Name: preparation of bead-supported lipid bilayers to study the particulate output of t cell immune synapses
Uploaded: 2022-04-01T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses at JoVE.com

نحن ممتنون لأعضاء مختبرنا ومجتمع معهد كينيدي لأمراض الروماتيزم على المناقشات العلمية البناءة ، وخاصة مدير مرفق قياس التدفق الخلوي جوناثان ويبر. تم تمويل هذا العمل من قبل زمالة Wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z ، ومنحة ERC المتقدمة (SYNECT AdG 670930) ، وصندوق كينيدي لأبحاث الروماتيزم (KTRR) (الثلاثة إلى MLD). تم دعم PFCD من قبل زمالة EMBO طويلة الأجل (ALTF 1420-2015 ، بالتعاون مع المفوضية الأوروبية (LTFCOFUND2013 ، GA-2013-609409) وماري Sklodowska-Curie Actions) وزمالة أكسفورد-بريستول مايرز سكويب.

1. قياس كثافة البروتين على سطح الخلية مع قياس التدفق الخلوي الكمي
<ol><li>قم بإعداد المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي البشري المصفى بسعة 0.22 ميكرومتر (hFCB) عن طريق إضافة EDTA (إلى تركيز نهائي 2 ملليمتر) ومصل AB البشري (إلى 10٪ نهائي) إلى محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) ، الرقم الهيدروجيني 7...

<ol>
	<li>Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+to+reconstitute+immune+cell+signaling.">Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling.</a> FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).</li><li>Choudhuri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+release+of+T-cell-receptor-enriched+microvesicles+at+the+immunological+synapse.">Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological synapse.</a> Nature. 507 (7490), 118-123 (2014).</li><li>Saliba, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+structure+of+synaptic+ectosomes+exporting+antigen+receptor+linked+to+functional+CD40+ligand+from+helper+T+cells.">Composition and structure of synaptic ectosomes exporting antigen receptor linked to functional CD40 ligand from helper T cells.</a> elife. 8, 47528 (2019).</li><li>Barcia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+polarization+of+IFN-gamma+at+Kupfer+and+non-Kupfer+immunological+synapses+during+the+clearance+of+virally+infected+brain+cells.">In vivo polarization of IFN-gamma at Kupfer and non-Kupfer immunological synapses during the clearance of virally infected brain cells.</a> Journal of Immunology. 180 (3), 1344-1352 (2008).</li><li>Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+use+two+directionally+distinct+pathways+for+cytokine+secretion.">T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion.</a> Nature Immunology. 7 (3), 247-255 (2006).</li><li>Kupfer, A., Mosmann, T. R., Kupfer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+expression+of+cytokines+in+cell+conjugates+of+helper+T+cells+and+splenic+B+cells.">Polarized expression of cytokines in cell conjugates of helper T cells and splenic B cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (3), 775-779 (1991).</li><li>Kupfer, H., Monks, C. R., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+splenic+B+cells+that+bind+to+antigen-specific+T+helper+(Th)+cells+and+face+the+site+of+cytokine+production+in+the+Th+cells+selectively+proliferate:+immunofluorescence+microscopic+studies+of+Th-B+antigen-presenting+cell+interactions.">Small splenic B cells that bind to antigen-specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate: immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen-presenting cell interactions.</a> Journal of Experimental Medicine. 179 (5), 1507-1515 (1994).</li><li>Reichert, P., Reinhardt, R. L., Ingulli, E., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+in+vivo+identification+of+TCR+redistribution+and+polarized+IL-2+production+by+naive+CD4+T+cells.">Cutting edge: in vivo identification of TCR redistribution and polarized IL-2 production by naive CD4 T cells.</a> Journal of Immunology. 166 (7), 4278-4281 (2001).</li><li>Gerard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+T+cell-T+cell+synaptic+interactions+drive+the+differentiation+of+protective+CD8++T+cells.">Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8+ T cells.</a> Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).</li><li>Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+planar+bilayers+for+study+of+the+immunological+synapse.">Supported planar bilayers for study of the immunological synapse.</a> Current Protocols in Immunology. , (2007).</li><li>Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2021)</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+compensation+for+flow+cytometry:+visualization+artifacts,+limitations,+and+caveats.">Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats.</a> Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).</li><li>Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+T+cells+is+induced+by+binding+to+nickel-chelating+lipids+in+supported+lipid+bilayers.">Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers.</a> Frontiers in Physiology. 11, 613367 (2020).</li><li>Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+spillover+spreading+for+comparing+instrument+performance+and+aiding+in+multicolor+panel+design.">Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design.</a> Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).</li><li>C&#233;spedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+antigen-presenting+cells+reveal+the+diversity+and+functional+specialisation+of+extracellular+vesicles+composing+the+fourth+signal+of+T+cell+immunological+synapses.">Synthetic antigen-presenting cells reveal the diversity and functional specialisation of extracellular vesicles composing the fourth signal of T cell immunological synapses.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Yoon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+non-activated+lymphocytes+using+three-dimensional+refractive+index+tomography+and+machine+learning.">Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distributions+of+autofluorescence+after+compensation:+Be+panglossian,+fret+not.">Distributions of autofluorescence after compensation: Be panglossian, fret not.</a> Cytometry A. 89 (4), 398-402 (2016).</li><li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+controls,+instrument+setup,+and+the+determination+of+positivity.">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li><li>Balint, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+attack+particles+are+autonomous+killing+entities+released+from+cytotoxic+T+cells.">Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells.</a> Science. 368 (6493), 897-901 (2020).</li><li>Cespedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+expression+of+the+hRSV+nucleoprotein+impairs+immunological+synapse+formation+with+T+cells.">Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).</li></ol>

