Name: preparation of bead-supported lipid bilayers to study the particulate output of t cell immune synapses
Uploaded: 2022-04-01T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses at JoVE.com

We zijn onze laboratoriumleden en de Kennedy Institute of Rheumatology-gemeenschap dankbaar voor constructieve wetenschappelijke discussies, met name onze flowcytometrie facility manager Jonathan Webber. Dit werk werd gefinancierd door Wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z, de ERC Advanced Grant (SYNECT AdG 670930) en de Kennedy Trust for Rheumatology Research (KTRR) (alle drie tot MLD). PFCD werd ondersteund door EMBO Long-Term Fellowship (ALTF 1420-2015, in samenwerking met de Europese Commissie (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) en Marie Sklodowska-Curie Actions) en een Oxford-Bristol Myers Squibb Fellowship.

1. Meting van de eiwitdichtheden van het celoppervlak met kwantitatieve flowcytometrie
<ol><li>Bereid 0,22 μm-gefilterde humane flowcytometriebuffer (hFCB) door EDTA (tot een uiteindelijke 2 mM-concentratie) en humaan AB-serum (tot een laatste 10%) toe te voegen aan steriele fosfaatbuffered saline (PBS), pH 7,4 (zie tabel 1). Filtreer de oplossing met behulp van een poriënfiltereenheid van 0,22 μm om serumverontreinigingen te verwijderen en bewaar bij 4 °C.</li>
	<li>Herstel de cel...

<ol>
	<li>Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+to+reconstitute+immune+cell+signaling.">Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling.</a> FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).</li><li>Choudhuri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+release+of+T-cell-receptor-enriched+microvesicles+at+the+immunological+synapse.">Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological synapse.</a> Nature. 507 (7490), 118-123 (2014).</li><li>Saliba, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+structure+of+synaptic+ectosomes+exporting+antigen+receptor+linked+to+functional+CD40+ligand+from+helper+T+cells.">Composition and structure of synaptic ectosomes exporting antigen receptor linked to functional CD40 ligand from helper T cells.</a> elife. 8, 47528 (2019).</li><li>Barcia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+polarization+of+IFN-gamma+at+Kupfer+and+non-Kupfer+immunological+synapses+during+the+clearance+of+virally+infected+brain+cells.">In vivo polarization of IFN-gamma at Kupfer and non-Kupfer immunological synapses during the clearance of virally infected brain cells.</a> Journal of Immunology. 180 (3), 1344-1352 (2008).</li><li>Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+use+two+directionally+distinct+pathways+for+cytokine+secretion.">T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion.</a> Nature Immunology. 7 (3), 247-255 (2006).</li><li>Kupfer, A., Mosmann, T. R., Kupfer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+expression+of+cytokines+in+cell+conjugates+of+helper+T+cells+and+splenic+B+cells.">Polarized expression of cytokines in cell conjugates of helper T cells and splenic B cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (3), 775-779 (1991).</li><li>Kupfer, H., Monks, C. R., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+splenic+B+cells+that+bind+to+antigen-specific+T+helper+(Th)+cells+and+face+the+site+of+cytokine+production+in+the+Th+cells+selectively+proliferate:+immunofluorescence+microscopic+studies+of+Th-B+antigen-presenting+cell+interactions.">Small splenic B cells that bind to antigen-specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate: immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen-presenting cell interactions.</a> Journal of Experimental Medicine. 179 (5), 1507-1515 (1994).</li><li>Reichert, P., Reinhardt, R. L., Ingulli, E., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+in+vivo+identification+of+TCR+redistribution+and+polarized+IL-2+production+by+naive+CD4+T+cells.">Cutting edge: in vivo identification of TCR redistribution and polarized IL-2 production by naive CD4 T cells.</a> Journal of Immunology. 166 (7), 4278-4281 (2001).</li><li>Gerard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+T+cell-T+cell+synaptic+interactions+drive+the+differentiation+of+protective+CD8++T+cells.">Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8+ T cells.</a> Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).</li><li>Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+planar+bilayers+for+study+of+the+immunological+synapse.">Supported planar bilayers for study of the immunological synapse.</a> Current Protocols in Immunology. , (2007).</li><li>Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2021)</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+compensation+for+flow+cytometry:+visualization+artifacts,+limitations,+and+caveats.">Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats.</a> Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).</li><li>Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+T+cells+is+induced+by+binding+to+nickel-chelating+lipids+in+supported+lipid+bilayers.">Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers.</a> Frontiers in Physiology. 11, 613367 (2020).</li><li>Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+spillover+spreading+for+comparing+instrument+performance+and+aiding+in+multicolor+panel+design.">Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design.</a> Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).</li><li>C&#233;spedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+antigen-presenting+cells+reveal+the+diversity+and+functional+specialisation+of+extracellular+vesicles+composing+the+fourth+signal+of+T+cell+immunological+synapses.">Synthetic antigen-presenting cells reveal the diversity and functional specialisation of extracellular vesicles composing the fourth signal of T cell immunological synapses.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Yoon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+non-activated+lymphocytes+using+three-dimensional+refractive+index+tomography+and+machine+learning.">Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distributions+of+autofluorescence+after+compensation:+Be+panglossian,+fret+not.">Distributions of autofluorescence after compensation: Be panglossian, fret not.</a> Cytometry A. 89 (4), 398-402 (2016).</li><li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+controls,+instrument+setup,+and+the+determination+of+positivity.">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li><li>Balint, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+attack+particles+are+autonomous+killing+entities+released+from+cytotoxic+T+cells.">Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells.</a> Science. 368 (6493), 897-901 (2020).</li><li>Cespedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+expression+of+the+hRSV+nucleoprotein+impairs+immunological+synapse+formation+with+T+cells.">Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).</li></ol>

