Name: isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments
Uploaded: 2021-10-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments at JoVE.com

Эта работа была поддержана финансированием грантов Национальных институтов здравоохранения HL119798, HL095070 и HL139757 для HJ. HJ также поддерживается профессорской кафедрой Уоллеса Х. Култера. Услуги, предоставляемые Emory Integrated Genomics Core (EIGC), субсидировались Медицинской школой Университета Эмори, а также частично поддерживались Альянсом клинических и трансляционных наук Джорджии Национальных институтов здравоохранения под номером премии. УЛ1ТР002378. Содержание, представленное выше, является исключительной ответственностью авторов и не отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.

Все процедуры для животных, описанные ниже, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Эмори. Негиперхолестеринемические, соответствующие возрасту и полу мыши C57BL/6 использовались для смягчения половых вариаций и компенсации люб?...

<ol>
	<li>Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+atherosclerosis+development+in+C57Bl6+mice+by+overexpressing+AAV-mediated+PCSK9+and+partial+carotid+ligation.">Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation.</a> Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).</li><li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+carotid+ligation+is+a+model+of+acutely+induced+disturbed+flow,+leading+to+rapid+endothelial+dysfunction+and+atherosclerosis.">Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).</li><li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+disturbed+flow-induced+atherosclerosis+in+mouse+carotid+artery+by+partial+ligation+and+a+simple+method+of+RNA+isolation+from+carotid+endothelium.">A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861 (2010).</li><li>Dunn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-dependent+epigenetic+DNA+methylation+regulates+endothelial+gene+expression+and+atherosclerosis.">Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).</li><li>Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-dependent+regulation+of+genome-wide+mRNA+and+microRNA+expression+in+endothelial+cells+in+vivo.">Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo.</a> Scientific Data. 1 (1), 140039 (2014).</li><li>Ni, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+novel+mechanosensitive+genes+in+vivo+using+mouse+carotid+artery+endothelium+exposed+to+disturbed+flow.">Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow.</a> Blood. 116 (15), 66-73 (2010).</li><li>Son, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atypical+mechanosensitive+microRNA-712+derived+from+pre-ribosomal+RNA+induces+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis.">The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Communications. 4, 3000 (2013).</li><li>Andueza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+reprogramming+by+disturbed+flow+revealed+by+single-cell+RNA+and+chromatin+accessibility+study.">Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study.</a> Cell Reports. 33 (11), 108491 (2020).</li><li>Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+single-cell+chromatin+analysis+with+Signac.">Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+integration+of+single-cell+data.">Comprehensive integration of single-cell data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li><li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cell+death+by+trypan+blue+uptake+and+light+microscopy.">Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+cellular+heterogeneity+of+mouse+carotid+artery+under+disturbed+flow.">Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow.</a> Cell Death and Discovery. 7 (1), 180 (2021).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+activated+cell+populations+using+single-cell+RNA-seq.">Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li><li>O'Flanagan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+solid+tumor+tissues+with+cold+active+protease+for+single-cell+RNA-seq+minimizes+conserved+collagenase-associated+stress+responses.">Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.</a> Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).</li></ol>

В этой статье представлен подробный протокол выделения одноклеточных препаратов из сонных артерий мыши. Влияние d-потока на эндотелиальные клетки может быть точно изучено, если операция PCL выполнена правильно. Крайне важно правильно идентифицировать ветви общей сонной артерии, т?...

