Name: preparation of bead-supported lipid bilayers to study the particulate output of t cell immune synapses
Uploaded: 2022-04-01T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses at JoVE.com

Vi er taknemmelige for vores laboratoriemedlemmer og Kennedy Institute of Rheumatology-samfundet for konstruktive videnskabelige diskussioner, især vores flowcytometrifacilitetschef Jonathan Webber. Dette arbejde blev finansieret af Wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z / 12 / Z, ERC Advanced Grant (SYNECT AdG 670930) og Kennedy Trust for Rheumatology Research (KTRR) (alle tre til MLD). PFCD blev støttet af EMBO Long-Term Fellowship (ALTF 1420-2015 i samarbejde med Europa-Kommissionen (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) og Marie Sklodowska-Curie Actions) og et Oxford-Bristol Myers Squibb Fellowship.

1. Måling af celleoverfladeproteintætheder med kvantitativ flowcytometri
<ol><li>0,22 μm-filtreret human flowcytometribuffer (hFCB) forberedes ved at tilsætte EDTA (til en endelig koncentration på 2 mM) og humant AB-serum (til en endelig 10 %) til sterilt phosphatbufret saltvand (PBS), pH 7,4 (se tabel 1). Opløsningen filtreres ved hjælp af en porefilterenhed på 0,22 μm for at fjerne urenheder i serum og opbevares ved 4 °C.</li>
	<li>Genvind cellerne og sedimenter dem ved cen...

<ol>
	<li>Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+to+reconstitute+immune+cell+signaling.">Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling.</a> FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).</li><li>Choudhuri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+release+of+T-cell-receptor-enriched+microvesicles+at+the+immunological+synapse.">Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological synapse.</a> Nature. 507 (7490), 118-123 (2014).</li><li>Saliba, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+structure+of+synaptic+ectosomes+exporting+antigen+receptor+linked+to+functional+CD40+ligand+from+helper+T+cells.">Composition and structure of synaptic ectosomes exporting antigen receptor linked to functional CD40 ligand from helper T cells.</a> elife. 8, 47528 (2019).</li><li>Barcia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+polarization+of+IFN-gamma+at+Kupfer+and+non-Kupfer+immunological+synapses+during+the+clearance+of+virally+infected+brain+cells.">In vivo polarization of IFN-gamma at Kupfer and non-Kupfer immunological synapses during the clearance of virally infected brain cells.</a> Journal of Immunology. 180 (3), 1344-1352 (2008).</li><li>Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+use+two+directionally+distinct+pathways+for+cytokine+secretion.">T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion.</a> Nature Immunology. 7 (3), 247-255 (2006).</li><li>Kupfer, A., Mosmann, T. R., Kupfer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+expression+of+cytokines+in+cell+conjugates+of+helper+T+cells+and+splenic+B+cells.">Polarized expression of cytokines in cell conjugates of helper T cells and splenic B cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (3), 775-779 (1991).</li><li>Kupfer, H., Monks, C. R., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+splenic+B+cells+that+bind+to+antigen-specific+T+helper+(Th)+cells+and+face+the+site+of+cytokine+production+in+the+Th+cells+selectively+proliferate:+immunofluorescence+microscopic+studies+of+Th-B+antigen-presenting+cell+interactions.">Small splenic B cells that bind to antigen-specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate: immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen-presenting cell interactions.</a> Journal of Experimental Medicine. 179 (5), 1507-1515 (1994).</li><li>Reichert, P., Reinhardt, R. L., Ingulli, E., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+in+vivo+identification+of+TCR+redistribution+and+polarized+IL-2+production+by+naive+CD4+T+cells.">Cutting edge: in vivo identification of TCR redistribution and polarized IL-2 production by naive CD4 T cells.</a> Journal of Immunology. 166 (7), 4278-4281 (2001).</li><li>Gerard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+T+cell-T+cell+synaptic+interactions+drive+the+differentiation+of+protective+CD8++T+cells.">Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8+ T cells.</a> Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).</li><li>Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+planar+bilayers+for+study+of+the+immunological+synapse.">Supported planar bilayers for study of the immunological synapse.</a> Current Protocols in Immunology. , (2007).</li><li>Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2021)</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+compensation+for+flow+cytometry:+visualization+artifacts,+limitations,+and+caveats.">Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats.</a> Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).</li><li>Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+T+cells+is+induced+by+binding+to+nickel-chelating+lipids+in+supported+lipid+bilayers.">Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers.</a> Frontiers in Physiology. 11, 613367 (2020).</li><li>Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+spillover+spreading+for+comparing+instrument+performance+and+aiding+in+multicolor+panel+design.">Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design.</a> Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).</li><li>C&#233;spedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+antigen-presenting+cells+reveal+the+diversity+and+functional+specialisation+of+extracellular+vesicles+composing+the+fourth+signal+of+T+cell+immunological+synapses.">Synthetic antigen-presenting cells reveal the diversity and functional specialisation of extracellular vesicles composing the fourth signal of T cell immunological synapses.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Yoon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+non-activated+lymphocytes+using+three-dimensional+refractive+index+tomography+and+machine+learning.">Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distributions+of+autofluorescence+after+compensation:+Be+panglossian,+fret+not.">Distributions of autofluorescence after compensation: Be panglossian, fret not.</a> Cytometry A. 89 (4), 398-402 (2016).</li><li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+controls,+instrument+setup,+and+the+determination+of+positivity.">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li><li>Balint, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+attack+particles+are+autonomous+killing+entities+released+from+cytotoxic+T+cells.">Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells.</a> Science. 368 (6493), 897-901 (2020).</li><li>Cespedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+expression+of+the+hRSV+nucleoprotein+impairs+immunological+synapse+formation+with+T+cells.">Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).</li></ol>

