Name: isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments
Uploaded: 2021-10-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments at JoVE.com

이 작업은 국립 보건원 보조금 HL119798, HL095070 및 HL139757에서 HJ에 대한 자금으로 지원되었습니다. HJ는 또한 Wallace H. Coulter Distinguished Faculty Chair Professorship의 지원을 받고 있습니다. Emory Integrated Genomics Core (EIGC)가 제공 한 서비스는 Emory University School of Medicine의 보조금을 받았으며 National Institutes of Health의 Georgia Clinical and Translational Science Alliance에서도 부분적으로 지원되었습니다. UL1TR002378. 위에 제공된 내용은 전적으로 저자의 책임이며 국립 보건원의 공식 견해를 반영하지 않습니다.

아래에 설명 된 모든 동물 절차는 Emory University의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 비 고 콜레스테롤 혈증, 연령 및 성별 일치 C57BL / 6 마우스를 사용하여 성별에 따른 변이를 완화하고 고 콜레스테롤 혈증 상태의 합병증을 상쇄했습니다.
1. 부분 경동맥 결찰 (PCL) 수술
참고: LCA의 부분 경동맥 결찰은 이전에 기술되고 입증된 바와 같이 수?...

<ol>
	<li>Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+atherosclerosis+development+in+C57Bl6+mice+by+overexpressing+AAV-mediated+PCSK9+and+partial+carotid+ligation.">Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation.</a> Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).</li><li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+carotid+ligation+is+a+model+of+acutely+induced+disturbed+flow,+leading+to+rapid+endothelial+dysfunction+and+atherosclerosis.">Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).</li><li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+disturbed+flow-induced+atherosclerosis+in+mouse+carotid+artery+by+partial+ligation+and+a+simple+method+of+RNA+isolation+from+carotid+endothelium.">A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861 (2010).</li><li>Dunn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-dependent+epigenetic+DNA+methylation+regulates+endothelial+gene+expression+and+atherosclerosis.">Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).</li><li>Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-dependent+regulation+of+genome-wide+mRNA+and+microRNA+expression+in+endothelial+cells+in+vivo.">Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo.</a> Scientific Data. 1 (1), 140039 (2014).</li><li>Ni, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+novel+mechanosensitive+genes+in+vivo+using+mouse+carotid+artery+endothelium+exposed+to+disturbed+flow.">Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow.</a> Blood. 116 (15), 66-73 (2010).</li><li>Son, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atypical+mechanosensitive+microRNA-712+derived+from+pre-ribosomal+RNA+induces+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis.">The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Communications. 4, 3000 (2013).</li><li>Andueza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+reprogramming+by+disturbed+flow+revealed+by+single-cell+RNA+and+chromatin+accessibility+study.">Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study.</a> Cell Reports. 33 (11), 108491 (2020).</li><li>Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+single-cell+chromatin+analysis+with+Signac.">Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+integration+of+single-cell+data.">Comprehensive integration of single-cell data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li><li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cell+death+by+trypan+blue+uptake+and+light+microscopy.">Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+cellular+heterogeneity+of+mouse+carotid+artery+under+disturbed+flow.">Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow.</a> Cell Death and Discovery. 7 (1), 180 (2021).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+activated+cell+populations+using+single-cell+RNA-seq.">Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li><li>O'Flanagan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+solid+tumor+tissues+with+cold+active+protease+for+single-cell+RNA-seq+minimizes+conserved+collagenase-associated+stress+responses.">Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.</a> Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).</li></ol>

이 논문은 마우스 경동맥에서 단일 세포 제제를 분리하는 자세한 프로토콜을 제공합니다. PCL 수술이 올바르게 수행되면 내피 세포에 대한 d-flow 의 영향을 정확하게 연구 할 수 있습니다. 외경동맥, 내경동맥, 후두동맥 및 상갑상선동맥과 같은 총경동맥의 가지를 정확하게 식별하는 것이 중요합니다. 초음파 검사에 의한 유동 패턴의 검증은 d-flow 조건의 성공적인 시작을 더욱 검증합?...

