Name: isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments
Uploaded: 2021-10-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra National Institutes of Health tilskudd HL119798, HL095070 og HL139757 til HJ. HJ støttes også av Wallace H. Coulter Distinguished Faculty Chair Professorship. Tjenestene som tilbys av Emory Integrated Genomics Core (EIGC) ble subsidiert av Emory University School of Medicine og ble også delvis støttet av Georgia Clinical and Translational Science Alliance of the National Institutes of Health under pris nr. UL1TR002378. Innholdet ovenfor er utelukkende forfatternes ansvar og gjenspeiler ikke de offisielle synspunktene til National Institutes of Health.

Alle dyreprosedyrer beskrevet nedenfor ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Emory University. Ikke-hyperkolesterolemiske, alders- og kjønnsmatchede C57BL/6-mus ble brukt til å redusere kjønnsavhengig variasjon og oppveie eventuelle komplikasjoner ved hyperkolesterolemiske tilstander.
1. Delvis carotis ligering (PCL) kirurgi
MERK: Partiell ligering av LCA i halspulsåren ble utført som tidligere beskrevet og vist3....

<ol>
	<li>Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+atherosclerosis+development+in+C57Bl6+mice+by+overexpressing+AAV-mediated+PCSK9+and+partial+carotid+ligation.">Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation.</a> Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).</li><li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+carotid+ligation+is+a+model+of+acutely+induced+disturbed+flow,+leading+to+rapid+endothelial+dysfunction+and+atherosclerosis.">Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).</li><li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+disturbed+flow-induced+atherosclerosis+in+mouse+carotid+artery+by+partial+ligation+and+a+simple+method+of+RNA+isolation+from+carotid+endothelium.">A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861 (2010).</li><li>Dunn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-dependent+epigenetic+DNA+methylation+regulates+endothelial+gene+expression+and+atherosclerosis.">Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).</li><li>Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-dependent+regulation+of+genome-wide+mRNA+and+microRNA+expression+in+endothelial+cells+in+vivo.">Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo.</a> Scientific Data. 1 (1), 140039 (2014).</li><li>Ni, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+novel+mechanosensitive+genes+in+vivo+using+mouse+carotid+artery+endothelium+exposed+to+disturbed+flow.">Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow.</a> Blood. 116 (15), 66-73 (2010).</li><li>Son, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atypical+mechanosensitive+microRNA-712+derived+from+pre-ribosomal+RNA+induces+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis.">The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Communications. 4, 3000 (2013).</li><li>Andueza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+reprogramming+by+disturbed+flow+revealed+by+single-cell+RNA+and+chromatin+accessibility+study.">Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study.</a> Cell Reports. 33 (11), 108491 (2020).</li><li>Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+single-cell+chromatin+analysis+with+Signac.">Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+integration+of+single-cell+data.">Comprehensive integration of single-cell data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li><li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cell+death+by+trypan+blue+uptake+and+light+microscopy.">Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+cellular+heterogeneity+of+mouse+carotid+artery+under+disturbed+flow.">Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow.</a> Cell Death and Discovery. 7 (1), 180 (2021).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+activated+cell+populations+using+single-cell+RNA-seq.">Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li><li>O'Flanagan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+solid+tumor+tissues+with+cold+active+protease+for+single-cell+RNA-seq+minimizes+conserved+collagenase-associated+stress+responses.">Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.</a> Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).</li></ol>

Dette papiret gir en detaljert protokoll for å isolere enkeltcellepreparater fra musens karoten arterier. Påvirkningen av d-strømning på endotelcellene kan studeres nøyaktig hvis PCL-operasjonen utføres riktig. Det er avgjørende å korrekt identifisere grenene av den vanlige carotis, slik som den eksterne carotis, indre carotis, occipital arterie, og overlegen thyroid arterie. Validering av strømningsmønstre ved ultralyd validerer ytterligere det vellykkede utbruddet av d-strømningsforhold . S...