BSLBs هي أدوات متعددة الاستخدامات لدراسة إخراج الجسيمات من الخلايا التائية التي يتم تحفيزها باستخدام أغشية APC النموذجية. تسمح مرونة الطريقة بإعادة تكوين تركيبات الأغشية المعقدة والاختزالية لدراسة آثار الأربطة وإشاراتها على إفراز tSVs وجزيئات الهجوم فوق الجزيئي ومكوناتها. لقد اختبرنا هذه ال...

المشبك المناعي (IS) هو بنية جزيئية محورية تشكلت في واجهة الخلايا المشاركة في الاتصال المادي الذي يسهل التبادل المنظم للمعلومات juxtracrine. تم وصف ISs مختلفة في الأدبيات ، وتشير مجموعة متزايدة من الأدلة إلى أن هذه المحاور الجزيئية هي سمة محفوظة للشبكات الخلوية. تتبادل الخلايا المناعية المختلفة، بما في ذلك الخلايا البائية والخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا المتغصنة والبلاعم والخلايا التائية، المعلومات عبر تجميع جهات الاتصال قصيرة العمر1. تعمل الدراسات متعددة الأطوار على تطوير فهم مجموعات فرعية جديدة من الكريات البيض والخلايا اللحمية التي تقود الشبكات الخلوية المسببة للأمراض وتعبر عن البروتينات السطحية ذات الوظائف غير المعروفة. كمدادات APC اصطناعية ، تسمح BSLBs بالتحقيق المباشر في الدور الوظيفي للبروتينات الفردية في دمج إشارات التنشيط ، أي المستضدات والتحفيز / التكبت المشترك ، بواسطة الخلايا التائية والإطلاق الناتج عن جزيئات المستجيب المشار إليها باسم الإشارة الرابعة.
تصف هذه الورقة البروتوكولات والنقاط التقنية الحرجة التي يجب مراعاتها أثناء استخدام BSLBs لمحاكاة التركيب السطحي ل APCs النموذجية. يتم تقديم بروتوكولات القياس الكمي للمستقبلات المناعية والبروتينات السطحية الأخرى على APCs جنبا إلى جنب مع بروتوكول إعادة تشكيل APCs الاصطناعية التي تحتوي على هذه الكميات المقاسة. بعد ذلك ، يتم تقديم الخطوات المطلوبة لزراعة الخلايا التائية و BSLB جنبا إلى جنب مع بروتوكول القياس الكمي لنقل الجسيمات عبر المشبكية باستخدام قياس التدفق الخلوي. والأكثر لفتا للنظر هو أن BSLBs تسهل دراسة مجموعة مشتقة من غشاء البلازما من tSVs تسمى الإكستومات المشبكية (SEs). يتم التخلص من SEs المخصب بمستقبلات مستضدات الخلايا التائية (TCR+) استجابة لمحفزات TCR2 ويتم التقاطها بكفاءة بواسطة BSLBs3 ، مما يمثل قراءة ممتازة لتقييم الخصائص الناهضة للمستضدات وتكوين الغشاء النموذجي. يتم إطلاق الإكسوسومات CD63+ وجزيئات الهجوم فوق الجزيئي (SMAPs) أيضا بواسطة الخلايا التائية المحفزة والتقاطها بواسطة BSLBs. يمكن استخدامها كقراءات إضافية للتنشيط وإفراز الحبيبات الخارجية والليزتيكية الناتجة بواسطة الخلايا التائية. كما أن تعبئة الحويصلات الخارجية إلى القطب المتفاعل للخلية التائية تسهل أيضا الإطلاق الاتجاهي للسيتوكينات ، مثل IL-2 و IFN-γ و IL-10 استجابة للتنشيط 4،5،6،7،8. على الرغم من أنه يمكن أيضا اكتشاف السيتوكينات التي تطلق الخلايا التائية على BSLBs ، إلا أنه يجري حاليا تطوير دراسة أكثر تكريسا للتحقق من صحة التحليل الكمي لإطلاق السيتوكين في المشبك المناعي.
لاستجواب كيفية تأثير تركيبات غشائية محددة على الناتج المشبكي للخلايا التائية يتطلب تحديد الكثافة الفسيولوجية لمكون الغشاء المستهدف. تعد القياسات الكمية القائمة على قياس التدفق الخلوي لبروتينات سطح الخلية خطوة أساسية في هذا البروتوكول وتتطلب: 1) استخدام الأجسام المضادة ذات الأعداد المعروفة من الفلوروكرومات لكل جسم مضاد (F / P) ، و 2) الخرز القياسي الذي يوفر مرجعا قياسيا لاستيفاء جزيئات الفلوروكروم من متوسط كثافة التألق المقاسة (MFIs).