이 실험실은 이전에 d-flow의 유도가 고지혈증 마우스 1,2에서 빠르고 견고한 죽상 동맥 경화증 발달로 이어진다는 것을 입증했습니다. d-flow-유도 죽상동맥경화증의 새로운 마우스 모델은 부분 경동맥 결찰(PCL) 수술을 사용하여 가능했습니다3. PCL 수술은 결찰된 좌경동맥(LCA)에서 낮고 진동적인 혈류 상태 또는 d-flow를 유도합니다. 대조적으로, 반대쪽 우경동맥(RCA)은 계속해서 안정적인 층류(s-flow)에 직면합니다. 이전에는 내피 세포에 대한 d-flow의 효과를 이해하기 위해 부분 결찰 수술 후 경동맥을 해부하고 페놀 및 구아니딘 이소티오시아네이트 기반 용해제(내막 RNA/DNA 플러싱 방법)2,4로 플러싱하여 내피가 풍부한 "풀링된 벌크" RNA 또는 DNA를 제공했습니다. 이러한 풀링된 벌크 RNA 또는 DNA는 전사체 연구 또는 후성유전체 DNA 메틸롬 연구를 위해 각각 4,5,6으로 처리되었습니다. 이 연구는 내피 생물학 및 죽상 동맥 경화증에서 역할이 광범위하게 조사 된 여러 흐름에 민감한 유전자와 microRNA를 발견하는 데 도움이되었습니다 4,6,7.
그러나 내피 농축에도 불구하고 이러한 대량 RNA / DNA 연구는 d- 흐름 유발 죽상 동맥 경화증에서 동맥벽에서 각 세포 유형의 특정 역할을 구별 할 수 없었습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 내피-농축 단일세포(sc) 분리 및 scRNA 및 scATAC 시퀀싱 연구가 수행되었다8. 이를 위해, C57Bl6 마우스는 s-flow가 노출된 RCA를 대조군으로 사용하면서 LCA에서 d-flow를 유도하기 위해 PCL 수술을 실시하였다. PCL 수술 2 일 또는 2 주 후, 마우스를 희생시키고 경동맥을 해부하고 청소했습니다. LCA와 RCA의 내강에는 콜라게나 제가 주입되었고, ECs를 중요한 분획으로 함유하는 내강 콜라게나제 소화물과 다른 동맥 세포가 수집되었습니다. 단일 세포 현탁액(scRNAseq) 또는 단일 핵 현탁액(scATACseq)을 준비하고 10x Genomics 설정을 사용하여 각 세포 또는 핵에 대한 고유 식별자로 바코드화했습니다. RNA를 cDNA 라이브러리 제조를 실시하고 시퀀싱하였다.
scRNAseq 및 scATACseq 데이터 세트는 Cell Ranger Single-Cell Software를 사용하여 처리되었으며 Surat 및 Signac R 패키지 9,10에 의해 추가로 분석되었습니다. 각 세포와 핵은 이러한 분석으로부터 세포 유형을 할당하고 마커 유전자 및 고유 한 유전자 발현 패턴을 기반으로 세포 유형으로 클러스터링되었습니다. scRNAseq 및 scATACseq의 결과는 이러한 단일 세포 제제가 EC가 풍부하고 평활근 세포 (SMC), 섬유 아세포 및 면역 세포를 포함한다는 것을 입증했습니다.
추가 분석에 따르면 내강 소화의 EC 개체군은 매우 발산하고 플라스틱 (8 개의 다른 EC 클러스터)이며 혈류에 반응합니다. 가장 중요한 것은 이러한 결과가 d-flow 가 EC를 죽상 보호 항염증 표현형에서 전염증, 내피에서 중간엽으로의 전이, 내피 줄기/전구 세포 전이, 그리고 가장 놀랍게도 내피에서 면역 세포로의 유사 전이를 포함한 전이동맥 보호 항염증 표현형에서 전이형 동맥경화성 표현형으로 재프로그래밍한다는 것을 입증했습니다. 또한 scATACseq 데이터는 새로운 흐름 의존적 염색질 접근성 변화 및 전사 인자 결합 부위를 게놈 전반에 걸친 방식으로 밝혀 몇 가지 새로운 가설의 기초를 형성합니다. 마우스 경동맥으로부터의 단일 세포 다중 오믹스 연구를 위한 단일 내피 세포를 제조하기 위한 방법론 및 프로토콜은 아래에 자세히 설명되어 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (Cell Culture Grade)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21040CMX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022-43-108-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile</td>
			<td>Fablab</td>
			<td>FL4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL SuperClear Centrifuge Tubes</td>
			<td>Labcon</td>
			<td>3191-335-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk Suture Sterile</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>s-1172 c2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged</td>
			<td>Thermo Fisher Scientic</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase solution,sterile-filtered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000123/ 2000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>RXBUPRENOR5-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Controller &#38; Next GEM Accessory Kit</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#39; Reagent Kits v3.1</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2100502.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D141-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co</td>
			<td>RS-5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase1</td>
			<td>New England Biolabs Inc</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Benchtop-Model # 5425)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620444230VR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium Select</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed Angle Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>FA-45-24-11-Kit Rotor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffered saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>51558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson vet</td>
			<td>789 313 89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACs Smart Strainers (30 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (100 &#181;m)</td>
			<td>&#160;Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline (0.9% sodium chloride)</td>
			<td>Baxter International Inc</td>
			<td>2B1323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei Buffer (20x)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN 2000153/2000207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientic</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co</td>
			<td>RS-5675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-5480</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Mend II</td>
			<td>Webster Veteinanry</td>
			<td>07-856-7946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II Collagenase</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>2100502.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deposited Data</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scATACseq FastQ files</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scRNAseq FastQ files</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Ranger 3.1.0</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cicero</td>
			<td>Pliner et al., 2018</td>
			<td>https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ggplot2 v3.2.1</td>
			<td>Hadley Wickham</td>
			<td>https://cran.r-project.org</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony</td>
			<td>Korsunsky et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/immunogenomics/harmony</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Schneider et al., 2012</td>
			<td>https://imagej.nih.gov</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocle 2.8.0</td>
			<td>Qiu et al., 2017</td>
			<td>https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 3.6.2</td>
			<td>R Foundation</td>
			<td>https://www.r-project.org</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seurat 3.1.3</td>
			<td>Stuart et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/satijalab/seurat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signac 0.2.5</td>
			<td>Stuart et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/timoast/signac</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments

죽상 동맥 경화증은 방해받은 혈류 (d- 흐름)에 노출 된 동맥 부위의 염증성 질환입니다. D-flow 는 전사체 및 후성유전체 수준에서 내피의 유전자 발현을 조절하여 전동맥경화 반응을 일으킵니다. 최근에는 마우스 부분 경동맥 결찰(PCL) 모델을 사용하여 단일 세포 분해능에서 전사체 및 염색질 접근성 변화를 결정하기 위해 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNAseq) 및 트랜스포아제 접근 가능한 염색질 시퀀싱을 위한 단일 세포 분석(scATACseq) 연구가 수행되었습니다. 내피 세포 (ECs)는 동맥벽의 전체 세포 집단의 작은 부분을 나타내기 때문에 내강 분해 방법을 사용하여 EC가 풍부한 단일 세포 제제를 얻었습니다. 이 연구를 위해 마우스는 오른쪽 경동맥 (RCA)을 대조군으로 사용하면서 왼쪽 경동맥 (LCA)에서 d- 흐름을 유도하기 위해 PCL 수술을 받았다. 경동맥은 PCL 수술 후 2일 또는 2주 후에 해부되었다. 각 경동맥의 내강을 콜라게나제 소화를 거쳐 내피가 풍부한 단일 세포 또는 단일 핵을 얻었다. 이러한 단일 세포 및 단일 핵 제제는 이후 10x Genomics 미세유체 설정을 사용하여 바코드화되었습니다. 그런 다음 바코드된 단일 세포 및 단일 핵을 고처리량 DNA 시퀀서에서 RNA 준비, 라이브러리 생성 및 시퀀싱에 활용했습니다. 생물정보학 처리 후 scRNAseq 및 scATACseq 데이터 세트는 주로 EC로 구성된 내강 분해에서 다양한 세포 유형을 식별했습니다. 평활근 세포, 섬유 아세포 및 면역 세포도 존재했습니다. 이 EC 농축 방법은 전체 동맥 소화 방법으로는 어려울 수 있는 혈류가 내피에 미치는 영향을 이해하는 데 도움이 되었습니다. EC 농축 단일 세포 준비 방법은 이러한 유전자에 대한 혈류의 영향이 연구되지 않은 EC- 녹아웃 및 형질 전환 마우스에서 단일 세포 체학 연구를 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 중요하게도, 이 기술은 유사한 기계론적 연구를 수행하기 위해 인간 동맥 외식편으로부터 EC가 풍부한 단일 세포를 분리하도록 조정될 수 있다.