Dette laboratoriet har tidligere vist at induksjon av d-flow fører til rask og robust ateroskleroseutvikling hos hyperlipidemiske mus 1,2. Den nye musemodellen av d-flow-indusert aterosklerose var mulig ved bruk av partiell carotisligasjon (PCL) kirurgi 3. PCL-kirurgi induserer lav og oscillerende blodstrømstilstand eller d-strømning i den ligerte venstre halspulsåren (LCA). I motsetning til dette fortsetter den kontralaterale høyre halspulsåren (RCA) å møte stabil laminær strømning (s-flow). Tidligere, for å forstå effekten av d-flow på endotelceller, ble halspulsårene dissekert ut etter delvis ligeringskirurgi og skyllet med et fenol- og guanidinisotiocyanatbasert lysingsmiddel (luminal RNA / DNA-spylemetode)2,4, som ga endotelberiket "pooled bulk" RNA eller DNA. Disse samlede bulk-RNA-ene eller DNA-ene ble deretter behandlet for transkriptomiske studier eller epigenomiske DNA-metylomstudier, henholdsvis 4,5,6. Disse studiene bidro til å oppdage flere strømningsfølsomme gener og mikroRNA hvis roller i endotelbiologi og aterosklerose ble grundig undersøkt 4,6,7.
Til tross for endotelberikelse, kunne disse bulk RNA / DNA-studiene imidlertid ikke skille den spesifikke rollen til hver celletype i arterieveggen i d-flow-indusert aterosklerose. Endotelberiket enkeltcelleisolasjon (sc) og scRNA- og scATAC-sekvenseringsstudier ble utført for å overvinne denne begrensningen8. For dette ble C57Bl6-mus utsatt for PCL-kirurgi for å indusere d-flow i LCA mens de brukte s-flow-eksponert RCA som kontroll. To dager eller to uker etter PCL-operasjonen ble musene ofret, og carotisene ble dissekert og ryddet opp. Lumen i både LCA og RCA ble infundert med kollagenase, og luminal kollagenasefordøyelser som inneholdt ECs som en signifikant fraksjon og andre arterielle celler ble samlet inn. Enkeltcellesuspensjonen (scRNAseq) eller enkeltkjernesuspensjonen (scATACseq) ble fremstilt og strekkodet med unike identifikatorer for hver celle eller kjerne ved hjelp av et 10x Genomics-oppsett. RNA-ene ble utsatt for cDNA-bibliotekforberedelse og sekvensert.
ScRNAseq- og scATACseq-datasettene ble behandlet ved hjelp av Cell Ranger Single-Cell Software og videre analysert av Seurat og Signac R-pakke 9,10. Hver celle og kjerne ble tildelt en celletype fra disse analysene og gruppert i celletypen basert på markørgenene og unike genuttrykksmønstre. Resultatene av scRNAseq og scATACseq viste at disse enkeltcellepreparatene er beriket med ECs og inneholder også glatte muskelceller (SMC), fibroblaster og immunceller.
Videre analyse viste at EC-populasjonen i luminalfordøyelsen er svært divergerende og plastisk (8 forskjellige EC-klynger) og reagerer på blodstrømmen. Viktigst, disse resultatene viste at d-flow omprogrammerer ECs fra en atherobeskyttet antiinflammatorisk fenotype til pro-atherogene fenotyper, inkludert proinflammatorisk, endotel-til-mesenkymal overgang, endotelstamme / stamcelleovergang, og mest overraskende, endotel-til-immuncelle-lignende overgang. I tillegg avslører scATACseq-data nye flytavhengige kromatintilgjengelighetsendringer og transkripsjonsfaktorbindingssteder på en genomomfattende måte, som danner grunnlaget for flere nye hypoteser. Metodikken og protokollen for fremstilling av enkeltendotelceller for enkeltcellede multi-omics-studier fra musens karoten arterier er beskrevet nedenfor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (Cell Culture Grade)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21040CMX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022-43-108-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile</td>
			<td>Fablab</td>
			<td>FL4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL SuperClear Centrifuge Tubes</td>
			<td>Labcon</td>
			<td>3191-335-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk Suture Sterile</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>s-1172 c2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged</td>
			<td>Thermo Fisher Scientic</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase solution,sterile-filtered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000123/ 2000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>RXBUPRENOR5-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Controller &#38; Next GEM Accessory Kit</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#39; Reagent Kits v3.1</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2100502.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D141-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co</td>
			<td>RS-5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase1</td>
			<td>New England Biolabs Inc</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Benchtop-Model # 5425)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620444230VR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium Select</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed Angle Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>FA-45-24-11-Kit Rotor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffered saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>51558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson vet</td>
			<td>789 313 89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACs Smart Strainers (30 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (100 &#181;m)</td>
			<td>&#160;Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline (0.9% sodium chloride)</td>
			<td>Baxter International Inc</td>
			<td>2B1323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei Buffer (20x)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN 2000153/2000207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientic</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co</td>
			<td>RS-5675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-5480</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Mend II</td>
			<td>Webster Veteinanry</td>
			<td>07-856-7946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II Collagenase</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>2100502.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deposited Data</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scATACseq FastQ files</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scRNAseq FastQ files</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Ranger 3.1.0</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cicero</td>
			<td>Pliner et al., 2018</td>
			<td>https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ggplot2 v3.2.1</td>
			<td>Hadley Wickham</td>
			<td>https://cran.r-project.org</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony</td>
			<td>Korsunsky et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/immunogenomics/harmony</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Schneider et al., 2012</td>
			<td>https://imagej.nih.gov</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocle 2.8.0</td>
			<td>Qiu et al., 2017</td>
			<td>https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 3.6.2</td>
			<td>R Foundation</td>
			<td>https://www.r-project.org</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seurat 3.1.3</td>
			<td>Stuart et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/satijalab/seurat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signac 0.2.5</td>
			<td>Stuart et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/timoast/signac</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments

Aterosklerose er en inflammatorisk sykdom i arterielle områder utsatt for forstyrret blodstrøm (d-flow). D-flow regulerer ekspresjonen av gener i endotelet på transkriptomiske og epigenomiske nivåer, noe som resulterer i proatherogene responser. Nylig ble enkeltcellet RNA-sekvensering (scRNAseq) og enkeltcelleanalyse for transposasetilgjengelig kromatinsekvensering (scATACseq) studier utført for å bestemme transkripsjons- og kromatintilgjengelighetsendringene ved en enkeltcelleoppløsning ved bruk av musens partielle karotisligeringsmodell (PCL). Siden endotelceller (ECs) representerer en mindre del av de totale cellepopulasjonene i arterieveggen, ble det brukt en luminal fordøyelsesmetode for å oppnå EC-berikede enkeltcellepreparater. For denne studien ble mus utsatt for PCL-kirurgi for å indusere d-strømning i venstre halspulsåren (LCA) mens de brukte høyre halspulsåren (RCA) som en kontroll. Karoten arterier ble dissekert ut to dager eller to uker etter PCL-kirurgi. Lumen av hver karoten ble utsatt for kollagenasefordøyelse, og endotelberikede enkeltceller eller enkeltkjerner ble oppnådd. Disse enkeltcellede og enkeltkjernepreparatene ble deretter strekkodet ved hjelp av et 10x Genomics mikrofluidisk oppsett. De strekkodede enkeltcellene og enkeltkjernene ble deretter brukt til RNA-forberedelse, bibliotekgenerering og sekvensering på en DNA-sequencer med høy gjennomstrømning. Etter bioinformatikkbehandling identifiserte datasettene scRNAseq og scATACseq forskjellige celletyper fra luminal fordøyelse, hovedsakelig bestående av ECs. Glatte muskelceller, fibroblaster og immunceller var også til stede. Denne EC-anrikningsmetoden hjalp til med å forstå effekten av blodstrømmen på endotelet, noe som kunne ha vært vanskelig med den totale arteriefordøyelsesmetoden. Den EC-berikede enkeltcellepreparasjonsmetoden kan brukes til å utføre enkeltcellede omics-studier i EC-knockouts og transgene mus der effekten av blodstrømmen på disse genene ikke er studert. Det er viktig at denne teknikken kan tilpasses for å isolere EC-berikede enkeltceller fra humane arterieplanter for å utføre lignende mekanistiske studier.