تتكون هذه المعايير المرجعية من خمس مجموعات من الخرز ، يحتوي كل منها على عدد متزايد من الفلوروكرومات القابلة للذوبان المكافئة (MESFs) ، والتي تمتد عبر النطاق الديناميكي للكشف الاعتباطي التعسفي. تنتج هذه المجموعات السكانية القياسية قمم فلورية منفصلة ، مما يسهل تحويل وحدات التألق التعسفية إلى MESFs عن طريق الانحدار الخطي البسيط. ثم يتم استخدام MESFs الناتجة جنبا إلى جنب مع قيم الأجسام المضادة F / P لحساب متوسط عدد الجزيئات المرتبطة لكل خلية (أو BSLB في خطوات لاحقة). ثم يتيح تطبيق مساحات سطح الخلية المقدرة على متوسط عدد الجزيئات المكتشفة حساب الكثافات الفسيولوجية كجزيئات/ميكرومتر2. يمكن أيضا تكييف بروتوكول القياس الكمي هذا لقياس كثافات البروتين على الخلايا التائية وإعادة التركيب الكيميائي الحيوي لتركيبات الغشاء التي تتوسط في تكوين نقاط الاشتباك العصبي للخلايا التائية المتجانسة (أي نقاط الاشتباك العصبي T-T9). إذا لزم الأمر ، يمكن زيادة تقدير تكافؤ ارتباط الأجسام المضادة باستخدام أهداف مؤتلفة تحمل أعدادا معروفة من الفلوروكروم لكل جزيء. بعد ذلك ، يمكن حساب التكافؤ المرتبط بالأجسام المضادة لنفس مجموعة BSLB عن طريق مقارنة عدد البروتينات الفلورية المرتبطة والأجسام المضادة الكمي في وقت واحد (باستخدام اثنين مختلفين من الفلوروكرومات الكمية ومعايير MESF).
تتطلب إعادة تكوين أغشية APC تجميع الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة (SLBs) على حبات السيليكا 1. يمكن تسخير مخزونات الجسيمات الشحمية التي تحتوي على أنواع مختلفة من الدهون الفوسفاتية لتشكيل مصفوفة متعددة الاستخدامات ثنائية الطبقة من الدهون ، مما يتيح تثبيت البروتينات المؤتلفة مع كيمياء ربط مختلفة (يتم تفصيل إعداد الجسيمات الشحمية في 10). بمجرد تحديد الكثافة الفسيولوجية (أو الكثافات) للرباط ذي الصلة "على الخلايا" ، يتم تكييف نفس بروتوكول قياس التدفق الخلوي لتقدير تركيز البروتين المؤتلف اللازم لطلاء BSLBs بالكثافة الفسيولوجية المستهدفة. يمكن استخدام نظامي تثبيت مختلفين إما مجتمعين أو بشكل منفصل.
أولا ، SLB الذي يحتوي على 12.5 مول ٪ من الدهون الفوسفاتية المحتوية على Ni2 + يكفي لتوفير ما يقرب من 10000 موقع ربط علامته لكل ميكرون مربع 10 ويعمل بشكل جيد لتزيين BSLBs بمعظم البروتينات المتاحة تجاريا والتي لا تتجاوز كثافاتها الفسيولوجية قدرة التحميل القصوى هذه. يسخر نظام التحميل الثاني الدهون الفوسفاتية المحتوية على البيوتين (مثل مول٪) لتحميل البيوتينيل المضاد ل CD3e Fab (أو مونومرات HLA / MHC) عبر جسور الستربتافيدين. ثم يتيح الجمع بين هاتين الطريقتين للزينة BSLB الخياطة المرنة ل BSLBs كمدادات APCs اصطناعية. بالنسبة للتركيبات السطحية APC المعقدة للغاية ، يمكن زيادة نسبة المول٪ من الدهون الفوسفاتية والبروتينات لتحميل أكبر عدد ممكن من البروتينات التي يتطلبها السؤال المطروح. بمجرد تحديد تركيزات العمل من البروتينات و mol٪ من الدهون الفوسفاتية البيوتينيل ، يمكن تجميع BSLBs لاستجواب الإخراج المشبكي للخلايا التائية باستخدام قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات.