부분 경동맥 결찰 수술은 44 마리의 마우스에서 수행되었으며, 부분 결찰 수술 후 하루 동안 초음파 검사를 수행하여 LCA에서 d- 흐름 의 시작을 검증했습니다. 성공적인 부분 결찰 수술은 LCA3에서 혈류 속도를 감소시키고 혈류 (방해 된 흐름)를 역전시킵니다. 경동맥은 결찰 후 2일 또는 2주에 해부되었습니다. 각 경동맥의 내강을 콜라게나제 소화를 실시하고, 내피가 풍부한...

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Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments

우리는 단일 세포 체학 실험을 수행하기 위해 안정하거나 방해받는 흐름 조건에 노출 된 마우스 경동맥의 내강에서 내피 세포와 핵을 분리하는 방법을 제시합니다.

단일 세포 다중 오믹스 실험을 위한 마우스 경동맥 내강에서 내피 세포 분리

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in ...

혈관에서는 내피 세포의 수가 매우 적어 연구하기가 어렵습니다. 우리의 프로토콜은 이러한 한계를 제거하고 새로운 분자 경로와 치료법을 연구 할 수있게합니다. 우리의 프로토콜을 통해 내피가 풍부한 샘플을 얻고 급성 및 만성 교란 흐름이이 세포 유형에 어떤 영향을 미치는지 연구 할 수 있습니다.내피 세포를보다 자세히 연구 할 수있는 능력은 표적 유전자를 정의 할 수있게하고, 따라서 내피 세포를 표적으로하는 죽상 동맥 경화증에 대한 잠재적 인 치료제를 정의 할 수 있습니다. 경동맥 격리는 까다 롭고 인내와 경험이 필요합니다. 시작하려면 부 프레 노르 핀 킬로그램 당 0.05 밀리그램을 피하에 주사하여 동물을 준비하십시오.Betadine과 이소프로판올 용액을 사용하여 제모 된 부위를 3 회 멸균하십시오. 목 부위에서 약 1cm의 복부 정중선 절개를하십시오. 그런 다음 무딘 해부로 LCA 분기점을 노출시킵니다.왼쪽 내경동맥, 외경동맥 및 후두동맥을 6-0 봉합사로 결찰하여 상갑상선 동맥을 그대로 둡니다. 조직 접착제 또는 봉합사로 절개를 닫으십시오. 마우스를 섭씨 37도로 유지되는 예열된 복구 케이지로 옮깁니다.수술 후 저체온증을 피하기 위해 마우스를 깨끗한 수건에 최대 1시간 동안 두십시오. 심장의 정점을 통해 좌심실로 연결된 IV 라인에 21 게이지 바늘을 삽입합니다. 실온에서 일반 식염수를 사용하여 2-3분 동안 역행 관류를 허용합니다.IV 라인을 주입하거나 사용하는 동안 일정한 압력을 가하고 식염수 백을 8-9 피트 높이로 유지하여 일정한 유속을 유지하십시오. 모든 지방, 근육 및 결합 조직으로 목 부위의 피부를 제거하여 경동맥을 노출시킵니다. 그런 다음 경동맥 주위의 외막 주위 조직을 제거하여 경동맥이 몸에 붙어 있습니다.관류를 허용하기 위해 LCA의 결찰 부위 아래에 절개를하십시오. 좌심실을 통해 LCA를 1 분 더 관류하여 혈액 흔적을 제거하십시오. 경동맥 외부를 일반 식염수로 씻어 혈액의 흔적을 제거하십시오.29 게이지 바늘이있는 인슐린 주사기를 사용하여 50 마이크로 리터의 소화 완충액을 왼쪽 경동맥 말단부 내강에 주입하십시오. 마이크로 클립을 사용하여 소화 완충액으로 채워진 경동맥의 근위 끝을 고정하십시오. 15 내지 20 마이크로리터의 소화 완충액을 내강에 첨가하고, 소화 완충액의 방출을 피하기 위해 말단부를 클립한다.마우스의 경동맥을 섭씨 37도의 따뜻한 hepes 완충 식염수가 들어 있는 35mm 접시로 옮깁니다. 그리고 간헐적 인 흔들림으로 섭씨 37도에서 45 분 동안 배양하십시오. 내강 효소 소화가 완료된 후 35mm 접시에서 클램프로 경동맥을 제거하십시오.소화 완충액이 누출되지 않도록 클램프를 조심스럽게 분리하십시오. 경동맥의 한쪽 끝을 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브 위에 놓습니다. 인슐린 주사기가 장착 된 100 게이지 바늘을 삽입하여 29 마이크로 리터의 따뜻한 소화 완충액을 루멘에 첨가하십시오.마이크로 원심 분리 튜브에서 경동맥 내강을 빠르게 세척 한 다음 0.3 마이크로 리터의 FBS를 튜브에 추가하여 반응을 중지합니다. 