Name: isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments
Uploaded: 2021-10-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por fondos de los Institutos Nacionales de Salud subvenciones HL119798, HL095070 y HL139757 a HJ. HJ también cuenta con el apoyo de la cátedra Wallace H. Coulter Distinguished Faculty Chairship. Los servicios prestados por el Emory Integrated Genomics Core (EIGC) fueron subvencionados por la Facultad de Medicina de la Universidad de Emory y también fueron apoyados en parte por la Alianza de Ciencias Clínicas y Traslacionales de Georgia de los Institutos Nacionales de Salud bajo el premio No. UL1TR002378. El contenido proporcionado anteriormente es responsabilidad exclusiva de los autores y no refleja las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

Todos los procedimientos con animales descritos a continuación fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Emory. Se utilizaron ratones C57BL / 6 no hipercolesterolémicos, emparejados por edad y sexo para mitigar la variación dependiente del sexo y compensar cualquier complicación de las afecciones hipercolesterolémicas.
1. Cirugía de ligadura carotídea parcial (LCP)
NOTA: La ligadura parcial de la arteria car...

<ol>
	<li>Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+atherosclerosis+development+in+C57Bl6+mice+by+overexpressing+AAV-mediated+PCSK9+and+partial+carotid+ligation.">Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation.</a> Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).</li><li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+carotid+ligation+is+a+model+of+acutely+induced+disturbed+flow,+leading+to+rapid+endothelial+dysfunction+and+atherosclerosis.">Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).</li><li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+disturbed+flow-induced+atherosclerosis+in+mouse+carotid+artery+by+partial+ligation+and+a+simple+method+of+RNA+isolation+from+carotid+endothelium.">A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861 (2010).</li><li>Dunn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-dependent+epigenetic+DNA+methylation+regulates+endothelial+gene+expression+and+atherosclerosis.">Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).</li><li>Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-dependent+regulation+of+genome-wide+mRNA+and+microRNA+expression+in+endothelial+cells+in+vivo.">Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo.</a> Scientific Data. 1 (1), 140039 (2014).</li><li>Ni, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+novel+mechanosensitive+genes+in+vivo+using+mouse+carotid+artery+endothelium+exposed+to+disturbed+flow.">Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow.</a> Blood. 116 (15), 66-73 (2010).</li><li>Son, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atypical+mechanosensitive+microRNA-712+derived+from+pre-ribosomal+RNA+induces+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis.">The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Communications. 4, 3000 (2013).</li><li>Andueza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+reprogramming+by+disturbed+flow+revealed+by+single-cell+RNA+and+chromatin+accessibility+study.">Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study.</a> Cell Reports. 33 (11), 108491 (2020).</li><li>Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+single-cell+chromatin+analysis+with+Signac.">Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+integration+of+single-cell+data.">Comprehensive integration of single-cell data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li><li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cell+death+by+trypan+blue+uptake+and+light+microscopy.">Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+cellular+heterogeneity+of+mouse+carotid+artery+under+disturbed+flow.">Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow.</a> Cell Death and Discovery. 7 (1), 180 (2021).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+activated+cell+populations+using+single-cell+RNA-seq.">Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li><li>O'Flanagan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+solid+tumor+tissues+with+cold+active+protease+for+single-cell+RNA-seq+minimizes+conserved+collagenase-associated+stress+responses.">Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.</a> Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).</li></ol>

Este documento proporciona un protocolo detallado para aislar preparaciones unicelulares de las arterias carótidas del ratón. La influencia del flujo d en las células endoteliales se puede estudiar con precisión si la cirugía de LCP se realiza correctamente. Es crucial identificar correctamente las ramas de la carótida común, como la carótida externa, la carótida interna, la arteria occipital y la arteria tiroidea superior. La validación de los patrones de flujo por ecografía valida aún más el inici...