Partielle carotisligasjonsoperasjoner ble utført på 44 mus, og debut av d-flow i LCA ble validert ved å utføre ultralyd en dag etter partiell ligeringskirurgi. Vellykket delvis ligeringskirurgi forårsaker redusert blodstrømningshastighet og reverserer blodstrømmen (forstyrret strømning) i LCA3. Halspulsårene ble dissekert ut enten to dager eller to uker etter ligasjon. Lumen av hver carotis ble utsatt for kollagenasefordøyelse, og endotelberikede enkeltceller eller enkeltkjernes...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments at JoVE.com

Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments

Vi presenterer en metode for å isolere endotelceller og kjerner fra lumen i halspulsårene hos mus utsatt for stabile eller forstyrrede strømningsforhold for å utføre encellede omics-eksperimenter.

Isolering av endotelceller fra lumen av musens karoten arterier for enkeltcellede multi-omics-eksperimenter

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in ...

I et blodkar er antall endotelceller svært lavt, noe som gjør det vanskelig å studere dem. Vår protokoll eliminerer denne begrensningen, og lar oss studere nye molekylære veier og terapier. Vår protokoll tillater oss å oppnå endotelberikede prøver, og studere hvordan akutt og kronisk forstyrret strømning påvirker denne celletypen.Evnen til å studere endotelceller mer detaljert gjør det mulig å definere målgener, og dermed potensielle terapier for aterosklerose rettet mot endotelceller. Halspulsåren isolasjon er vanskelig, og krever tålmodighet og erfaring. Til å begynne med, forberede dyret ved å injisere 0,05 milligram per kilo buprenorfin subkutant.Steriliser det epilerte området ved hjelp av Betadin og isopropanoloppløsning tre ganger. Lag et ventralt midtlinjesnitt på omtrent en centimeter i nakkeområdet. Utsett deretter LCA-grenpunktet ved stump disseksjon.Ligate venstre indre carotis, ekstern carotis og occipital arterier med 6-0 suturer, slik at den overlegne thyroid arterien uberørt. Lukk snittet med vevslim eller suturer. Overfør musen til et forvarmet gjenopprettingsbur holdt på 37 grader Celsius.Plasser musen på et rent håndkle i opptil en time for å unngå hypotermi etter operasjonen. Sett en 21 gauge nål inn i IV-linjen som er koblet gjennom hjertets topp inn i venstre ventrikel. Tillat retrograd perfusjon i to til tre minutter ved bruk av vanlig saltvann ved romtemperatur.Oppretthold en konstant strømningshastighet ved å påføre jevnt trykk mens du injiserer eller bruker en IV-linje, og hold saltvannsposen i en høyde på åtte til ni fot. Fjern huden fra nakkeområdet med alt fett, muskler og bindevev for å eksponere halspulsårene. Fjern deretter periadventitialvevet rundt karoten og la karoten være festet til kroppen.Gjør et snitt under ligeringsstedet i LCA for å tillate perfusjon. Perfuse LCA gjennom venstre ventrikel i ytterligere ett minutt for å fjerne eventuelle blodspor. Vask utsiden av halspulsårene med normal saltoppløsning for å fjerne spor av blod.Bruk en insulin sprøyte med en 29 gauge nål for å injisere 50 mikroliter fordøyelsen buffer inn i lumen av den distale enden av venstre halspulsåren. Bruk en mikroklips til å klemme den proksimale enden av halspulsåren fylt med fordøyelsesbuffer. Tilsett 15 til 20 mikroliter fordøyelsesbuffer i lumen, og klipp den distale enden for å unngå frigjøring av fordøyelsesbuffer.Overfør halspulsårene fra musen til 35 millimeter retter som inneholder varm 37 grader Celsius HEPES bufret saltoppløsning. Og inkubere dem i 45 minutter ved 37 grader Celsius med intermitterende rocking. Fjern halspulsåren med klemmene fra 35 millimeter parabolen etter at luminal enzymatisk fordøyelse er fullført.Løsne klemmene forsiktig, slik at fordøyelsesbufferen ikke lekker. Hold den ene enden av halspulsåren på