마이크로 원심 분리기 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 500G에서 원심분리하고, 고정각 로터가 장착된 원심분리기를 사용하여 상층액을 버린다.세포 해리 시약이 들어있는 소화 완충액에 세포를 다시 현탁시키고 섭씨 37도에서 5 분 동안 배양하여 단일 세포로 분리합니다. 0.5 밀리리터 튜브에 FBS 0.15 밀리리터를 첨가하여 효소 반응을 차단하고 원심분리를 반복한다. 상청액을 버리고 0.2 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브의 PBS 중 100 마이크로 리터의 얼음처럼 차가운 1 % BSA 용액에 세포를 재현 탁시킵니다.단일 세포 분석을 위해 0.2 밀리리터 튜브의 PBS에 100 마이크로 리터의 얼음처럼 차가운 1 % BSA로 펠릿을 재현탁하십시오. 단일 핵 분석을 위해 얼음처럼 차가운 PBS에서 0.04% BSA의 100마이크로리터에 세포 펠릿을 재현탁하고 섭씨 4도에서 500G에서 5분 동안 단일 세포 현탁액을 원심분리합니다. 단일 세포 현탁액을 얼음 냉장 용해 완충액으로 분해하고, 얼음 상에서 5분 동안 배양한다.용해물을 P20 피펫과 혼합하고 10분 더 배양합니다. 그 후, 용해물을 0.5 밀리리터 튜브로 옮깁니다. ly 세포를 500 마이크로리터의 완충액으로 세척하고, 피펫을 사용하여 혼합한다.그런 다음 원심 분리를 반복하십시오. 상청액을 버리고, 희석된 핵 완충액의 150 마이크로리터에 핵 펠릿을 재현탁시킨다. 혈구계를 사용하여 단일 핵 제제를 세십시오.단일 핵 시퀀싱 연구에 이어 명시야 및 위상차 현미경으로 단일 세포 및 단일 핵을 얻고 시각화했습니다. 단일 세포 현탁액으로부터 단일 핵 준비의 효율성이 또한 입증되었다. 단일 세포 RNA 시퀀싱 연구 후, 세포 당 유전자 분포, 세포 당 고유 한 분자 식별자, 세포 당 미토콘드리아 판독 및 시퀀싱 포화 데이터와 같은 다양한 매개 변수가 얻어졌습니다.단일 세포 ATAC 서열 연구를 위해, 뉴클레오솜 밴딩 패턴을 포함한 삽입 크기 분포가 관찰되었다. 정규화된 TSS 농축 점수도 관찰되었다. 또한 백분율 조각은 피크에서 읽습니다.피크 영역 단편, TSS 농축 점수, 블랙리스트 게놈 부위에서의 판독 비율, 및 뉴클레오솜 신호 비율을 결정하였다. 효소 소화는 세포에 대한 스트레스이므로 샘플을 얼음 위에 유지하고 가능한 한 빨리 절차를 수행하는 것이 중요합니다. 이 방법을 사용하여 마우스에서 내피 세포를 얻고 플레이트할 수 있습니다.이 기술을 사용하여 대량 Omix 기반 연구를 수행 할 수도 있습니다. 이 기술은 단일 세포 방식으로 생체 내 내피 세포에 대한 교란 된 혈류의 영향을 연구하기위한 길을 열었습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

판막병 내피 세포의 분리

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

연구

생물학

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

마우스 아이의 망막 줄기 세포의 분리

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

신생아 마우스의 폐 내피 세포의 분리 및 문화

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

마우스 저항 동맥의 미세 혈관 내피 튜브의 분리

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

쥐과 밸브 내피 세포의 분리

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

마우스 관상 내피 세포의 분리

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

마우스 일차 간 정현파 내피 세포의 분리 및 특성화

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

형광 미토콘드리아를 이용한 조건부 불멸화 마우스 사구체 내피 세포의 분리

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...