preparation of bead-supported lipid bilayers to study the particulate output of t cell immune synapses

تقدم الخلايا التي تقدم المستضدات (APCs) ثلاث إشارات تنشيط للخلايا التائية المشاركة في الاتصال الجسدي: 1) المستضد ، 2) التحفيز / التكبت المشترك ، و 3) السيتوكينات القابلة للذوبان. تطلق الخلايا التائية نوعين من الجسيمات المستجيبة استجابة للتنشيط: الحويصلات عبر المشبكية (tSVs) وجزيئات الهجوم فوق الجزيئي ، التي تنقل الرسل بين الخلايا والسمية الخلوية الوسيطة ، على التوالي. يتم استيعاب هذه الكيانات بسرعة من قبل APCs المشاركة في اتصال جسدي مع الخلايا التائية ، مما يجعل توصيفها شاقا. تقدم هذه الورقة بروتوكول تصنيع واستخدام الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة بالخرز (BSLBs) كمحاكاة للخلايا التي تقدم المستضدات (APC) لالتقاط وتحليل هذه الجسيمات عبر المشبكي. كما تم وصف بروتوكولات القياسات المطلقة لكثافات البروتين على أسطح الخلايا ، وإعادة تكوين BSLBs بهذه المستويات الفسيولوجية ، وإجراء قياس التدفق الخلوي لتتبع إطلاق الجسيمات المشبكية بواسطة الخلايا التائية. يمكن تكييف هذا البروتوكول لدراسة آثار البروتينات الفردية ، ومخاليط الليغاند المعقدة ، ومحددات الضراوة المسببة للأمراض ، والأدوية على مخرجات المستجيب للخلايا التائية ، بما في ذلك الخلايا التائية المساعدة ، والخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا ، والخلايا التائية التنظيمية ، والخلايا التائية المعبرة عن مستقبلات المستضدات الخيمرية (CART).

FCM لتحديد كمية البروتين المطلق على سطح الخلية تتطلب إعادة تكوين BSLBs التي تقدم كثافات فسيولوجية للروابط تقدير كثافة البروتين الكلية على المجموعة الفرعية للخلايا النموذجية. لإعادة تشكيل BSLBs ، قم بتضمين أي روابط ذات صلة من المتوقع أن تلعب دورا في محور الإشارة ذي الأهمية إلى جانب ال...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses at JoVE.com

Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses

نقدم هنا بروتوكول إعادة التشكيل التدريجي للخلايا الاصطناعية التي تقدم المستضدات باستخدام الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة بالخرز واستخدامها لاستجواب الإخراج المشبكي من الخلايا التائية المنشطة.

