Name: isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments
Uploaded: 2021-10-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments at JoVE.com

Detta arbete stöddes av finansiering från National Institutes of Health-bidrag HL119798, HL095070 och HL139757 till HJ. HJ stöds också av Wallace H. Coulter Distinguished Faculty Chair Professorship. Tjänsterna som tillhandahölls av Emory Integrated Genomics Core (EIGC) subventionerades av Emory University School of Medicine och stöddes också delvis av Georgia Clinical and Translational Science Alliance of the National Institutes of Health under tilldelning nr. UL1TR002378. Innehållet ovan är enbart författarnas ansvar och återspeglar inte de officiella åsikterna från National Institutes of Health.

Alla djurförsök som beskrivs nedan godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Emory University. Icke-hyperkolesterolemiska, ålders- och könsmatchade C57BL/6-möss användes för att mildra könsberoende variation och kompensera eventuella komplikationer av hyperkolesterolemiska tillstånd.
1. Partiell karotisligering (PCL) kirurgi
OBS: Partiell halspulsåderligering av LCA utfördes som tidigare beskrivits och visats3.</p...

<ol>
	<li>Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+atherosclerosis+development+in+C57Bl6+mice+by+overexpressing+AAV-mediated+PCSK9+and+partial+carotid+ligation.">Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation.</a> Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).</li><li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+carotid+ligation+is+a+model+of+acutely+induced+disturbed+flow,+leading+to+rapid+endothelial+dysfunction+and+atherosclerosis.">Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).</li><li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+disturbed+flow-induced+atherosclerosis+in+mouse+carotid+artery+by+partial+ligation+and+a+simple+method+of+RNA+isolation+from+carotid+endothelium.">A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861 (2010).</li><li>Dunn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-dependent+epigenetic+DNA+methylation+regulates+endothelial+gene+expression+and+atherosclerosis.">Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).</li><li>Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-dependent+regulation+of+genome-wide+mRNA+and+microRNA+expression+in+endothelial+cells+in+vivo.">Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo.</a> Scientific Data. 1 (1), 140039 (2014).</li><li>Ni, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+novel+mechanosensitive+genes+in+vivo+using+mouse+carotid+artery+endothelium+exposed+to+disturbed+flow.">Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow.</a> Blood. 116 (15), 66-73 (2010).</li><li>Son, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atypical+mechanosensitive+microRNA-712+derived+from+pre-ribosomal+RNA+induces+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis.">The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Communications. 4, 3000 (2013).</li><li>Andueza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+reprogramming+by+disturbed+flow+revealed+by+single-cell+RNA+and+chromatin+accessibility+study.">Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study.</a> Cell Reports. 33 (11), 108491 (2020).</li><li>Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+single-cell+chromatin+analysis+with+Signac.">Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+integration+of+single-cell+data.">Comprehensive integration of single-cell data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li><li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cell+death+by+trypan+blue+uptake+and+light+microscopy.">Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+cellular+heterogeneity+of+mouse+carotid+artery+under+disturbed+flow.">Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow.</a> Cell Death and Discovery. 7 (1), 180 (2021).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+activated+cell+populations+using+single-cell+RNA-seq.">Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li><li>O'Flanagan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+solid+tumor+tissues+with+cold+active+protease+for+single-cell+RNA-seq+minimizes+conserved+collagenase-associated+stress+responses.">Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.</a> Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).</li></ol>

Detta dokument ger ett detaljerat protokoll för att isolera encellspreparat från musens halspulsåder. Påverkan av d-flöde på endotelcellerna kan studeras noggrant om PCL-operationen utförs korrekt. Det är viktigt att korrekt identifiera grenarna i den gemensamma halspulsådern, såsom den yttre halspulsådern, den inre halspulsådern, occipitalartären och den överlägsna sköldkörtelartären. Validering av flödesmönster genom ultraljud validerar ytterligare den framgångsrika uppkomsten av d-fl?...