BSLB'er er alsidige værktøjer til at studere partikeludgangen fra T-celler stimuleret med model APC-membraner. Metodens fleksibilitet gør det muligt at rekonstituere komplekse og reduktionistiske membransammensætninger for at studere virkningerne af ligander og deres signaler på udskillelsen af TSV'er og supramolekylære angrebspartikler og deres komponenter. Vi har testet denne teknologi på forskellige T-celler, herunder foraktiveret TH, CTL, Tregs og CART15. Denne protokol fungerer også t...

Den immunologiske synapse (IS) er en afgørende molekylær struktur dannet ved grænsefladen mellem celler, der er involveret i fysisk kontakt, hvilket letter den regulerede udveksling af juxtrarininformation. Forskellige IS'er er blevet beskrevet i litteraturen, og en voksende mængde beviser tyder på, at disse molekylære hubs er et bevaret træk ved mobilnetværk. Forskellige immunceller, herunder B-celler, naturlige dræberceller, dendritiske celler, makrofager og T-celler, udveksler information via samling af kortvarige kontakter1. Multiomiske undersøgelser fremmer forståelsen af nye undergrupper af leukocytter og stromalceller, der driver patogene cellulære netværk og udtrykker overfladeproteiner med ukendte funktioner. Som syntetiske APC'er tillader BSLB'er direkte undersøgelse af individuelle proteiners funktionelle rolle i integrationen af aktiverende signaler, nemlig antigener og costimulation/corepression, af T-celler og den deraf følgende frigivelse af effektorpartikler kaldet signal fire.
Dette papir beskriver de protokoller og kritiske tekniske punkter, der skal overvejes, når du bruger BSLB'er til at efterligne overfladesammensætningen af model APC'er. Protokollerne til kvantitativ måling af immunreceptorer og andre overfladeproteiner på APC'er præsenteres sammen med protokollen for rekonstitution af syntetiske APC'er, der indeholder disse målte mængder. Derefter præsenteres de trin, der kræves til kogulturering af T-celler og BSLB, sammen med protokollen til kvantitativ måling af transsynaptisk partikeloverførsel ved anvendelse af flowcytometri. Mest bemærkelsesværdigt letter BSLB'er at studere en plasmamembranafledt population af TSV'er betegnet synaptiske ektosomer (SE'er). T-celleantigenreceptorberigede (TCR+) SE'er kastes som reaktion på TCR-udløsning2 og fanges effektivt af BSLB'er3, hvilket repræsenterer en fremragende aflæsning for at vurdere antigenernes agonistiske egenskaber og den modellerede membransammensætning. CD63+ exosomer og supramolekylære angrebspartikler (SMAP'er) frigives også af stimulerede T-celler og fanges af BSLB'er. De kan bruges som yderligere udlæsninger af aktivering og den resulterende eksocytiske og lytiske granulatsekretion af T-celler. Mobiliseringen af exocytiske vesikler til T-cellens interagerende pol letter også retningsfrigivelsen af cytokiner, såsom IL-2, IFN-γ og IL-10 som reaktion på aktivering4,5,6,7,8. Selvom T-cellefrigivne cytokiner også kan påvises på BSLB'er, er en mere dedikeret undersøgelse i øjeblikket under udvikling for at validere den kvantitative analyse af cytokinfrigivelse ved den immunologiske synaps.
At undersøge, hvordan specifikke membransammensætninger påvirker T-cellernes synaptiske output, kræver det, at man definerer den fysiologiske tæthed af målmembrankomponenten. Flowcytometribaserede kvantificeringer af celleoverfladeproteiner er et vigtigt skridt i denne protokol og kræver: 1) anvendelse af antistoffer med kendte antal fluorokromer pr. antistof (F/P) og 2) benchmarkperler, der giver en standardreference for interpolering af fluorokrommolekyler fra målte gennemsnitlige fluorescensintensiteter (MFI'er).