تحضير الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة بالخرز لدراسة إنتاج الجسيمات من المشابك المناعية للخلايا التائية

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) ...

وقد اقتصرت دراسة ناتج المشبك المناعي في الغالب على الطرق المجهرية. قامت BSLBs بتوسيع ذخيرتنا من الأدوات التي يمكن استخدامها لدراسة مخرجات المشابك المناعية للخلايا التائية ، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي ، والفحص المجهري ، والبروتينات ، وتقنيات تسلسل الحمض النووي الريبي. على هذا النحو ، يمكن استخدام BSLBs في مجموعة واسعة من أسئلة علم المناعة وفي تحديد التركيب والتنظيم الكيميائي الحيوي لإخراج الخلايا التائية.ويشمل ذلك ، على سبيل المثال ، دراسة مستقبلات المستضدات الخيمرية ، أو الأدوية التي تمنع مسارات إشارات محددة ، أو الاستئصال الجيني للجينات ذات الاهتمام. أحد الجوانب الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو تحسين معايرات البروتين ولوحة قياس التدفق الخلوي متعددة الألوان اللازمة لتتبع الجسيمات العابرة للمتشابك ذات الاهتمام. وهذا يتطلب التكرار المنهجي لتركيزات البروتين وتركيزات الأجسام المضادة وإعدادات الأداة.ابدأ بتخفيف ميكرولتر واحد من محلول الخرز مع 1000 ميكرولتر من PBS. عد الخرز باستخدام غرفة مقياس الدم واحسب تركيزها لكل ملليلتر. بعد ذلك ، احسب حجم حبات السيليكا اللازمة ل 500،000 BSLBs النهائي لكل نقطة معايرة.انقل الحجم المطلوب من حبات السيليكا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 ملليلتر. اغسل حبات السيليكا ثلاث مرات بملليلتر واحد من PBS المعقم وطرد الخرز مركزيا. تحضير ثلاثة مجلدات من المزيج الرئيسي للجسمات الشحمية التي تحتوي على 12.5 في المئة من الدهون الفوسفاتية المحتوية على النيكل.استخدم المزيج الرئيسي للشحم لإعادة تعليق حبات السيليكا المغسولة. ثم ، امزجها بلطف عن طريق سحب نصف الحجم الإجمالي لأعلى ولأسفل. باستخدام تقنية معقمة ، أضف غاز الأرجون أو النيتروجين إلى الأنبوب لإزاحة الهواء وحماية الدهون من الأكسدة أثناء الخلط.أضف الأرجون إلى مخزون الدهون 0.4 ملليمولار. تخزين المخزون والتعامل معه باستخدام تقنية معقمة. حرك BSLBs إلى الخلاط الرأسي واخلطها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام الخلط المداري عند 10 دورات في الدقيقة.ثم ، قم بتدوير الخرز عن طريق الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة على جهاز طرد مركزي صغير على مقاعد البدلاء. قم بحظر BSLBs المشكلة عن طريق إضافة ملليلتر واحد من 5٪ BSA يحتوي على 100 ميكرومول من كبريتات النيكل لتشبع مواقع NTA على BSLBs. اغسل ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت HBS-HSA لإزالة محلول الحجب الزائد.خذ صفيحة U-bottom أو V-bottom 96-well جديدة وقم بإعداد تخفيفات تسلسلية مزدوجة للبروتينات. أعد تعليق BSLBs المحضرة في وحدة تخزين بحيث تحتوي 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت HBS-HSA على 500،000 BSLBs. بعد ذلك ، خذ لوحة أخرى من U-bottom أو V-bottom 96-well وانقل 100 ميكرولتر من تعليق BSLB إلى الآبار بطريقة تتلقى كل بئر 500،000 BSBLs.قم بتدوير اللوحة الثانية في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين عند 300x G.تخلص من المادة الفائقة وانقل أحجام 100 ميكرولتر من لوحة معايرة البروتين إلى اللوحة التي تحتوي على BSLBs الرسوبية. استخدم رقائق الألومنيوم لحمايتها من الضوء واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة عند 1000 دورة في الدقيقة.ثم اغسل اللوحة ثلاث مرات عن طريق إضافة مخزن مؤقت HBS-HSA إلى اللوحة وقم بتدويرها في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين عند 300x G.Count الخلايا بعد الغسيل. ثم قم بتخفيفها إلى تركيز نهائي قدره 2.5 مليون لكل ملليلتر باستخدام وسيط فحص النقل المتشابك. بمجرد تحميل BSLBs بمزيج البروتين ، اغسل BSLBs مرتين باستخدام المخزن المؤقت HBS-HSA لإزالة البروتينات الزائدة غير المقيدة.إعادة تعليق 500،000 BSLBs لكل بئر في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت HBS-HSA. انقل 100 ميكرولتر من BSLBs لكل بئر إلى لوحة جديدة من 96 بئرا ذات قاع U لعمل نسخة مكررة ، بحيث تكون الكمية النهائية من BSLB لكل بئر هي 250،000. قم بتدوير BSLBs بسرعة 300x G لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.تخلص من السوبرناتانت ثم أعد تعليق BSLBs باستخدام 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا التائية. تخلط بلطف لمنع تشكيل الفقاعات. احتضان الثقافات المشتركة لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية.حماية الخلايا من الضوء وتبريد الثقافات المشتركة عن طريق احتضانها أولا في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 15 دقيقة. الطرد المركزي للمزارع المشتركة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق في 500x G.