Name: isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments
Uploaded: 2021-10-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo financiamento dos subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde HL119798, HL095070 e HL139757 para HJ. HJ também é apoiado pelo Wallace H. Coulter Distinguished Faculty Chair Professorship. Os serviços prestados pelo Emory Integrated Genomics Core (EIGC) foram subsidiados pela Escola de Medicina da Universidade de Emory e também foram parcialmente apoiados pela Georgia Clinical and Translational Science Alliance dos Institutos Nacionais de Saúde sob o número de prêmio. UL1TR002378. O conteúdo fornecido acima é de responsabilidade exclusiva dos autores e não reflete as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

Todos os procedimentos animais descritos abaixo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Emory. Camundongos C57BL/6 não hipercolesterolêmicos, pareados por idade e sexo foram usados para mitigar a variação dependente do sexo e compensar qualquer complicação de condições hipercolesterolêmicas.
1. Cirurgia de ligadura parcial da carótida (LCP)
NOTA: A ligadura parcial da artéria carótida da ACL foi realizada ...

<ol>
	<li>Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+atherosclerosis+development+in+C57Bl6+mice+by+overexpressing+AAV-mediated+PCSK9+and+partial+carotid+ligation.">Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation.</a> Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).</li><li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+carotid+ligation+is+a+model+of+acutely+induced+disturbed+flow,+leading+to+rapid+endothelial+dysfunction+and+atherosclerosis.">Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).</li><li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+disturbed+flow-induced+atherosclerosis+in+mouse+carotid+artery+by+partial+ligation+and+a+simple+method+of+RNA+isolation+from+carotid+endothelium.">A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861 (2010).</li><li>Dunn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-dependent+epigenetic+DNA+methylation+regulates+endothelial+gene+expression+and+atherosclerosis.">Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).</li><li>Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-dependent+regulation+of+genome-wide+mRNA+and+microRNA+expression+in+endothelial+cells+in+vivo.">Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo.</a> Scientific Data. 1 (1), 140039 (2014).</li><li>Ni, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+novel+mechanosensitive+genes+in+vivo+using+mouse+carotid+artery+endothelium+exposed+to+disturbed+flow.">Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow.</a> Blood. 116 (15), 66-73 (2010).</li><li>Son, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atypical+mechanosensitive+microRNA-712+derived+from+pre-ribosomal+RNA+induces+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis.">The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Communications. 4, 3000 (2013).</li><li>Andueza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+reprogramming+by+disturbed+flow+revealed+by+single-cell+RNA+and+chromatin+accessibility+study.">Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study.</a> Cell Reports. 33 (11), 108491 (2020).</li><li>Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+single-cell+chromatin+analysis+with+Signac.">Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+integration+of+single-cell+data.">Comprehensive integration of single-cell data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li><li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cell+death+by+trypan+blue+uptake+and+light+microscopy.">Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+cellular+heterogeneity+of+mouse+carotid+artery+under+disturbed+flow.">Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow.</a> Cell Death and Discovery. 7 (1), 180 (2021).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+activated+cell+populations+using+single-cell+RNA-seq.">Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li><li>O'Flanagan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+solid+tumor+tissues+with+cold+active+protease+for+single-cell+RNA-seq+minimizes+conserved+collagenase-associated+stress+responses.">Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.</a> Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).</li></ol>

Este artigo fornece um protocolo detalhado para isolar preparações unicelulares das artérias carótidas de camundongos. A influência do fluxo d nas células endoteliais pode ser estudada com precisão se a cirurgia de LCP for realizada corretamente. É crucial identificar corretamente os ramos da carótida comum, como a carótida externa, a carótida interna, a artéria occipital e a artéria tireoidiana superior. A validação dos padrões de fluxo por ultrassonografia valida ainda mais o início bem-su...