Detta laboratorium har tidigare visat att induktion av d-flöde leder till snabb och robust aterosklerosutveckling hos hyperlipidemiska möss 1,2. Den nya musmodellen av d-flödesinducerad åderförkalkning var möjlig med hjälp av partiell karotisligering (PCL) kirurgi 3. PCL-kirurgi inducerar lågt och oscillerande blodflödestillstånd eller d-flöde i den ligerade vänstra halspulsådern (LCA). Däremot fortsätter den kontralaterala högra halspulsådern (RCA) att möta stabilt laminärt flöde (s-flöde). Tidigare, för att förstå effekten av d-flöde på endotelceller, dissekerades halspulsådrorna ut efter partiell ligeringskirurgi och spolades med ett fenol- och guanidinisotiocyanatbaserat lysmedel (luminalt RNA / DNA-spolningsmetod)2,4, vilket gav endotelberikade "poolade bulk" RNA eller DNA. Dessa poolade bulk-RNA eller DNA bearbetades sedan för transkriptomiska studier eller epigenomiska DNA-metylomstudier, respektive 4,5,6. Dessa studier hjälpte till att upptäcka flera flödeskänsliga gener och mikroRNA vars roller i endotelbiologi och åderförkalkning undersöktes omfattande 4,6,7.
Trots endotelanrikning kunde dessa bulk-RNA / DNA-studier inte skilja den specifika rollen för varje celltyp i artärväggen vid d-flödesinducerad åderförkalkning. Endotelberikad encellsisolering (sc) och scRNA- och scATAC-sekvenseringsstudier utfördes för att övervinna denna begränsning8. För detta utsattes C57Bl6-möss för PCL-kirurgi för att inducera d-flöde i LCA medan de använde den s-flödesexponerade RCA som kontroll. Två dagar eller två veckor efter PCL-operationen offrades mössen och halspulsådrorna dissekerades och städades upp. Lumen hos både LCA och RCA infunderades med kollagenas, och de luminala kollagenasuppslutningarna innehållande ECs som en signifikant fraktion och andra arteriella celler samlades in. Encellssuspensionen (scRNAseq) eller enkärnesuspensionen (scATACseq) framställdes och streckkodades med unika identifierare för varje cell eller kärna med hjälp av en 10x Genomics-inställning. RNA utsattes för cDNA-biblioteksberedning och sekvenserades.
ScRNAseq- och scATACseq-datauppsättningarna bearbetades med hjälp av Cell Ranger Single-Cell Software och analyserades ytterligare av Seurat- och Signac R-paketen 9,10. Varje cell och kärna tilldelades en celltyp från dessa analyser och grupperades i celltypen baserat på markörgener och unika genuttrycksmönster. Resultaten av scRNAseq och scATACseq visade att dessa encellspreparat är berikade med ECs och även innehåller glattmuskelceller (SMC), fibroblaster och immunceller.
Ytterligare analyser visade att EG-populationen i den luminala digestionen är mycket divergerande och plastisk (8 olika EG-kluster) och lyhörd för blodflödet. Viktigast av allt, dessa resultat visade att d-flow omprogrammerar ECs från en aterosskyddad antiinflammatorisk fenotyp till pro-aterogena fenotyper, inklusive proinflammatorisk, endotel-till-mesenkymal övergång, endotelstam / stamcellsövergång och mest överraskande, endotel-till-immuncellliknande övergång. Dessutom avslöjar scATACseq-data nya flödesberoende kromatintillgänglighetsförändringar och transkriptionsfaktorbindningsställen på ett genomomfattande sätt, vilket ligger till grund för flera nya hypoteser. Metodiken och protokollet för beredning av enstaka endotelceller för encelliga multi-omics-studier från mushalspulsådrorna beskrivs nedan.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (Cell Culture Grade)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21040CMX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022-43-108-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile</td>
			<td>Fablab</td>
			<td>FL4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL SuperClear Centrifuge Tubes</td>
			<td>Labcon</td>
			<td>3191-335-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk Suture Sterile</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>s-1172 c2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged</td>
			<td>Thermo Fisher Scientic</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase solution,sterile-filtered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000123/ 2000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>RXBUPRENOR5-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Controller &#38; Next GEM Accessory Kit</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#39; Reagent Kits v3.1</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2100502.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D141-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co</td>
			<td>RS-5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase1</td>
			<td>New England Biolabs Inc</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Benchtop-Model # 5425)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620444230VR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium Select</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed Angle Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>FA-45-24-11-Kit Rotor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffered saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>51558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson vet</td>
			<td>789 313 89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACs Smart Strainers (30 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (100 &#181;m)</td>
			<td>&#160;Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline (0.9% sodium chloride)</td>
			<td>Baxter International Inc</td>
			<td>2B1323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei Buffer (20x)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN 2000153/2000207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientic</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co</td>
			<td>RS-5675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-5480</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Mend II</td>
			<td>Webster Veteinanry</td>
			<td>07-856-7946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II Collagenase</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>2100502.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deposited Data</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scATACseq FastQ files</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scRNAseq FastQ files</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Ranger 3.1.0</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cicero</td>
			<td>Pliner et al., 2018</td>
			<td>https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ggplot2 v3.2.1</td>
			<td>Hadley Wickham</td>
			<td>https://cran.r-project.org</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony</td>
			<td>Korsunsky et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/immunogenomics/harmony</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Schneider et al., 2012</td>
			<td>https://imagej.nih.gov</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocle 2.8.0</td>
			<td>Qiu et al., 2017</td>
			<td>https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 3.6.2</td>
			<td>R Foundation</td>
			<td>https://www.r-project.org</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seurat 3.1.3</td>
			<td>Stuart et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/satijalab/seurat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signac 0.2.5</td>
			<td>Stuart et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/timoast/signac</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments

Ateroskleros är en inflammatorisk sjukdom i de arteriella regionerna som utsätts för stört blodflöde (d-flöde). D-flöde reglerar uttrycket av gener i endotelet på transkriptomiska och epigenomiska nivåer, vilket resulterar i proaterogena svar. Nyligen utfördes encellig RNA-sekvensering (scRNAseq) och encellsanalys för Transposase Accessible Chromatin sequencing (scATACseq) -studier för att bestämma de transkriptomiska och kromatintillgänglighetsförändringarna vid en encellsupplösning med hjälp av musens partiella karotisligeringsmodell (PCL). Eftersom endotelceller (EC) representerar en mindre bråkdel av de totala cellpopulationerna i artärväggen användes en luminal matsmältningsmetod för att erhålla EC-berikade encellspreparat. För denna studie utsattes möss för PCL-kirurgi för att inducera d-flöde i den vänstra halspulsådern (LCA) medan de använde den högra halspulsådern (RCA) som en kontroll. Halspulsådrorna dissekerades ut två dagar eller två veckor efter PCL-operationen. Lumen i varje halspulsåder utsattes för kollagenasförtunning och endotelberikade enstaka celler eller enstaka kärnor erhölls. Dessa encells- och enkärniga preparat streckkodades därefter med hjälp av en 10x Genomics mikrofluidisk inställning. De streckkodade encellerna och enkärnorna användes sedan för RNA-beredning, biblioteksgenerering och sekvensering på en DNA-sekvenserare med hög genomströmning. Efter bioinformatikbehandling identifierade scRNAseq- och scATACseq-dataseten olika celltyper från den luminala matsmältningen, främst bestående av ECs. Glattmuskelceller, fibroblaster och immunceller var också närvarande. Denna EC-anrikningsmetod hjälpte till att förstå effekten av blodflödet på endotelet, vilket kunde ha varit svårt med den totala artärsmältningsmetoden. Den EC-berikade encellsberedningsmetoden kan användas för att utföra encelliga omics-studier i EC-knockouts och transgena möss där effekten av blodflödet på dessa gener inte har studerats. Viktigt är att denna teknik kan anpassas för att isolera EC-berikade enskilda celler från mänskliga artärutväxter för att utföra liknande mekanistiska studier.