تخلص من supernatant وأعد تعليق الثقافات المشتركة في الكالسيوم والمغنيسيوم الخالية من الأيونات 2٪ BSA PBS في درجة حرارة الغرفة للحظر. ضع الخلايا على الثلج لمدة 45 دقيقة وقم بحمايتها من الضوء.قم بإعداد المزيج الرئيسي للأجسام المضادة باستخدام الثلج البارد بنسبة 0.22 ميكرومتر مصفى بنسبة 2٪ BSA و PBS كمخزن مؤقت للتلطيخ. سيوفر هذا المزيج الرئيسي حظرا إضافيا. قم بتدوير الثقافات المشتركة عند 500x G لمدة خمس دقائق وأربع درجات مئوية.تخلص من المواد الخارقة ، ثم استخدم ماصة متعددة القنوات لإعادة تعليق الخلايا في المزيج الرئيسي الملون الذي يحتوي على تركيزات الأجسام المضادة المحسنة. قم بتضمين الخلايا ذات العلامات المتساوية و BSLBs ، و BSLBs الفلورية وغير الفلورية ، والخلايا و BSLBs الملطخة وحدها. اخلطي بلطف عن طريق سحب نصف الحجم لأعلى ولأسفل.احتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد وحمايتها من الضوء. اغسل الخلايا و BSLBs مرتين باستخدام 2٪ BSA PBS البارد المثلج. قم بتدويرها بسرعة 500 × G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.بعد الطرد المركزي ، تحقق من الاستزراع المشترك المترسب في قاع الآبار. ثم ، أعد تعليق الثقافات المشتركة المغسولة في 100 ميكرولتر من PBS واحصل عليها على الفور. قم بتنشيط مقياس السجل للضوء المتناثر على الجانب ومعلمة وقت الطيران للأضواء الجانبية والأمامية.احصل على معايير MESF ، مما يضمن سقوط كل من المجموعات الخافتة والأكثر سطوعا في النطاق الخطي للأداة. بعد ذلك ، احصل على عينات التعويض ، واحسب التعويض ، وطبق مصفوفة التعويض على التجربة. احصل على ما لا يقل عن 20،000 معيار MESF إجمالي وحفظه لكل قناة قياس كمي.تجنب استخدام سائل غمد FACS أو ما شابه ذلك لإعادة تعليق حبات MESF ، لأنها تحتوي على أملاح وكحول من شأنها تدمير الفلوروكرومات ، مما يؤدي إلى قمم تألق أوسع وخطأ كبير. للاقتناء باستخدام أجهزة أخذ العينات عالية الإنتاجية ، قم بتعيين اكتساب الأدوات إلى قياسي ، واضبط الحصول على العينة على 80 ميكرولتر. معدل تدفق العينة بين اثنين وثلاثة ميكرولترات في الثانية ، حجم خلط العينة عند 50 ميكرولتر ، خلط العينة 150 ميكرولتر في الثانية ، والخلط لكل بئر بين ثلاثة وخمسة.احصل على ما لا يقل عن 10،000 BSLBs واحدة لكل عينة. وأخيرا، تصدير ملفات FCS. يظهر هنا مثال على قياسات قياس التدفق الخلوي الكمي ل ICAM-1 على سطح الخلايا البائية اللوزتين والخلايا التائية المساعدة.تصف الصور التمثيلية استراتيجية البوابة لتحليل خلايا CXCR5 B المفردة والخلايا التائية المساعدة الجريبية المعزولة من اللوزتين الحنكية البشرية. تحدد استراتيجية البوابة المتسلسلة هذه الأحداث الحية الفردية داخل نافذة الاستحواذ المستمر. يتم عرض الثنائيات ، التعبير عن سطح الخلية من ICAM-1 مقارنة بضوابط FMO وضوابط FMO الموسومة بأنماط متساوية ذات صلة من السكان ، هنا.يتم عرض بوابات وقياس مؤسسات التمويل الأصغر من مجموعات MESF القياسية المختلفة في المدرج التكراري المتراكب لمجموعات MESF هنا. تمثل القيم مؤسسات التمويل الأصغر لكل مجموعة من مجموعات MESF الخمسة. يتم عرض الانحدار الخطي ل MESF على cMFI لسكان MESF هنا.يستخرج المنحدر MESF المرتبط بالخلايا من بيانات FCM الخاصة ب ICAM-1 على سطح الخلايا البائية اللوزتين في TFH. يتبع التحويل إلى الكثافات الجزيئية المطلقة هذه العمليات الرياضية البسيطة. تظهر الصور التمثيلية تحليل قياس التدفق الخلوي ل BSLBs المعاد تشكيلها مع زيادة كثافة الهيستيدات الأحادية المؤتلفة ICAM-1 12.تظهر هنا تحليلات الانحدار للتركيز المرجعي ICAM-1 على الكثافة المقاسة. يستخدم المنحدر لحساب التركيزات المستهدفة من البروتين لتحقيق كثافة الخلايا. توضح مخططات التدفق الخطوات الحاسمة للمشاركة في زراعة الخلايا التائية مع BSLBs ، وإعادة تشكيل أغشية النموذج في القياس اللاحق لنقل الجسيمات باستخدام قياس التدفق الخلوي.يتم عرض استراتيجية البوابة لتحديد BSLBs الفردية والخلايا داخل نافذة الاستحواذ المستمر هنا. أحد أهم جوانب هذا البروتوكول هو أنه للحفاظ على قابلية تكرار النتائج ، في كل مرة تقوم فيها بتغيير مخزون البروتين أو الدهون ، تحتاج إلى إجراء تحليل معايرة جديد. لاكتشاف جزيئات فعالة جديدة تفرزها مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا التائية ، يمكن عزل BSLBs بشكل أكبر عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلور كما تخضع للتحليل النسخي والبروتيني.استخدم زملاؤنا في جامعة أكسفورد هذه التكنولوجيا لدراسة وإظهار تفاعلات جديدة بين المستقبلات والروابط ، وكذلك لدراسة آثار الاجتثاث الجيني على مخرجات المشبك المناعي للخلايا التائية.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