Este laboratório demonstrou anteriormente que a indução do fluxo d leva ao desenvolvimento rápido e robusto de aterosclerose em camundongos hiperlipidêmicos 1,2. O novo modelo de aterosclerose induzida por fluxo d em camundongos foi possível usando a cirurgia de ligadura parcial da carótida (LCP) 3. A cirurgia de LCP induz a condição de fluxo sanguíneo baixo e oscilatório ou fluxo d na artéria carótida esquerda ligada (ACV). Em contraste, a artéria carótida direita (ACR) contralateral continua a enfrentar fluxo laminar estável (s-flow). Anteriormente, para entender o efeito do fluxo d nas células endoteliais, as artérias carótidas foram dissecadas após a cirurgia de ligadura parcial e lavadas com um agente lisador à base de isotiocianato de fenol e guanidina (método de liberação de RNA/DNA luminal)2,4, que forneceu RNAs ou DNAs "a granel agrupados" enriquecidos com endotélio. Esses RNAs ou DNAs agrupados a granel foram então processados para estudos transcriptômicos ou estudos epigenômicos de metiloma de DNA, respectivamente 4,5,6. Esses estudos ajudaram a descobrir múltiplos genes sensíveis ao fluxo e microRNAs cujos papéis na biologia endotelial e na aterosclerose foram extensivamente investigados 4,6,7.
No entanto, apesar do enriquecimento endotelial, esses estudos de RNA/DNA em massa não conseguiram distinguir o papel específico de cada tipo de célula na parede da artéria na aterosclerose induzida pelo fluxo d. Isolamento unicelular (sc) enriquecido com endotélio e estudos de sequenciamento de scRNA e scATAC foram realizados para superar essa limitação8. Para isso, camundongos C57Bl6 foram submetidos à cirurgia de LCP para induzir o fluxo d na ACV enquanto usavam o RCA exposto ao fluxo s como controle. Dois dias ou duas semanas após a cirurgia de LCP, os ratos foram sacrificados e as carótidas foram dissecadas e limpas. O lúmen de ambos os LCAs e RCAs foi infundido com colagenase, e os digestos de colagenase luminal contendo CEs como fração significativa e outras células arteriais foram coletadas. A suspensão de célula única (scRNAseq) ou a suspensão de núcleos únicos (scATACseq) foram preparadas e codificadas com identificadores únicos para cada célula ou núcleo usando uma configuração de Genômica 10x. Os RNAs foram submetidos à preparação da biblioteca de cDNA e sequenciados.
Os conjuntos de dados scRNAseq e scATACseq foram processados utilizando o Cell Ranger Single-Cell Software e posteriormente analisados pelos pacotes Seurat e Signac R 9,10. A cada célula e núcleo foi atribuído um tipo de célula a partir dessas análises e agrupados no tipo de célula com base nos genes marcadores e padrões únicos de expressão gênica. Os resultados do scRNAseq e scATACseq demonstraram que essas preparações de célula única são enriquecidas com CEs e também contêm células musculares lisas (SMCs), fibroblastos e células imunes.
Uma análise mais aprofundada revelou que a população CE na digestão luminal é altamente divergente e plástica (8 clusters CE diferentes) e responsiva ao fluxo sanguíneo. Mais importante ainda, esses resultados demonstraram que o fluxo d reprograma as CEs de um fenótipo anti-inflamatório protegido por ateróbio para fenótipos pró-aterogênicos, incluindo transição pró-inflamatória, endotelial para mesenquimal, transição de células-tronco endoteliais / progenitoras e, mais surpreendentemente, transição endotelial para célula imune. Além disso, os dados scATACseq revelam novas alterações de acessibilidade à cromatina dependentes do fluxo e locais de ligação ao fator de transcrição de maneira genômica, que formam a base de várias novas hipóteses. A metodologia e o protocolo para a preparação de células endoteliais únicas para estudos multi-ômicos de célula única das artérias carótidas de camundongos são detalhados abaixo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (Cell Culture Grade)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21040CMX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022-43-108-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile</td>
			<td>Fablab</td>
			<td>FL4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL SuperClear Centrifuge Tubes</td>
			<td>Labcon</td>
			<td>3191-335-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk Suture Sterile</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>s-1172 c2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged</td>
			<td>Thermo Fisher Scientic</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase solution,sterile-filtered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000123/ 2000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>RXBUPRENOR5-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Controller &#38; Next GEM Accessory Kit</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#39; Reagent Kits v3.1</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2100502.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D141-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co</td>
			<td>RS-5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase1</td>
			<td>New England Biolabs Inc</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Benchtop-Model # 5425)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620444230VR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium Select</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed Angle Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>FA-45-24-11-Kit Rotor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffered saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>51558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson vet</td>
			<td>789 313 89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACs Smart Strainers (30 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (100 &#181;m)</td>
			<td>&#160;Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline (0.9% sodium chloride)</td>
			<td>Baxter International Inc</td>
			<td>2B1323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei Buffer (20x)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN 2000153/2000207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientic</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co</td>
			<td>RS-5675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-5480</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Mend II</td>
			<td>Webster Veteinanry</td>
			<td>07-856-7946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II Collagenase</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>2100502.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deposited Data</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scATACseq FastQ files</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scRNAseq FastQ files</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Ranger 3.1.0</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cicero</td>
			<td>Pliner et al., 2018</td>
			<td>https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ggplot2 v3.2.1</td>
			<td>Hadley Wickham</td>
			<td>https://cran.r-project.org</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony</td>
			<td>Korsunsky et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/immunogenomics/harmony</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Schneider et al., 2012</td>
			<td>https://imagej.nih.gov</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocle 2.8.0</td>
			<td>Qiu et al., 2017</td>
			<td>https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 3.6.2</td>
			<td>R Foundation</td>
			<td>https://www.r-project.org</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seurat 3.1.3</td>
			<td>Stuart et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/satijalab/seurat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signac 0.2.5</td>
			<td>Stuart et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/timoast/signac</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments

A aterosclerose é uma doença inflamatória das regiões arteriais expostas ao fluxo sanguíneo perturbado (fluxo d). O fluxo D regula a expressão de genes no endotélio nos níveis transcriptômico e epigenômico, resultando em respostas proaterogênicas. Recentemente, estudos de sequenciamento de RNA de célula única (scRNAseq) e ensaio de célula única para sequenciamento de cromatina acessível à transposase (scATACseq) foram realizados para determinar as alterações de acessibilidade transcriptômica e cromatina em uma resolução de célula única usando o modelo de ligadura parcial de carótida (PCL) de camundongo. Como as células endoteliais (CE) representam uma fração menor das populações celulares totais na parede da artéria, um método de digestão luminal foi usado para obter preparações unicelulares enriquecidas com CE. Para este estudo, camundongos foram submetidos à cirurgia de LCP para induzir o fluxo d na artéria carótida esquerda (ACV) enquanto usavam a artéria carótida direita (ACR) como controle. As artérias carótidas foram dissecadas dois dias ou duas semanas após a cirurgia de LCP. O lúmen de cada carótida foi submetido à digestão da colagenase, e células únicas enriquecidas com endotelial ou núcleos únicos foram obtidos. Essas preparações de célula única e núcleos únicos foram subsequentemente codificadas usando uma configuração microfluídica de 10x Genomics. As células únicas e os núcleos únicos com código de barras foram então utilizados para preparação de RNA, geração de biblioteca e sequenciamento em um sequenciador de DNA de alto rendimento. Após o processamento bioinformático, os conjuntos de dados scRNAseq e scATACseq identificaram vários tipos de células da digestão luminal, consistindo principalmente de CEs. Células musculares lisas, fibroblastos e células imunes também estavam presentes. Este método de enriquecimento CE ajudou a entender o efeito do fluxo sanguíneo no endotélio, o que poderia ter sido difícil com o método de digestão total da artéria. O método de preparação de célula única enriquecido com CE pode ser usado para realizar estudos de ômica de célula única em camundongos knockouts e transgênicos em que o efeito do fluxo sanguíneo sobre esses genes não foi estudado. É importante ressaltar que essa técnica pode ser adaptada para isolar células únicas enriquecidas com CE de explantes de artérias humanas para realizar estudos mecanicistas semelhantes.