toppen av et 1,5 milliliter mikrosentrifugerrør. Tilsett 100 mikroliter varm fordøyelsesbuffer til lumen ved å sette inn en 29 gauge nål utstyrt med en insulinsprøyte.Skyll raskt lumen i halspulsåren i mikrosentrifugerøret, og tilsett deretter 0,3 mikroliter FBS i røret for å stoppe reaksjonen. Plasser mikrosentrifugerøret på is. Sentrifuge cellene ved 500 G i fem minutter ved fire grader Celsius, ved hjelp av en sentrifuge utstyrt med en fast vinkelrotor og kast supernatanten.Re-suspendere cellene i fordøyelsesbufferen, som inneholder celledissosiasjonsreagens, og inkubere dem i fem minutter ved 37 grader Celsius for å skille dem i enkeltceller. Blokker den enzymatiske reaksjonen ved å tilsette 0, 15 milliliter FBS til 0, 5 milliliter røret, og gjenta sentrifugering. Kast supernatanten, og resuspender cellene i 100 mikroliter iskald 1% BSA-løsning i PBS i et 0,2 milliliter mikrosentrifugerør.For enkeltcelleanalyse, resuspender pelleten med 100 mikroliter iskald 1% BSA i PBS i et 0,2 milliliter rør. For enkeltkjerneanalyse, resuspender cellepelleten i 100 mikroliter 0,04% BSA i iskald PBS, og sentrifuger enkeltcellesuspensjonen ved 500G ved fire grader Celsius i fem minutter. Dekomponer enkeltcellesuspensjonen med iskald lysisbuffer, og inkuber i fem minutter på is.Bland lysatet med en P20-pipette, og inkuber i ytterligere 10 minutter. Etterpå overfører du lysatet i et 0,5 milliliter rør. Vask ly-cellene med 500 mikroliter buffer, og bland dem med en pipette.Gjenta deretter sentrifugeringen. Kast supernatanten, og resuspender kjernepelleten i 150 mikroliter av den fortynnede kjernebufferen. Tell enkeltkjernepreparatene ved hjelp av et hemocytometer.Etter enkeltkjernesekvenseringsstudien ble enkeltcelle- og enkeltkjerner oppnådd og visualisert ved lysfelt og fasekontrastmikroskopi. Effektiviteten av enkeltkjernepreparasjon fra enkeltcellesuspensjonen ble også demonstrert. Etter enkeltcellet RNA-sekvenseringsstudie ble det oppnådd forskjellige parametere som fordeling av gener per celle, unik molekylær identifikator per celle, mitokondrielle avlesninger per celle og sekvenseringsmetningsdata.For enkeltcellet ATAC-sekvensstudie ble innsatsstørrelsesfordelingen, inkludert nukleosombåndmønsteret, observert. Den normaliserte TSS-anrikningsskåren ble også observert. I tillegg leser prosentfragmentet i toppene.Toppregionfragmenter, TSS-anrikningsscore, forholdet mellom avlesninger i svartelistens genomiske steder og nukleosomsignalforhold ble bestemt. Den enzymatiske fordøyelsen er et stress for cellene, derfor er det avgjørende å opprettholde prøvene på is, og utføre prosedyren så raskt som mulig. Vi kan bruke denne metoden til å skaffe og plate endotelceller fra mus.Vi kan også bruke denne teknikken til å utføre bulk Omix-baserte studier. Denne teknikken banet vei for å studere effekten av forstyrret blodstrøm på endotelceller in vivo på en enkelt celle måte.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generasjon Mus Utledet fra Utførte pluripotente stamceller

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

Isolering av mikrovaskulær endotel Tubes fra Mouse Resistance arterier

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolering av Murint Valve endotelceller

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolasjon og Primær Culture of Mouse endotelceller fra aorta

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Isolering av Mouse Coronary endotelceller

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Isolasjon og karakterisering av musens primære lever sinusformede endotelceller

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

Isolering av betinget udødeliggjorte museglomerulære endotelceller med fluorescerende mitokondrier

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...