Disse benchmarkstandarder består af fem perlepopulationer, der hver indeholder et stigende antal ækvivalente opløselige fluorokromer (MESF'er), som spænder over det dynamiske område for vilkårlig fluorescensdetektion. Disse standardpopulationer giver diskrete fluorescenstoppe, hvilket letter omdannelsen af vilkårlige fluorescensenheder til MESF'er ved simpel lineær regression. De resulterende MESF'er anvendes derefter sammen med antistof F / P-værdier til at beregne det gennemsnitlige antal bundne molekyler pr. Celle (eller BSLB i senere trin). Anvendelsen af estimerede celleoverfladearealer på det gennemsnitlige antal detekterede molekyler muliggør derefter beregning af fysiologiske densiteter som molekyler /μm2. Denne kvantificeringsprotokol kan også tilpasses måling af proteintætheder på T-celler og biokemisk rekonstitution af membransammensætninger, der formidler dannelsen af homotypiske T-cellesynapser (dvs. T-T-synapser9). Om nødvendigt kan valensen af antistofbinding estimeres yderligere ved anvendelse af rekombinante mål mærket med kendte antal fluorokromer pr. Molekyle. Derefter kan den antistofbindende valens beregnes for den samme BSLB-population ved samtidig at sammenligne antallet af bundne fluorescerende proteiner og kvantificeringsantistoffer (ved hjælp af to forskellige kvantificeringsfluorokromer og MESF-standarder).
Rekonstitutionen af APC-membraner kræver samling af understøttede lipiddobbeltlag (SLP'er) på silicaperler1. Liposombestande, der indeholder forskellige fosfolipidarter, kan udnyttes til at danne en alsidig lipid-dobbeltlagsmatrix, der muliggør forankring af rekombinante proteiner med forskellig bindende kemi (fremstillingen af liposomer er beskrevet i 10). Når den fysiologiske tæthed (eller densiteter) af den relevante ligand "på celler" er defineret, tilpasses den samme flowcytometriprotokol til at estimere koncentrationen af rekombinant protein, der er nødvendigt for at belægge BSLB'er med den målfysiologiske densitet. To forskellige forankringssystemer kan bruges enten i kombination eller separat.
For det første er SLB, der indeholder en endelig 12,5 mol% af Ni2+-holdige phospholipider, tilstrækkelig til at tilvejebringe ca. 10.000 His-tag-bindingssteder pr. Kvadratmikron10 og fungerer godt til at dekorere BSLB'er med de fleste kommercielt tilgængelige proteiner, hvis fysiologiske tætheder ikke overstiger denne maksimale belastningskapacitet. Det andet belastningssystem udnytter biotinholdige phospholipider (som mol%) til at indlæse biotinylerede anti-CD3e Fab (eller HLA / MHC monomerer) via streptavidinbroer. Kombinationen af disse to BSLB-dekorationsmetoder muliggør derefter fleksibel skræddersyning af BSLB'er som syntetiske APC'er. For meget komplekse APC-overfladesammensætninger kan mol% af phospholipider og proteiner øges for at indlæse så mange proteiner, som det aktuelle spørgsmål kræver. Når arbejdskoncentrationerne af proteiner og mol% af biotinylerede phospholipider er defineret, kan BSLB'er samles for at forhøre den synaptiske udgang af T-celler med multiparametrisk flowcytometri.

preparation of bead-supported lipid bilayers to study the particulate output of t cell immune synapses