Cirurgias de ligadura parcial da carótida foram realizadas em 44 camundongos, e o início do fluxo d na ACV foi validado pela realização de ultrassonografia um dia após a cirurgia de ligadura parcial. A cirurgia de ligadura parcial bem-sucedida causa redução da velocidade do fluxo sanguíneo e reverte o fluxo sanguíneo (fluxo perturbado) na ACV3. As artérias carótidas foram dissecadas aos dois dias ou duas semanas após a ligadura. O lúmen de cada carótida foi submetido à dige...

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Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments

Apresentamos um método para isolar células e núcleos endoteliais do lúmen de artérias carótidas de camundongos expostas a condições de fluxo estáveis ou perturbadas para a realização de experimentos ômicos unicelulares.

Isolamento de células endoteliais do lúmen de artérias carótidas de camundongos para experimentos multi-ômicos unicelulares

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in ...

Em um vaso sanguíneo, o número de células endoteliais é muito baixo, o que dificulta o estudo. Nosso protocolo elimina essa limitação e nos permite estudar novas vias moleculares e terapêuticas. Nosso protocolo nos permite obter amostras enriquecidas endoteliais e estudar como o fluxo perturbado agudo e crônico afeta esse tipo de célula.A capacidade de estudar as células endoteliais em mais detalhes torna possível definir genes-alvo e, portanto, potenciais terapêuticas para a aterosclerose visando as células endoteliais. O isolamento da artéria carótida é complicado e requer paciência e experiência. Para começar, prepare o animal injetando 0,05 miligramas por quilograma de buprenorfina por via subcutânea.Esterilizar a área depilada usando Betadine e solução de isopropanol três vezes. Faça uma incisão ventral na linha média de aproximadamente um centímetro na região do pescoço. Em seguida, exponha o ponto de ramificação da LCA por dissecção contundente.Lige as artérias carótida interna esquerda, carótida externa e occipital com suturas 6-0, deixando a artéria tireoidiana superior intocada. Feche a incisão com cola de tecido ou suturas. Transfira o rato para uma gaiola de recuperação pré-aquecida mantida a 37 graus Celsius.Coloque o rato sobre uma toalha limpa por até uma hora para evitar hipotermia pós-cirúrgica. Insira uma agulha de calibre 21 na linha IV conectada através do ápice do coração no ventrículo esquerdo. Permitir a perfusão retrógrada por dois a três minutos usando solução salina normal à temperatura ambiente.Mantenha uma taxa de fluxo constante aplicando pressão constante durante a injeção ou usando uma linha IV e mantendo o saco salino a uma altura de oito a nove pés. Remova a pele da região do pescoço com toda a gordura, músculos e tecidos conjuntivos para expor as artérias carótidas. Em seguida, remova os tecidos periadventícios ao redor das carótidas, deixando a carótida presa ao corpo.Faça uma incisão abaixo do local da ligadura na ACV para permitir a perfusão. Perfundir a ACV através do ventrículo esquerdo por mais um minuto para remover quaisquer vestígios de sangue. Lave o exterior das artérias carótidas com solução salina normal para remover quaisquer vestígios de sangue.Use uma seringa de insulina com uma agulha de calibre 29 para injetar 50 microlitros de tampão de digestão no lúmen da extremidade distal da artéria carótida esquerda. Use um microclipe para prender a extremidade proximal da artéria carótida cheia de tampão de digestão. Adicione 15 a 20 microlitros de tampão de digestão no lúmen e prenda a extremidade distal para evitar qualquer liberação de tampão de digestão.Transfira as artérias carótidas do rato para placas de 35 milímetros contendo solução salina tamponada quente de 37 graus Celsius HEPES. E incube-os por 45 minutos a 37 graus Celsius com balanço intermitente. Remova a artéria carótida com os grampos do prato de 35 milímetros após a digestão enzimática luminal ser concluída.Retire os grampos com cuidado, para que o tampão de digestão não vaze. Segure uma extremidade da artéria carótida em cima de um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione 100 microlitros de tampão de digestão quente ao lúmen inserindo uma agulha de calibre 29 equipada com uma seringa de insulina.Lave