Эта лаборатория ранее продемонстрировала, что индукция d-потока приводит к быстрому и бурному развитию атеросклероза у гиперлипидемических мышей 1,2. Новая мышиная модель d-потока-индуцированного атеросклероза была возможна с использованием операции частичного перевязки сонной артерии (PCL) 3. Хирургия PCL вызывает низкое и колебательное состояние кровотока или d-потока в перевязанной левой сонной артерии (LCA). Напротив, контралатеральная правая сонная артерия (RCA) продолжает сталкиваться со стабильным ламинарным потоком (s-flow). Ранее, чтобы понять влияние d-потока на эндотелиальные клетки, сонные артерии были рассечены после операции частичной перевязки и промыты фенолом и гуанидином изотиоцианатным агентом (метод промывки люминальной РНК / ДНК)2,4, который обеспечивал обогащенные эндотелием «объединенные объемные» РНК или ДНК. Эти объединенные объемные РНК или ДНК затем обрабатывались для транскриптомных исследований или эпигеномных исследований метилома ДНК, соответственно 4,5,6. Эти исследования помогли обнаружить множественные чувствительные к потоку гены и микроРНК, роль которых в эндотелиальной биологии и атеросклерозе была широко исследована 4,6,7.
Однако, несмотря на обогащение эндотелия, эти объемные исследования РНК/ДНК не смогли различить конкретную роль каждого типа клеток в стенке артерии при d-поток-индуцированном атеросклерозе. Для преодоления этогоограничения были проведены исследования обогащенной эндотелиалом одноклеточной (sc) изоляции и секвенирования scRNA и scATAC. Для этого мышей C57Bl6 подвергали операции PCL, чтобы индуцировать d-поток в LCA при использовании RCA, подвергающейся воздействию s-потока, в качестве контроля. Через два дня или две недели после операции PCL мышей приносили в жертву, а сонные артерии рассекали и очищали. Просвет как LCA, так и RCA был наполнен коллагеназой, а люминальные коллагеназы перевариваются, содержащие EC в виде значительной фракции и другие артериальные клетки. Одноклеточную суспензию (scRNAseq) или одноядерную суспензию (scATACseq) готовили и штрих-кодировали уникальными идентификаторами для каждой клетки или ядра с использованием 10-кратной установки геномики. РНК подвергали подготовке и секвенированию библиотеки кДНК.
Наборы данных scRNAseq и scATACseq были обработаны с использованием программного обеспечения Cell Ranger Single-Cell и дополнительно проанализированы пакетами Seurat и Signac R 9,10. Каждой клетке и ядру был присвоен тип клеток из этих анализов и сгруппирован в тип клеток на основе маркерных генов и уникальных паттернов экспрессии генов. Результаты scRNAseq и scATACseq показали, что эти одноклеточные препараты обогащены ЭК, а также содержат гладкомышечные клетки (SMC), фибробласты и иммунные клетки.
Дальнейший анализ показал, что популяция ЕС в просветном пищеварении сильно расходится и пластична (8 различных кластеров ЕС) и реагирует на кровоток. Самое главное, что эти результаты показали, что d-flow перепрограммирует EC от атеро-защищенного противовоспалительного фенотипа к проатерогенным фенотипам, включая провоспалительный, эндотелиальный переход в мезенхимальный переход, эндотелиальный стволовый / предшественник клеточный переход и, что самое удивительное, эндотелиальный клеточный переход. Кроме того, данные scATACseq показывают новые изменения доступности хроматина, зависящие от потока, и сайты связывания транскрипционного фактора в масштабах всего генома, которые составляют основу нескольких новых гипотез. Методология и протокол подготовки одиночных эндотелиальных клеток для одноклеточных мультиомических исследований из сонных артерий мышей подробно описаны ниже.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (Cell Culture Grade)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21040CMX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022-43-108-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile</td>
			<td>Fablab</td>
			<td>FL4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL SuperClear Centrifuge Tubes</td>
			<td>Labcon</td>
			<td>3191-335-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk Suture Sterile</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>s-1172 c2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged</td>
			<td>Thermo Fisher Scientic</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase solution,sterile-filtered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000123/ 2000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>RXBUPRENOR5-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Controller &#38; Next GEM Accessory Kit</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#39; Reagent Kits v3.1</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2100502.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D141-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co</td>
			<td>RS-5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase1</td>
			<td>New England Biolabs Inc</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Benchtop-Model # 5425)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620444230VR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium Select</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed Angle Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>FA-45-24-11-Kit Rotor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffered saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>51558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson vet</td>
			<td>789 313 89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACs Smart Strainers (30 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (100 &#181;m)</td>
			<td>&#160;Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline (0.9% sodium chloride)</td>
			<td>Baxter International Inc</td>
			<td>2B1323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei Buffer (20x)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN 2000153/2000207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientic</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co</td>
			<td>RS-5675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-5480</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Mend II</td>
			<td>Webster Veteinanry</td>
			<td>07-856-7946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II Collagenase</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>2100502.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deposited Data</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scATACseq FastQ files</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scRNAseq FastQ files</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Ranger 3.1.0</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cicero</td>
			<td>Pliner et al., 2018</td>
			<td>https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ggplot2 v3.2.1</td>
			<td>Hadley Wickham</td>
			<td>https://cran.r-project.org</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony</td>
			<td>Korsunsky et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/immunogenomics/harmony</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Schneider et al., 2012</td>
			<td>https://imagej.nih.gov</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocle 2.8.0</td>
			<td>Qiu et al., 2017</td>
			<td>https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 3.6.2</td>
			<td>R Foundation</td>
			<td>https://www.r-project.org</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seurat 3.1.3</td>
			<td>Stuart et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/satijalab/seurat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signac 0.2.5</td>
			<td>Stuart et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/timoast/signac</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments

Атеросклероз – это воспалительное заболевание артериальных областей, подверженных нарушенному кровотоку (d-потоку). D-поток регулирует экспрессию генов в эндотелии на транскриптомном и эпигеномном уровнях, что приводит к проатерогенным реакциям. Недавно были проведены исследования секвенирования одноклеточной РНК (scRNAseq) и одноклеточного анализа для транспозазного секвенирования хроматина (scATACseq) для определения изменений доступности транскриптома и хроматина при одноклеточном разрешении с использованием модели частичного лигирования сонной артерии мыши (PCL). Поскольку эндотелиальные клетки (ЭК) представляют собой незначительную долю от общего количества клеточных популяций в стенке артерии, для получения одноклеточных препаратов, обогащенных ЭК, был использован метод люминального сбраживания. Для этого исследования мышей подвергали операции PCL, чтобы индуцировать d-поток в левой сонной артерии (LCA) при использовании правой сонной артерии (RCA) в качестве контроля. Сонные артерии были рассечены через два дня или две недели после операции PCL. Просвет каждой сонной артерии подвергали перевариванию коллагеназы, и получали обогащенные эндотелием одиночные клетки или одиночные ядра. Эти одноклеточные и одноядерные препараты были впоследствии штрих-кодированы с использованием 10-кратной микрофлюидной установки Genomics. Штрих-кодированные одиночные клетки и одноядерные ядра затем использовались для подготовки РНК, генерации библиотеки и секвенирования на высокопроизводительном секвенаторе ДНК. После обработки биоинформатики наборы данных scRNAseq и scATACseq идентифицировали различные типы клеток из просветного пищеварения, в основном состоящие из ЭК. Гладкомышечные клетки, фибробласты и иммунные клетки также присутствовали. Этот метод обогащения EC помог понять влияние кровотока на эндотелий, что могло быть затруднено при методе полного переваривания артерий. Метод одноклеточного препарата, обогащенный ЕС, может быть использован для проведения одноклеточных омических исследований у EC-нокаутов и трансгенных мышей, где влияние кровотока на эти гены не изучалось. Важно отметить, что этот метод может быть адаптирован для выделения обогащенных ЕС одиночных клеток из эксплантов артерий человека для выполнения аналогичных механистических исследований.

Операции частичной перевязки сонной артерии были выполнены на 44 мышах, и начало d-потока в LCA было подтверждено путем выполнения ультрасонографии через один день после операции частичной перевязки. Успешная операция частичной перевязки вызывает снижение скорости кровотока и обра...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments at JoVE.com

Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments

Представлен метод выделения эндотелиальных клеток и ядер из просвета сонных артерий мышей, подвергающихся воздействию стабильных или нарушенных условий течения для проведения экспериментов с одноклеточной омикой.

Выделение эндотелиальных клеток из просвета сонных артерий мыши для одноклеточных мультиомных экспериментов

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in ...