Partiella karotisligeringsoperationer utfördes på 44 möss, och uppkomsten av d-flöde i LCA validerades genom att utföra ultraljud en dag efter partiell ligeringskirurgi. Framgångsrik partiell ligeringskirurgi orsakar minskad blodflödeshastighet och vänder blodflödet (stört flöde) i LCA3. Halspulsådrorna dissekerades ut antingen vid två dagar eller vid två veckor efter ligering. Lumen i varje karotis utsattes för kollagenasförtunning och endotelberikade enkelceller eller en...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments at JoVE.com

Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments

Vi presenterar en metod för att isolera endotelceller och kärnor från lumen i mushalspulsåder som utsätts för stabila eller störda flödesförhållanden för att utföra encelliga omics-experiment.

Isolering av endotelceller från lumen i mushalspulsåder för encelliga multi-omics-experiment

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in ...

I ett blodkärl är antalet endotelceller mycket lågt, vilket gör det svårt att studera dem. Vårt protokoll eliminerar denna begränsning och låter oss studera nya molekylära vägar och terapier. Vårt protokoll tillåter oss att erhålla endotelberikade prover och studera hur akut och kroniskt stört flöde påverkar denna celltyp.Möjligheten att studera endotelceller mer detaljerat gör det möjligt att definiera målgener och därmed potentiella terapier för ateroskleros riktade mot endotelceller. Halspulsåderisolering är knepigt och kräver tålamod och erfarenhet. Börja med att förbereda djuret genom att injicera 0,05 milligram per kilo buprenorfin subkutant.Sterilisera det epilerade området med betadin och isopropanollösning tre gånger. Gör ett ventralt mittlinjesnitt på ungefär en centimeter i nackområdet. Exponera sedan LCA-grenpunkten genom trubbig dissektion.Ligate den vänstra inre carotid, yttre carotid och occipital artärer med 6-0 suturer, vilket lämnar den överlägsna sköldkörtelartären orörd. Stäng snittet med vävnadslim eller suturer. Överför musen till en förvärmd återhämtningsbur som hålls vid 37 grader Celsius.Placera musen på en ren handduk i upp till en timme för att undvika hypotermi efter operationen. Sätt in en 21 gauge nål i IV-linjen ansluten genom hjärtans topp i vänster kammare. Tillåt retrograd perfusion i två till tre minuter med normal saltlösning vid rumstemperatur.Behåll en konstant flödeshastighet genom att applicera stadigt tryck medan du injicerar eller använder en IV-linje och håller saltlösningspåsen på en höjd av åtta till nio fot. Ta bort huden från nackregionen med allt fett, muskler och bindväv för att exponera halspulsåderna. Ta sedan bort periadventitialvävnaderna runt halspulsåderna och lämna halshalsen fäst vid kroppen.Gör ett snitt under ligeringsstället i LCA för att tillåta perfusion. Persfuse LCA genom vänster kammare i ytterligare en minut för att ta bort eventuella blodspår. Tvätta utsidan av halspulsådrorna med normal saltlösning för att ta bort eventuella spår av blod.Använd en insulinspruta med en 29 gauge nål för att injicera 50 mikroliter matsmältningsbuffert i lumen i den distala änden av vänster halspulsåder. Använd ett mikroklämma för att klämma fast den proximala änden av halspulsådern fylld med matsmältningsbuffert. Tillsätt 15 till 20 mikroliter matsmältningsbuffert i lumen och klipp den distala änden för att undvika frisättning av matsmältningsbuffert.Överför halspulsådrorna från musen till 35 millimeter diskar som innehåller varm 37 grader Celsius HEPES-buffrad saltlösning. Och inkubera dem i 45 minuter vid 37 grader Celsius med intermittent gungning. Ta bort halspulsådern med klämmorna från 35 millimeterskålen efter att den luminala enzymatiska matsmältningen är klar.Lossa klämmorna försiktigt så att matsmältningsbufferten inte läcker. Håll ena änden av halspulsådern ovanpå ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt 100 mikroliter varm matsmältningsbuffert till lumen genom att sätta in en 29 gauge nål utrustad med en insulinspruta.Spola snabbt lumen i halspulsådern i mikrocentrifugröret och tillsätt sedan 0,3 mikroliter FBS i röret för att stoppa reaktionen. Placera mikrocentrifugröret på is. Centrifugera cellerna vid 500 G i fem minuter vid fyra grader Celsius, med hjälp av en centrifug utrustad med en rotor med fast vinkel och kassera supernatanten.