الزاجل فحوصات تنافسية لدراسة غوت - مدار هجرة الخلايا التائية

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

مقدمة لالدبابير الطفيلية من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; والاستجابة المناعية Antiparasite

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

التصوير من HIV-1 مغلف من صنع المشبك الفيروسية، واشارة على طبقات ثنائية الدهون الاصطناعية

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

العزلة والتمايز TH17 من السذاجة CD4 T الخلايا اللمفاوية

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

جيل من العقدة الليمفاوية الدسم سادة الوهم لدراسة العقدة الليمفاوية اللحمية خلية المنشأ

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

زرع الجلد الذيل لدراسة خيفي CD4 T الردود الخليوي في الفئران

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

الماوس السذاجة CD4<sup&gt; +</sup&gt; عزل T خلية و<em&gt; في المختبر</em&gt; التمايز إلى T مجموعات فرعية خلية

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

طرق لدراسة الدهون التعديلات في العدلات وتشكيل لاحقة من الفخاخ خارج الخلية العدلات

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

فيروسات تنبيغ من الخلايا التائية المساعدة كنهج الوراثي لدراسة آليات السيطرة على التمايز وظيفة

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

بروتوكول نفطة شفط لدراسة الخلية تي البشرية استدعاء الاستجابات في فيفو

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...