseq)およびシングルセルアッセイフォートランスポザーゼアクセスクロマチンシーケンシング(scATACseq)研究が実施されました。内皮細胞(EC)は動脈壁の全細胞集団のごく一部であるため、管腔消化法を使用してEC濃縮シングルセル製剤を入手しました。この研究では、マウスは、右頸動脈(RCA)を対照として使用しながら、左頸動脈(LCA)に d-flow を誘導するPCL手術を受けました。頸動脈はPCL手術の2日後または2週間後に解剖されました。各頸動脈の内腔にコラゲナーゼ消化を行い、内皮濃縮単一細胞または単一核を得た。これらの単一細胞および単一核調製物は、続いて10倍ゲノミクスマイクロ流体セットアップを使用してバーコード化されました。次に、バーコード化された単一細胞と単一核を、ハイスループットDNAシーケンサーでのRNA調製、ライブラリ生成、およびシーケンシングに利用しました。バイオインフォマティクス処理後、scRNAseqおよびscATACseqデータセットは、主にECからなる管腔消化からさまざまな細胞タイプを同定しました。平滑筋細胞、線維芽細胞、および免疫細胞も存在した。このEC濃縮法は、全動脈消化法では困難であった内皮に対する血流の影響を理解するのに役立ちました。EC濃縮シングルセル調製法は、これらの遺伝子に対する血流の影響が研究されていないECノックアウトおよびトランスジェニックマウスにおけるシングルセルオミクス研究を行うために使用できます。重要なことに、この技術は、同様の機構研究を行うために、ヒト動脈外植片からEC濃縮単一細胞を単離するように適合させることができる。

44匹のマウスで部分頸動脈結紮手術を行い、部分結紮手術の1日後に超音波検査を行うことでLCAの d-flow の発症を検証しました。部分結紮手術が成功すると、血流速度が低下し、LCA3の血流が逆転(流れが乱れる)します。頸動脈は結紮後2日または2週間で解剖した.各頸動脈の内腔にコラゲナーゼ消化を行い、内皮濃縮単細胞または単核懸濁液を調製した。細胞収率を高め?...

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Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments

我々は、1細胞オミクス実験を行うために、安定したまたは乱れた流動条件にさらされたマウス頸動脈の内腔から内皮細胞および核を単離する方法を提示する。

シングルセルマルチオミクス実験のためのマウス頸動脈内腔からの内皮細胞の単離

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in ...