Este laboratorio demostró previamente que la inducción del flujo d conduce al desarrollo rápido y robusto de aterosclerosis en ratones hiperlipidémicos 1,2. El nuevo modelo de ratón de aterosclerosis inducida por flujo D fue posible mediante cirugía de ligadura carotídea parcial (LCP) 3. La cirugía de LCP induce una condición de flujo sanguíneo bajo y oscilatorio o flujo D en la arteria carótida izquierda ligada (LCA). En contraste, la arteria carótida derecha contralateral (ACR) continúa enfrentando un flujo laminar estable (flujo s). Anteriormente, para comprender el efecto del flujo d en las células endoteliales, las arterias carótidas se diseccionaron después de la cirugía de ligadura parcial y se enjuagaron con un agente lisante a base de isotiocianato de fenol y guanidina (método de lavado de ARN / ADN luminal)2,4, que proporcionó ARN o ADN enriquecidos endotelialmente "agrupados". Estos ARN o ADN a granel agrupados se procesaron para estudios transcriptómicos o estudios de metiloma de ADN epigenómico, respectivamente 4,5,6. Estos estudios ayudaron a descubrir múltiples genes sensibles al flujo y microARN cuyos roles en la biología endotelial y la aterosclerosis fueron ampliamente investigados 4,6,7.
Sin embargo, a pesar del enriquecimiento endotelial, estos estudios masivos de ARN / ADN no pudieron distinguir el papel específico de cada tipo de célula en la pared arterial en la aterosclerosis inducida por flujo d. Para superaresta limitación se realizó aislamiento unicelular (sc) enriquecido endotelial y estudios de secuenciación de scRNA y scATAC 8. Para esto, los ratones C57Bl6 fueron sometidos a la cirugía PCL para inducir el flujo d en el LCA mientras usaban el RCA expuesto al flujo s como control. Dos días o dos semanas después de la cirugía de LCP, los ratones fueron sacrificados, y las carótidas fueron diseccionadas y limpiadas. La luz de los ACV y los ACR se infundió con colagenasa, y se recogieron los digeridos luminales de colagenasa que contenían CE como una fracción significativa y otras células arteriales. La suspensión de una sola célula (scRNAseq) o la suspensión de un solo núcleo (scATACseq) se prepararon y codificaron con códigos de barras con identificadores únicos para cada célula o núcleo utilizando una configuración genómica 10x. Los ARN se sometieron a la preparación de la biblioteca de ADNc y se secuenciaron.
Los conjuntos de datos scRNAseq y scATACseq se procesaron utilizando el software Cell Ranger Single-Cell y se analizaron posteriormente mediante los paquetes Seurat y Signac R 9,10. A cada célula y núcleo se le asignó un tipo de célula de estos análisis y se agrupó en el tipo de célula en función de los genes marcadores y los patrones de expresión génica únicos. Los resultados de scRNAseq y scATACseq demostraron que estas preparaciones unicelulares están enriquecidas con CE y también contienen células musculares lisas (SMC), fibroblastos y células inmunes.
Un análisis posterior reveló que la población de EC en la digestión luminal es altamente divergente y plástica (8 grupos diferentes de EC) y responde al flujo sanguíneo. Lo más importante es que estos resultados demostraron que el flujo d reprograma los CE de un fenotipo antiinflamatorio protegido por atero a fenotipos proaterogénicos, incluida la transición proinflamatoria, endotelial a mesenquimal, la transición de células madre / progenitoras endoteliales y, lo que es más sorprendente, la transición de células endoteliales a inmunes. Además, los datos de scATACseq revelan nuevos cambios de accesibilidad a la cromatina dependientes del flujo y sitios de unión al factor de transcripción de una manera genómica completa, que forman la base de varias hipótesis nuevas. La metodología y el protocolo para preparar células endoteliales individuales para estudios multiómicos unicelulares de las arterias carótidas de ratón se detallan a continuación.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (Cell Culture Grade)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21040CMX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022-43-108-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile</td>
			<td>Fablab</td>
			<td>FL4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL SuperClear Centrifuge Tubes</td>
			<td>Labcon</td>
			<td>3191-335-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk Suture Sterile</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>s-1172 c2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged</td>
			<td>Thermo Fisher Scientic</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase solution,sterile-filtered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000123/ 2000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>RXBUPRENOR5-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Controller &#38; Next GEM Accessory Kit</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#39; Reagent Kits v3.1</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2100502.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D141-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co</td>
			<td>RS-5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase1</td>
			<td>New England Biolabs Inc</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Benchtop-Model # 5425)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620444230VR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium Select</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed Angle Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>FA-45-24-11-Kit Rotor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffered saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>51558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson vet</td>
			<td>789 313 89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACs Smart Strainers (30 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (100 &#181;m)</td>
			<td>&#160;Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline (0.9% sodium chloride)</td>
			<td>Baxter International Inc</td>
			<td>2B1323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei Buffer (20x)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN 2000153/2000207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientic</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co</td>
			<td>RS-5675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-5480</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Mend II</td>
			<td>Webster Veteinanry</td>
			<td>07-856-7946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II Collagenase</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>2100502.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deposited Data</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scATACseq FastQ files</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scRNAseq FastQ files</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Ranger 3.1.0</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cicero</td>
			<td>Pliner et al., 2018</td>
			<td>https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ggplot2 v3.2.1</td>
			<td>Hadley Wickham</td>
			<td>https://cran.r-project.org</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony</td>
			<td>Korsunsky et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/immunogenomics/harmony</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Schneider et al., 2012</td>
			<td>https://imagej.nih.gov</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocle 2.8.0</td>
			<td>Qiu et al., 2017</td>
			<td>https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 3.6.2</td>
			<td>R Foundation</td>
			<td>https://www.r-project.org</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seurat 3.1.3</td>
			<td>Stuart et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/satijalab/seurat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signac 0.2.5</td>
			<td>Stuart et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/timoast/signac</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments

La aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria de las regiones arteriales expuestas a un flujo sanguíneo alterado (flujo d). El flujo D regula la expresión de genes en el endotelio a nivel transcriptómico y epigenómico, dando lugar a respuestas proaterogénicas. Recientemente, se realizaron estudios de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNAseq) y ensayo de células individuales para secuenciación de cromatina accesible por transposasa (scATACseq) para determinar los cambios transcriptómicos y de accesibilidad a la cromatina a una resolución de una sola célula utilizando el modelo de ligadura carotídea parcial (PCL) de ratón. Como las células endoteliales (CE) representan una fracción menor de las poblaciones celulares totales en la pared arterial, se utilizó un método de digestión luminal para obtener preparaciones unicelulares enriquecidas con EC. Para este estudio, los ratones fueron sometidos a cirugía de LCP para inducir el flujo d en la arteria carótida izquierda (LCA) mientras usaban la arteria carótida derecha (RCA) como control. Las arterias carótidas se diseccionaron dos días o dos semanas después de la cirugía de LCP. La luz de cada carótida se sometió a la digestión de colagenasa, y se obtuvieron células individuales enriquecidas endotelialmente o núcleos únicos. Estas preparaciones de una sola célula y de un solo núcleo se codificaron posteriormente utilizando una configuración microfluídica de Genomics 10x. Las células individuales y núcleos únicos con código de barras se utilizaron para la preparación de ARN, la generación de bibliotecas y la secuenciación en un secuenciador de ADN de alto rendimiento. Después del procesamiento bioinformático, los conjuntos de datos scRNAseq y scATACseq identificaron varios tipos de células de la digestión luminal, que consisten principalmente en CE. Las células musculares lisas, los fibroblastos y las células inmunes también estaban presentes. Este método de enriquecimiento de EC ayudó a comprender el efecto del flujo sanguíneo en el endotelio, lo que podría haber sido difícil con el método de digestión arterial total. El método de preparación de células individuales enriquecido con CE se puede utilizar para realizar estudios ómicos de células individuales en ratones EC-knockouts y transgénicos donde no se ha estudiado el efecto del flujo sanguíneo sobre estos genes. Es importante destacar que esta técnica se puede adaptar para aislar células individuales enriquecidas con CE de explantes de arterias humanas para realizar estudios mecanicistas similares.