Antigenpræsenterende celler (APC'er) præsenterer tre aktiverende signaler til T-celler, der er involveret i fysisk kontakt: 1) antigen, 2) costimulation / corepression og 3) opløselige cytokiner. T-celler frigiver to slags effektorpartikler som reaktion på aktivering: transsynaptiske vesikler (TSV'er) og supramolekylære angrebspartikler, som henholdsvis overfører intercellulære budbringere og medierer cytotoksicitet. Disse enheder internaliseres hurtigt af APC'er, der er involveret i fysisk kontakt med T-celler, hvilket gør deres karakterisering skræmmende. Dette papir præsenterer protokollen til fremstilling og anvendelse af bead-understøttede lipiddobbeltlag (BSLB'er) som antigenpræsenterende celle (APC) mimetika til at fange og analysere disse transsynaptiske partikler. Også beskrevet er protokollerne for de absolutte målinger af proteintætheder på celleoverflader, rekonstitutionen af BSLB'er med sådanne fysiologiske niveauer og flowcytometriproceduren til sporing af synaptisk partikelfrigivelse af T-celler. Denne protokol kan tilpasses til at studere virkningerne af individuelle proteiner, komplekse ligandblandinger, patogenvirulensdeterminanter og lægemidler på effektorproduktionen af T-celler, herunder hjælper-T-celler, cytotoksiske T-lymfocytter, regulatoriske T-celler og kimære antigenreceptor-ekspressionerende T-celler (CART).

FCM til absolut proteinkvantificering på celleoverfladen Rekonstitutionen af BSLB'er, der præsenterer fysiologiske tætheder af ligander, kræver estimering af samlede proteintætheder på den modellerede celledelmængde. For at rekonstituere BSLB'er skal du inkludere enhver relevant ligand, der forventes at spille en rolle i signalaksen af interesse sammen med proteiner, der understøtter vedhæftningen og den funktionelle interaktion mellem BSLB og celler, såsom ICAM-1 og costimulatoriske molekyl...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses at JoVE.com

Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses

Her præsenterer vi protokollen for trinvis rekonstitution af syntetiske antigenpræsenterende celler ved hjælp af perleunderstøttede lipiddobbeltlag og deres anvendelse til at forhøre det synaptiske output fra aktiverede T-celler.

Fremstilling af perleunderstøttede lipiddobbeltlag til undersøgelse af partikelproduktionen af T-celleimmunsynapser

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) ...