В кровеносном сосуде количество эндотелиальных клеток очень низкое, что затрудняет их изучение. Наш протокол устраняет это ограничение и позволяет нам изучать новые молекулярные пути и терапевтические средства. Наш протокол позволяет нам получить образцы, обогащенные эндотелием, и изучить, как острый и хронический нарушенный поток влияет на этот тип клеток.Возможность более детального изучения эндотелиальных клеток позволяет определить гены-мишени и, следовательно, потенциальные терапевтические средства для атеросклероза, нацеленные на эндотелиальные клетки. Изоляция сонной артерии сложна и требует терпения и опыта. Для начала подготовьте животное, введя 0,05 миллиграмма на килограмм бупренорфина подкожно.Стерилизуют эпилированную область с помощью бетадина и раствора изопропанола три раза. Сделайте вентральный разрез средней линии примерно на один сантиметр в области шеи. Затем обнажите точку ветвления LCA тупым рассечением.Обжигайте левую внутреннюю сонную, наружную сонную и затылочную артерии 6-0 швами, оставляя верхнюю артерию щитовидной железы нетронутой. Закройте разрез тканевым клеем или швами. Переведите мышь в предварительно нагретую восстановительную клетку, выдерживаемую при температуре 37 градусов цельсия.Поместите мышь на чистое полотенце на срок до одного часа, чтобы избежать переохлаждения после операции. Вставьте иглу 21 калибра в линию IV, подключенную через верхушку сердца в левый желудочек. Оставьте ретроградную перфузию в течение двух-трех минут, используя обычный физиологический раствор при комнатной температуре.Поддерживайте постоянную скорость потока, применяя постоянное давление во время впрыска или используя внутривенную линию и сохраняя солевой мешок на высоте от восьми до девяти футов. Удалите кожу из области шеи со всеми жирами, мышцами и соединительными тканями, чтобы обнажить сонные артерии. Затем удалите периадвентициальные ткани вокруг сонных артерий, оставив сонную артерию прикрепленной к телу.Сделайте разрез ниже места перевязки в LCA, чтобы обеспечить перфузию. Перфузируйте LCA через левый желудочек еще на минуту, чтобы удалить любые следы крови. Промывайте внешнюю часть сонных артерий обычным солевым раствором, чтобы удалить любые следы крови.Используйте инсулиновый шприц с иглой 29 калибра для введения 50 микролитров буфера пищеварения в просвет дистального конца левой сонной артерии. Используйте микрозажим, чтобы зажать проксимальный конец сонной артерии, заполненный буфером пищеварения. Добавьте от 15 до 20 микролитров буфера пищеварения в просвет и обрежьте дистальный конец, чтобы избежать высвобождения буфера пищеварения.Перенесите сонные артерии от мыши в 35-миллиметровые чашки, содержащие теплый буферизованный солевой раствор HEPES 37 градусов цельсия. И высиживать их в течение 45 минут при 37 градусах Цельсия с прерывистым раскачиванием. Удалите сонную артерию с помощью зажимов из 35-миллиметровой чашки после завершения просветного ферментативного пищеварения.Аккуратно отсоедините зажимы, чтобы буфер пищеварения не протекал. Держите один конец сонной артерии поверх трубки микроцентрифуги объемом 1,5 миллилитра. Добавьте 100 микролитров теплого буфера пищеварения в просвет, вставив иглу 29 калибра, оснащенную инсулиновым шприцем.Быстро промыть просвет сонной артерии в трубке микроцентрифуги, затем добавить 0,3 микролитра FBS в трубку, чтобы остановить реакцию. Поместите трубку микроцентрифуги на лед. Центрифугируйте ячейки при 500 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, используя центрифугу, оснащенную ротором с фиксированным углом, и выбросьте супернатант.Повторно приостановите клетки в буфере пищеварения, содержащем реагент диссоциации клеток, и инкубируйте их в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия, чтобы разделить их на отдельные клетки. Блокируют ферментативную реакцию, добавляя 0,15 миллилитра FBS к 0,5 миллилитровой трубке, и повторяют центрифугирование. Отбросьте супернатант и повторно суспендируйте клетки в 100 микролитрах ледяного холодного 1%-го раствора BSA в PBS в 0,2-миллилитровой микроцентрифужной трубке.Для анализа одной клетки повторно суспендируйте гранулу со 100 микролитрами ледяного холода 1% BSA в PBS в трубке 0,2 миллилитра. Для анализа одного ядра повторно суспендируйте клеточную гранулу в 100 микролитрах 0,04% BSA в ледяном PBS и центрифугируйте одноклеточную суспензию при 500G при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Разложить одноклеточную суспензию с буфером лизиса ледяного холода и инкубировать в течение пяти минут на льду.Смешайте лизат с пипеткой P20 и инкубируйте еще 10 минут. После этого переложите лизат в 0,5-миллилитровую трубку. Вымойте ячейки ly 500 микролитрами буфера и перемешайте их с помощью пипетки.Затем повторите центрифугирование. Отбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулы ядер в 150 микролитрах разбавленного буфера ядер. Подсчитывайте препараты одиночных ядер с помощью гемоцитометра.После исследования секвенирования одиночных ядер одноклеточные и одиночные ядра были получены и визуализированы с помощью ярко-полевой и фазово-контрастной микроскопии. Также была продемонстрирована эффективность получения одиночных ядер из одноклеточной суспензии. После исследования секвенирования одноклеточной РНК были получены различные параметры, такие как распределение генов на клетку, уникальный молекулярный идентификатор на клетку, показания митохондрий на клетку и данные насыщения секвенирования.Для исследования последовательности ATAC с одной клеткой наблюдалось распределение размеров вставки, включая паттерн полос нуклеосом. Также наблюдался нормализованный показатель обогащения СТШ. Кроме того, процентный фрагмент считывается в пиках.Определены фрагменты пиковой области, показатель обогащения СТШ, соотношение считываний в геномных сайтах черного списка и отношение сигнала нуклеосом. Ферментативное пищеварение является стрессом для клеток, поэтому крайне важно поддерживать образцы на льду и выполнять процедуру как можно быстрее. Мы можем использовать этот метод для получения пластинчатых эндотелиальных клеток от мышей.Мы также можем использовать эту технику для проведения массовых исследований на основе Omix. Этот метод проложил путь для изучения влияния нарушенного кровотока на эндотелиальные клетки in vivo одноклеточным способом.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Выделение клапанные эндотелиальных клеток

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Выделение стволовых клеток сетчатки от мыши глаз

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Выделение и культуре эндотелиальных клеток легочной от новорожденных мышей

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Генерация Мыши, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

Выделение микрососудистой эндотелиальных трубок от сопротивления мышь автомагистралях

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Выделение Мышиный клапана эндотелиальных клеток

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Выделение и первичной культуре мышиных эндотелиальных клеток аорты

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Выделение мыши ишемическая эндотелиальных клеток

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Выделение и характеристика первичных синусоидальных эндотелиальных клеток печени мыши

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

Выделение условно увековеченных мышиных клубочковых эндотелиальных клеток с флуоресцентными митохондриями

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...