血管では、内皮細胞の数が非常に少ないため、それらを研究することは困難になります。私たちのプロトコルはこの制限を排除し、新しい分子経路と治療法を研究することを可能にします。私たちのプロトコルにより、内皮濃縮サンプルを取得し、急性および慢性の乱れがこの細胞型にどのように影響するかを研究できます。内皮細胞をより詳細に研究する能力は、標的遺伝子を定義することを可能にし、したがって内皮細胞を標的とするアテローム性動脈硬化症の潜在的な治療法を可能にする。頸動脈の隔離はトリッキーであり、忍耐と経験が必要です。はじめに、1キログラムあたり0.05ミリグラムのブプレノルフィンを皮下注射することによって動物を準備します。ベタジンとイソプロパノール溶液を使用して脱毛領域を3回滅菌します。首の領域で約1センチメートルの腹側正中線切開を行います。次に、LCA分岐点を鈍的解剖によって公開します。左内頸動脈、外頸動脈、後頭動脈を6-0縫合糸で結睦し、上甲状腺動脈はそのままにします。組織接着剤または縫合糸で切開を閉じます。摂氏37度に保たれた予熱した回復ケージにマウスを移します。術後の低体温を避けるために、マウスを清潔なタオルの上に最大1時間置きます。心臓の頂点を介して左心室に接続されたIVラインに21ゲージの針を挿入します。室温で通常の生理食塩水を使用して2〜3分間逆行性灌流させます。.IVラインを注入または使用しながら安定した圧力をかけ、生理食塩水バッグを8〜9フィートの高さに保つことにより、一定の流量を維持します。頸動脈を露出させるために、すべての脂肪、筋肉、結合組織で首の領域から皮膚を取り除きます。次に、頸動脈の周りの外膜組織を取り除き、頸動脈を体に付着させます。LCAの結紮部位の下に切開を行い、灌流を可能にします。左心室を通してLCAをさらに1分間灌流して、血液の痕跡を取り除きます。頸動脈の外側を通常の生理食塩水で洗い、微量の血液を取り除きます。29ゲージの針を備えたインスリン注射器を使用して、左頸動脈の遠位端の内腔に50マイクロリットルの消化バッファーを注入します。マイクロクリップを使用して、消化バッファーで満たされた頸動脈の近位端をクランプします。15〜20マイクロリットルの消化バッファーを内腔に加え、消化バッファーの放出を避けるために遠位端をクリップします。マウスの頸動脈を、温かい摂氏37度のHEPES緩衝生理食塩水を含む35ミリメートルの皿に移します。そして断続的に揺れながら摂氏37度で45分間それらをインキュベートします。管腔酵素消化が完了した後、35ミリメートル皿からクランプで頸動脈を取り外します。消化バッファーが漏れないように、クランプを慎重に取り外します。頸動脈の一端を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブの上に保持します。インスリン注射器を備えた29ゲージの針を挿入することにより、100マイクロリットルの温かい消化バッファーを内腔に追加します。マイクロ遠心チューブ内の頸動脈の内腔をすばやく洗い流し、0.3マイクロリットルのFBSをチューブに加えて反応を停止します。マイクロ遠心チューブを氷の上に置きます。固定角ローターを備えた遠心分離機を使用して、細胞を摂氏4度で500Gで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。細胞解離試薬を含む消化バッファーに細胞を再懸濁し、摂氏37度で5分間インキュベートして単一細胞に分離します。0.5ミリリットルのチューブに0.15ミリリットルのFBSを加えて酵素反応をブロックし、遠心分離を繰り返します。上清を廃棄し、0.2ミリリットルのマイクロ遠心チューブ内のPBS中の100マイクロリットルの氷冷1%BSA溶液に細胞を再懸濁します。シングルセル解析の場合は、ペレットを100マイクロリットルの氷冷1%BSAでPBSに0.2ミリリットルのチューブに再懸濁します。単核分析では、細胞ペレットを氷冷PBS中の0.04%BSAの100マイクロリットルに再懸濁し、単一細胞懸濁液を摂氏4度で5分間500Gで遠心分離します。単一細胞懸濁液を氷冷溶解バッファーで分解し、氷上で5分間インキュベートします。ライセートをP20ピペットと混合し、さらに10分間インキュベートします。その後、ライセートを0.5ミリリットルのチューブに移します。ly細胞を500マイクロリットルのバッファーで洗浄し、ピペットを使用して混合します。その後、遠心分離を繰り返します。上清を捨て、核ペレットを150マイクロリットルの希釈核緩衝液に再懸濁した。血球計算盤を使用して単一核製剤を数えます。単一核シーケンシング研究に続いて、単一細胞および単一核が得られ、明視野顕微鏡および位相差顕微鏡によって視覚化されました。単一細胞懸濁液からの単一核調製の効率も実証された。シングルセルRNAシーケンシング研究の後、細胞あたりの遺伝子の分布、細胞あたりの一意の分子識別子、細胞あたりのミトコンドリアリード、シーケンシング飽和データなどのさまざまなパラメーターが得られました。シングルセルATAC配列研究のために、ヌクレオソームバンディングパターンを含むインサートサイズ分布は観察されなかった。正規化されたTSS濃縮スコアも観察された。さらに、パーセントフラグメントはピークで読み取ります。ピーク領域断片、TSS濃縮スコア、ブラックリストゲノムサイトにおけるリードの比率、およびヌクレオソームシグナル比を決定した。酵素消化は細胞にとってストレスであるため、サンプルを氷上に維持し、できるだけ早く手順を実行することが重要です。この方法を使用して、マウスから内皮細胞を取得し、プレート化することができます。この手法を使用して、バルクOmixベースの研究を実行することもできます。この技術は、生体内の内皮細胞に対する血流障害の影響を単一細胞様式で研究するための道を開いた。

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

弁内皮細胞の単離

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

マウスの眼から網膜幹細胞の単離

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

新生児マウスからの肺血管内皮細胞の単離と培養

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

人工多能性幹細胞に由来するマウスの作製

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

マウス抵抗動脈から毛細血管内皮の管の隔離

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

ネズミ弁内皮細胞の単離

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

マウス大動脈内皮細胞の単離および初代培養

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

マウスの冠動脈内皮細胞の単離

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

マウス初代肝臓正弦波内皮細胞の単離と特性評価

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

蛍光ミトコンドリアによる条件付き不死化マウス糸球体内皮細胞の単離

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...