Undersøgelsen af output af immunsynapsen har for det meste været begrænset til mikroskopiske metoder. BSLB'er har udvidet vores repertoire af værktøjer, der kan bruges til at studere output af T-celleimmunsynapser, herunder flowcytometri, mikroskopi, proteomik og RNA-sekventeringsteknologier. Som sådan kan BSLB'er anvendes i en lang række immunologiske spørgsmål og til at identificere sammensætningen og den biokemiske regulering af T-celleudgangen.Dette omfatter for eksempel undersøgelse af kimære antigenreceptorer, lægemidler, der hæmmer specifikke signalveje, eller den genetiske ablation af gener af interesse. Et af de mest kritiske aspekter af denne protokol er at optimere proteinkalibreringerne og det flerfarvede flowcytometripanel, der kræves til sporing af den transsynaptiske partikel af interesse. Dette kræver systematisk iteration af proteinkoncentrationer, antistofkoncentrationer og instrumentindstillinger.Begynd med at fortynde en mikroliter perleopløsning med 1.000 mikroliter PBS. Tæl perlerne ved hjælp af et hæmocytometerkammer og beregn deres koncentration pr. Milliliter. Beregn derefter mængden af silicaperler, der er nødvendige for 500.000 endelige BSLB'er pr. Titreringspunkt.Overfør det krævede volumen silicaperler til et sterilt 1,5 ml mikrocentrifugerør. Vask silicaperlerne tre gange med en milliliter steril PBS og centrifuger perlerne. Forbered tre volumener liposom master mix indeholdende en endelig 12,5-mol procent af nikkelholdige phospholipider.Brug liposommesterblandingen til at suspendere de vaskede silicaperler igen. Bland det derefter forsigtigt ved at pipettere op og ned halvdelen af det samlede volumen. Ved hjælp af en steril teknik tilsættes argon eller nitrogengas til røret for at fortrænge luft og beskytte lipiderne mod oxidation under blanding.Tilsæt argon til de 0,4 millimolære lipidbestande. Opbevar bestanden og manipuler ved hjælp af en steril teknik. Flyt BSLB'erne til den lodrette mixer og bland i 30 minutter ved stuetemperatur ved hjælp af orbitalblanding ved 10 o / min.Derefter drejes perlerne ned ved centrifugering i 15 sekunder ved stuetemperatur på en minicentrifuge på bænken. Bloker de dannede BSLB'er ved at tilsætte en milliliter 5% BSA indeholdende 100 mikromolær nikkelsulfat for at mætte NTA-steder på BSLB'erne. Vask tre gange ved hjælp af HBS-HSA-buffer for at fjerne den overskydende blokeringsopløsning.Tag en ny U-bund eller V-bund 96-brønd plade og forbered to gange serielle fortyndinger af proteinerne. Resuspend de forberedte BSLB'er i et volumen, således at 100 mikroliter HBS-HSA-buffer indeholder 500.000 BSLB'er. Tag derefter en anden U-bund eller V-bund 96-brøndplade og overfør 100 mikroliter BSLB-suspensionen til brøndene på en sådan måde, at hver brønd modtager 500.000 BSPL'er.Spin ned den anden plade ved stuetemperatur i to minutter ved 300x G.Kassér supernatanten og overfør 100 mikroliter volumener fra proteintitreringspladen til pladen, der indeholder de sedimenterede BSLB'er. Bland forsigtigt, undgå overskydende boblegenerering under pipettering. Brug aluminiumsfolie til at beskytte den mod lys og inkubere ved stuetemperatur i 30 minutter ved 1.000 o / min.Vask derefter pladen tre gange ved at tilsætte HBS-HSA-buffer til pladen og drej den ned ved stuetemperatur i to minutter ved 300x G.Tæl cellerne efter vask. Fortynd dem derefter til en endelig koncentration på 2,5 millioner pr. Milliliter ved hjælp af synaptisk overførselsassaymedium. Når BSLB'erne er fyldt med proteinblandingen, vaskes BSLB'erne to gange med HBS-HSA-buffer for at fjerne de overskydende ubundne proteiner.Resuspend 500.000 BSLB'er pr. Brønd i 200 mikroliter HBS-HSA-buffer. Overfør 100 mikroliter BSLB'er pr. Brønd til en ny U-bund 96-brøndplade for at lave en duplikat, således at den endelige mængde BSLB pr. Brønd er 250.000. Drej BSLB'erne ned ved 300x G i to minutter ved stuetemperatur.Kassér supernatanten, og suspender derefter BSLB'erne igen ved hjælp af 100 mikroliter T-cellesuspension. Bland forsigtigt for at forhindre dannelse af bobler. Inkuber co-kulturerne i 90 minutter ved 37 grader Celsius.Beskyt cellerne mod lys og nedkøl co-kulturerne ved først at inkubere dem ved stuetemperatur i mindst 15 minutter. Centrifugering af co-kulturer ved stuetemperatur i fem minutter ved 500x G.Kassér supernatanten og resuspend co-kulturerne i calcium- og magnesiumionfri 2% BSA PBS ved stuetemperatur til blokering. Placer cellerne på is i 45 minutter og beskyt dem mod lys.Forbered antistofmasterblandingen ved hjælp af iskold 0,22 mikrometerfiltreret 2% BSA og PBS som en farvningsbuffer. Denne masterblanding giver ekstra blokering. Spin ned co-kulturer ved 500x G i fem minutter og fire grader Celsius.Kassér supernatanterne, og brug derefter en flerkanalspipette til at suspendere cellerne i farvningsmasterblandingen, der indeholder optimerede antistofkoncentrationer. Inkluder isotypemærkede celler og BSLB'er, fluorescerende og ikke-fluorescerende BSLB'er og celler og BSLB'er farvet alene. Bland forsigtigt ved at pipettere