Se realizaron cirugías de ligadura carotídea parcial en 44 ratones, y el inicio del flujo d en el LCA se validó mediante la realización de ecografía un día después de la cirugía de ligadura parcial. La cirugía de ligadura parcial exitosa reduce la velocidad del flujo sanguíneo y revierte el flujo sanguíneo (flujo alterado) en el LCA3. Las arterias carótidas se diseccionaron a los dos días o a las dos semanas después de la ligadura. La luz de cada carótida se sometió a la d...

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Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments

Presentamos un método para aislar células endoteliales y núcleos de la luz de arterias carótidas de ratón expuestas a condiciones de flujo estables o alteradas para realizar experimentos ómicos unicelulares.

Aislamiento de células endoteliales de la luz de arterias carótidas de ratón para experimentos multiómicos unicelulares

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in ...

En un vaso sanguíneo, el número de células endoteliales es muy bajo, lo que dificulta su estudio. Nuestro protocolo elimina esta limitación y nos permite estudiar nuevas vías moleculares y terapéuticas. Nuestro protocolo nos permite obtener muestras enriquecidas endotelialmente, y estudiar cómo el flujo perturbado agudo y crónico afecta a este tipo celular.La capacidad de estudiar las células endoteliales con más detalle permite definir genes diana y, por lo tanto, terapias potenciales para la aterosclerosis dirigidas a las células endoteliales. El aislamiento de la arteria carótida es complicado y requiere paciencia y experiencia. Para comenzar, prepare al animal inyectando 0.05 miligramos por kilogramo de buprenorfina por vía subcutánea.Esterilice el área depilada usando Betadine e isopropanol solución tres veces. Haga una incisión ventral en la línea media de aproximadamente un centímetro en la región del cuello. Luego exponga el punto de bifurcación LCA mediante disección roma.Ligate la carótida interna izquierda, la carótida externa y las arterias occipitales con suturas 6-0, dejando intacta la arteria tiroidea superior. Cierre la incisión con pegamento de tejido o suturas. Transfiera el ratón a una jaula de recuperación precalentada mantenida a 37 grados centígrados.Coloque el ratón sobre una toalla limpia durante un máximo de una hora para evitar la hipotermia postoperatoria. Inserte una aguja de calibre 21 en la línea IV conectada a través del ápice del corazón hacia el ventrículo izquierdo. Permita la perfusión retrógrada durante dos o tres minutos usando solución salina normal a temperatura ambiente.Mantenga un caudal constante aplicando una presión constante mientras inyecta o usa una línea IV, y mantenga la bolsa salina a una altura de ocho a nueve pies. Retire la piel de la región del cuello con toda la grasa, los músculos y los tejidos conectivos para exponer las arterias carótidas. Luego retire los tejidos periadventicios alrededor de las carótidas dejando la carótida unida al cuerpo.Haga una incisión debajo del sitio de ligadura en el LCA para permitir la perfusión. Perfunda el LCA a través del ventrículo izquierdo durante otro minuto para eliminar cualquier rastro de sangre. Lave el exterior de las arterias carótidas con solución salina normal para eliminar cualquier rastro de sangre.Use una jeringa de insulina con una aguja de calibre 29 para inyectar 50 microlitros de tampón de digestión en el lumen del extremo distal de la arteria carótida izquierda. Use un microclip para sujetar el extremo proximal de la arteria carótida lleno de tampón de digestión. Agregue de 15 a 20 microlitros de tampón de digestión en el lumen y recorte el extremo distal para evitar cualquier liberación de tampón de digestión.Transfiera las arterias carótidas del ratón a platos de 35 milímetros que contengan solución salina tamponada HEPES tibia de 37 grados centígrados. E incubarlos durante 45 minutos a 37 grados centígrados con balanceo intermitente. Retire la arteria carótida con las pinzas del plato de 35 milímetros después de que se complete la digestión enzimática luminal.Separe las abrazaderas con cuidado, para que el amortiguador de digestión no tenga fugas. Sostenga un extremo de la arteria carótida sobre un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Agregue 100 microlitros de tampón de digestión caliente a la luz insertando una aguja de calibre 29 equipada con una jeringa de insulina.Enjuague rápidamente la luz de la arteria carótida en el tubo de microcentrífuga, luego agregue 0.3 microlitros de FBS en el tubo para detener la reacción. Coloque el tubo de microcentrífuga sobre hielo. Centrifugar las celdas a 500 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, utilizando una centrífuga equipada con un rotor de ángulo fijo y desechar el sobrenadante.Vuelva a suspender las células en un tampón de digestión, que contiene el reactivo de disociación celular, e incubarlas durante cinco minutos a 37 grados centígrados para separarlas en células individuales. Bloquee la reacción enzimática agregando 0.15 mililitros de FBS al tubo de 0.5 mililitros y repita la centrifugación. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 100 microlitros de solución BSA al 1% helada en PBS en un tubo de microcentrífuga de 0,2 mililitros.Para el análisis de una sola célula, resuspenda el pellet con 100 microlitros de BSA al 1% de hielo frío en PBS en un tubo de 0,2 mililitros. Para el análisis de un solo núcleo, resuspenda el pellet celular en 100 microlitros de 0.04% BSA en PBS helado y centrifugar la suspensión de una sola celda a 500G a cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Descomponga la suspensión de una sola célula con tampón de lisis helada e incube durante cinco minutos en hielo.Mezclar el lisado con una pipeta P20 e incubar durante otros 10 minutos. Después, transfiera el lisado en un tubo de 0.5 mililitros. Lave las células con 500 microlitros de tampón y mézclelas con una pipeta.Luego repita la centrifugación. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de núcleos en 150 microlitros del tampón de núcleos diluidos. Cuente las preparaciones de núcleos individuales usando un hemocitómetro.Después del estudio de secuenciación de núcleos únicos, se obtuvieron y visualizaron núcleos únicos y de célula única mediante microscopía de campo claro y contraste de fase. También se demostró la eficiencia de la preparación de núcleos únicos a partir de la suspensión de una sola célula. Después del estudio de secuenciación de ARN de una sola célula, se obtuvieron varios parámetros como la distribución de genes por célula, el identificador molecular único por célula, las lecturas mitocondriales por célula y los datos de saturación de secuenciación.Para el estudio de secuencia ATAC de una sola célula, se observó la distribución del tamaño del inserto, incluido el patrón de bandas de nucleosomas. También se observó la puntuación normalizada de enriquecimiento de TSS. Además, el fragmento de porcentaje se lee en los picos.Se determinaron los fragmentos de la región máxima, la puntuación de enriquecimiento de TSS, la proporción de lecturas en los sitios genómicos de la lista negra y la relación de señal de los nucleosomas. La digestión enzimática es un estrés para las células, por lo tanto, es crucial mantener las muestras en hielo y realizar el procedimiento lo más rápido posible. Podemos usar este método para obtener y platear células endoteliales de ratones.También podemos utilizar esta técnica para realizar estudios basados en Omix a granel. Esta técnica allanó el camino para estudiar el efecto del flujo sanguíneo alterado en las células endoteliales in vivo de una manera de una sola célula.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Aislamiento de células endoteliales valvular

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Investigación

Biología

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Aislamiento de células madre de la retina del ojo del ratón

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Aislamiento y cultivo de células endoteliales pulmonares de ratones recién nacidos

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generación de ratones derivados de células madre pluripotentes inducidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

Aislamiento de microvascular endotelial Tubos de arterias de resistencia Ratón

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Aislamiento de las células murinas de la válvula endoteliales

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Aislamiento y cultivo primario de células endoteliales aórticas de ratón

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Aislamiento de células endoteliales de ratón coronaria

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Aislamiento y caracterización de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas primarias de ratón

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

Aislamiento de células endoteliales glomerulares de ratón condicionalmente inmortalizadas con mitocondrias fluorescentes

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...