Återupptäck cellerna i matsmältningsbuffert, innehållande celldissociationsreagens, och inkubera dem i fem minuter vid 37 grader Celsius för att separera dem i enskilda celler. Blockera den enzymatiska reaktionen genom att tillsätta 0,15 ml FBS till 0,5 ml röret och upprepa centrifugeringen. Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i 100 mikroliter iskall 1% BSA-lösning i PBS i ett 0,2 ml mikrocentrifugrör.För encellsanalys, återsuspendera pelleten med 100 mikroliter iskall 1% BSA i PBS i ett 0,2 milliliter rör. För analys av en kärna, återsuspendera cellpelleten i 100 mikroliter 0,04% BSA i iskall PBS och centrifugera encellssuspensionen vid 500 G vid fyra grader Celsius i fem minuter. Sönderdela encellssuspensionen med iskall lysbuffert och inkubera i fem minuter på is.Blanda lysatet med en P20-pipett och inkubera i ytterligare 10 minuter. Överför sedan lysatet i ett 0,5 milliliter rör. Tvätta ly-cellerna med 500 mikroliter buffert och blanda dem med en pipett.Upprepa sedan centrifugeringen. Kassera supernatanten och återsuspendera kärnpelleten i 150 mikroliter av den utspädda kärnbufferten. Räkna de enskilda kärnpreparaten med hjälp av en hemocytometer.Efter sekvenseringsstudien med en kärna erhölls och visualiserades encells- och enkärniga kärnor genom ljusfälts- och faskontrastmikroskopi. Effektiviteten hos enstaka kärnberedning från encellssuspensionen demonstrerades också. Efter encells-RNA-sekvenseringsstudien erhölls olika parametrar såsom fördelning av gener per cell, unik molekylär identifierare per cell, mitokondriella avläsningar per cell och sekvenseringsmättnadsdata.För ATAC-sekvensstudien med en cell observerades insatsstorleksfördelningen, inklusive nukleosombandningsmönstret. Den normaliserade TSS-anrikningspoängen observerades också. Dessutom läser procentfragmentet i topparna.Toppregionfragment, TSS-anrikningspoäng, förhållande mellan läsningar i svartlistans genomiska platser och nukleosomsignalförhållande bestämdes. Den enzymatiska matsmältningen är en stress för cellerna, därför är det viktigt att hålla proverna på is och utföra proceduren så snabbt som möjligt. Vi kan använda denna metod för att erhålla och platta endotelceller från möss.Vi kan också använda denna teknik för att utföra bulk Omix-baserade studier. Denna teknik banade väg för att studera effekten av stört blodflöde på endotelceller in vivo på ett enda cellsätt.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Isolering av valvulär endotelceller

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Isolering av näthinnan stamceller från mus Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Isolering och odling av pulmonell endotelceller från neonatala möss

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generering av möss härledda från inducerade pluripotenta stamceller

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

Isolering av Microvascular Endothelial Rör från mus Resistance Artärer

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolering av murint Ventil Endotelceller

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering och Primär kultur av mus aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Isolering av mus koronära endotelceller

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Isolering och karakterisering av mus primära lever sinusformade endotelceller

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

Isolering av villkorligt förevigade musglomerulära endotelceller med fluorescerande mitokondrier

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...