op og ned halvdelen af volumenet.Inkuber i 30 minutter på is og beskyt dem mod lys. Vask cellerne og BSLB'erne to gange ved hjælp af iskold 2% BSA PBS. Spin dem ned ved 500x G i fem minutter ved fire grader Celsius.Efter centrifugering skal du kontrollere samkulturen sedimenteret på bunden af brøndene. Derefter suspenderes de vaskede co-kulturer igen i 100 mikroliter PBS og erhverves straks. Aktivér logskalaen for side-spredt lys og time-of-flight-parameteren for side- og fremadspredt lys.Erhverv MESF-standarder, der sikrer, at både de svageste og lyseste populationer falder i instrumentets lineære rækkevidde. Hent derefter kompensationsprøver, beregn kompensation, og anvend kompensationsmatrixen på eksperimentet. Anskaf og spar mindst 20.000 samlede MESF-standarder for hver kvantificeringskanal.Undgå at bruge FACS-kappevæske eller lignende til at resuspend MESF-perler, da disse indeholder salte og alkoholer, der vil ødelægge fluorokromerne, hvilket fører til bredere fluorescenstoppe og høj fejl. Til erhvervelse ved hjælp af samplere med høj kapacitet skal du indstille instrumentanskaffelse til Standard, indstille prøveanskaffelse til 80 mikroliter. Prøvestrømningshastighed mellem to og tre mikroliter i sekundet, prøveblandingsvolumen ved 50 mikroliter, prøveblanding på 150 mikroliter pr. sekund og blanding pr. brønd mellem tre og fem.Erhverv mindst 10.000 enkelte BSLB'er pr. Prøve. Til sidst skal du eksportere FCS-filerne. Et eksempel på kvantitative flowcytometrimålinger af ICAM-1 på overfladen af tonsillar B-celler og hjælper-T-celler er vist her.De repræsentative billeder beskriver gating-strategien til analyse af enkelte CXCR5 B-celler og follikulære hjælper-T-celler isoleret fra humane palatinmandler. Denne sekventielle gating-strategi identificerer enkelte livebegivenheder inden for det kontinuerlige anskaffelsesvindue. Doublets, celleoverfladeekspressionen af ICAM-1 sammenlignet med FMO-kontroller og FMO-kontroller mærket med relevante isotyper af populationerne, er vist her.Gating og måling af MFI'er fra forskellige standard MESF-populationer i de overlejrede histogrammer for MESF-populationerne er vist her. Værdierne repræsenterer MFI'erne for hver af de fem MESF-populationer. Lineær regression af MESF over cMFI for MESF-populationerne præsenteres her.Hældningen ekstraherer MESF bundet til celler fra FCM-dataene fra ICAM-1 på overfladen af tonsillar B-celler i TFH. Omdannelsen til absolutte molekylære tætheder følger disse enkle matematiske operationer. De repræsentative billeder viser flowcytometrianalysen af BSLB'er rekonstitueret med øgede tætheder af rekombinante monomere ICAM-1 12 histidiner.Regressionsanalyser af ICAM-1-referencekoncentration over målt densitet er vist her. Hældningen bruges til at beregne målkoncentrationer af protein for at opnå tætheden af celler. Flowdiagrammerne viser de kritiske trin for samdyrkning af T-celler med BSLB'er, rekonstituering af modelmembraner i den efterfølgende måling af partikeloverførsel med flowcytometri.Gating-strategien til at identificere enkelte BSLB'er og celler inden for det kontinuerlige anskaffelsesvindue er vist her. Et af de vigtigste aspekter af denne protokol er, at for at opretholde reproducerbarheden af resultaterne, hver gang du skifter protein eller lipidbestande, skal du udføre ny kalibreringsanalyse. For at opdage nye effektive molekyler udskilt af forskellige T-celleundergrupper kan BSLB'er isoleres yderligere ved fluorescensaktiveret cellesortering som underkastet transkriptomisk og proteomisk analyse.Vores kolleger inden for University of Oxford har brugt denne teknologi til at studere og demonstrere nye receptor-ligand-interaktioner og også til at studere virkningerne af genetiske ablationer på output fra T-celleimmunsynapsen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Scanning af HIV-1 Envelope-induceret Virologisk Synapse og signaler på syntetiske lipiddobbeltlagenes

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

Isolering og Th17 Differentiering af Naïve CD4 T-lymfocytter

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

Generering af lymfeknuder-fedt Pad kimærer for Studiet af lymfeknuder stromacelle Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Transplantation af Tail Hud til Study Allogen CD4 T-celle respons i mus

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mus Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolation og<em&gt; In vitro</em&gt; Differentiering til T-celledelmængder

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Metoder til at studere Lipidforandringer i neutrofiler og den efterfølgende dannelse af neutrofile ekstracellulær fælder

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Retroviral transduktion af Helper T-celler som en genetisk tilgang til at studere Mekanismer Controlling deres Differentiering og funktion

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

En suge Blister protokol at studere Human T-celle hjemkalde svar In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...