rapidamente o lúmen da artéria carótida no tubo de microcentrífuga e, em seguida, adicione 0,3 microlitros de FBS no tubo para interromper a reação. Coloque o tubo de microcentrífuga no gelo. Centrifugar as células a 500 G durante cinco minutos a quatro graus Celsius, utilizando uma centrífuga equipada com um rotor de ângulo fixo e eliminar o sobrenadante.Ressuspenda as células em tampão de digestão, contendo reagente de dissociação celular, e incube-as por cinco minutos a 37 graus Celsius para separá-las em células únicas. Bloqueie a reação enzimática adicionando 0,15 mililitro de FBS ao tubo de 0,5 mililitro e repita a centrifugação. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 100 microlitros de solução gelada de 1% BSA em PBS em um tubo de microcentrífuga de 0,2 mililitros.Para análise de célula única, ressuspeite o pellet com 100 microlitros de 1%BSA gelado em PBS em um tubo de 0,2 mililitros. Para análise de núcleo único, ressuscite a pastilha de célula em 100 microlitros de 0,04% BSA em PBS gelado e centrifugar a suspensão de célula única a 500G a quatro graus Celsius por cinco minutos. Decomponha a suspensão de célula única com tampão de lise gelado e incube por cinco minutos no gelo.Misture o lisado com uma pipeta P20 e incube por mais 10 minutos. Depois, transfira o lisado em um tubo de 0,5 mililitro. Lave as células com 500 microlitros de tampão e misture-as com uma pipeta.Em seguida, repita a centrifugação. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet de núcleos em 150 microlitros do tampão de núcleos diluídos. Conte as preparações de núcleos únicos usando um hemocitômetro.Após o estudo de sequenciamento de núcleos únicos, núcleos únicos e de células únicas foram obtidos e visualizados por microscopia de campo brilhante e contraste de fase. A eficiência da preparação de núcleos únicos a partir da suspensão de célula única também foi demonstrada. Após o estudo de sequenciamento de RNA de célula única, vários parâmetros, como distribuição de genes por célula, identificador molecular único por célula, leituras mitocondriais por célula e dados de saturação de sequenciamento foram obtidos.Para o estudo da sequência ATAC de célula única, observou-se a distribuição do tamanho da inserção, incluindo o padrão de bandas de nucleossomos. O escore normalizado de enriquecimento da SST também foi observado. Além disso, o fragmento percentual lê nos picos.Fragmentos de região de pico, escore de enriquecimento da SST, razão de leituras nos locais genômicos da lista negra e razão de sinal de nucleossomo foram determinados. A digestão enzimática é um estresse para as células, portanto, é crucial manter as amostras no gelo e realizar o procedimento o mais rápido possível. Podemos usar este método para obter células endoteliais de camundongos.Também podemos usar essa técnica para realizar estudos baseados em Omix em massa. Esta técnica abriu caminho para estudar o efeito do fluxo sanguíneo perturbado em células endoteliais in vivo de uma única maneira.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Isolamento de Valvular Células Endoteliais

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Biologia

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Isolamento de Células-Tronco da retina do olho do rato

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Isolamento e cultura de células endoteliais pulmonares de camundongos Neonatal

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

Isolamento de tubos endoteliais microvasculares de Artérias Rato Resistência

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

O isolamento de células endoteliais de Murino Válvula

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolamento e cultura primária de células de camundongo aórtica endoteliais

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Isolamento de células de camundongo Coronária endoteliais

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Isolamento e Caracterização de Células Endoteliais Hemorlicais do Fígado Primário do Rato

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

Isolamento de células endoteliais glomerulares de camundongos imortalizadas condicionalmente com mitocôndrias fluorescentes

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...