BSLBs zijn veelzijdige hulpmiddelen voor het bestuderen van de deeltjesoutput van T-cellen gestimuleerd met model APC-membranen. De flexibiliteit van de methode maakt de reconstitutie van complexe en reductionistische membraansamenstellingen mogelijk om de effecten van liganden en hun signalen op de secretie van tSV's en supramoleculaire aanvalsdeeltjes en hun componenten te bestuderen. We hebben deze technologie getest op verschillende T-cellen, waaronder gepreactiveerde TH, CTL, Tregs en CART15....

De immunologische synaps (IS) is een cruciale moleculaire structuur gevormd op het grensvlak van cellen die betrokken zijn bij fysiek contact dat de gereguleerde uitwisseling van juxtracrine-informatie vergemakkelijkt. Verschillende ES'en zijn beschreven in de literatuur, en een groeiend aantal bewijzen suggereert dat deze moleculaire hubs een geconserveerd kenmerk zijn van cellulaire netwerken. Verschillende immuuncellen, waaronder B-cellen, natural killer-cellen, dendritische cellen, macrofagen en T-cellen, wisselen informatie uit via de assemblage van kortstondige contacten1. Multiomische studies bevorderen het begrip van nieuwe subsets van leukocyten en stromale cellen die pathogene cellulaire netwerken aandrijven en oppervlakte-eiwitten met onbekende functies tot expressie brengen. Als synthetische APC's maken BSLBs het mogelijk om direct onderzoek te doen naar de functionele rol van individuele eiwitten bij de integratie van activerende signalen, namelijk antigenen en costimulatie/corepressie, door T-cellen en de resulterende afgifte van effectordeeltjes die signaal vier worden genoemd.
Dit artikel beschrijft de protocollen en kritieke technische punten waarmee rekening moet worden gehouden bij het gebruik van BSLBs om de oppervlaktesamenstelling van model-APC's na te bootsen. De protocollen voor de kwantitatieve meting van immuunreceptoren en andere oppervlakte-eiwitten op APC's worden gepresenteerd samen met het protocol voor de reconstitutie van synthetische APC's die deze gemeten hoeveelheden bevatten. Vervolgens worden de stappen die nodig zijn voor het cocultureren van T-cellen en BSLB gepresenteerd, samen met het protocol voor de kwantitatieve meting van trans-synaptische deeltjesoverdracht met behulp van flowcytometrie. Het meest opmerkelijke is dat BSLBs het bestuderen van een plasmamembraan-afgeleide populatie van tSV's genaamd synaptische ectosomen (SE's) vergemakkelijken. T-cel antigeenreceptorverrijkte (TCR+) SE's worden afgestoten als reactie op TCR-triggering2 en efficiënt opgevangen door BSLBs3, wat een uitstekende uitlezing vertegenwoordigt om de agonistische eigenschappen van antigenen en de gemodelleerde membraansamenstelling te beoordelen. CD63+ exosomen en supramoleculaire aanvalsdeeltjes (SMAPs) worden ook vrijgegeven door gestimuleerde T-cellen en opgevangen door BSLBs. Ze kunnen worden gebruikt als extra uitlezingen van activering en de resulterende exocytische en lytische korrelsecretie door T-cellen. De mobilisatie van exocytische blaasjes naar de interagerende pool van de T-cel vergemakkelijkt ook de directionele afgifte van cytokines, zoals IL-2, IFN-γ en IL-10 als reactie op activering4,5,6,7,8. Hoewel T-cel vrijgegeven cytokines ook kunnen worden gedetecteerd op BSLBs, is er momenteel een meer toegewijde studie in ontwikkeling om de kwantitatieve analyse van cytokine-afgifte bij de immunologische synaps te valideren.
Om te onderzoeken hoe specifieke membraansamenstellingen de synaptische output van T-cellen beïnvloeden, moet de fysiologische dichtheid van de doelmembraancomponent worden gedefinieerd. Op flowcytometrie gebaseerde kwantificeringen van celoppervlakeiwitten zijn een essentiële stap in dit protocol en vereisen: 1) het gebruik van antilichamen met bekende aantallen fluorochchromen per antilichaam (F / P), en 2) benchmarkparels die een standaardreferentie bieden voor het interpoleren van fluorochroommoleculen uit gemeten gemiddelde fluorescentie-intensiteiten (MFI's).
Deze benchmarkstandaarden bestaan uit vijf kralenpopulaties, die elk een toenemend aantal equivalent oplosbare fluorochchromen (MESF's) bevatten, die het dynamische bereik van willekeurige fluorescentiedetectie overspannen. Deze standaardpopulaties leveren discrete fluorescentiepieken op, waardoor de omzetting van willekeurige fluorescentie-eenheden in MESF's door eenvoudige lineaire regressie wordt vergemakkelijkt. De resulterende MESF's worden vervolgens gebruikt naast antilichaam F / P-waarden om het gemiddelde aantal gebonden moleculen per cel (of BSLB in latere stappen) te berekenen. De toepassing van geschatte celoppervlakken op het gemiddelde aantal gedetecteerde moleculen maakt vervolgens de berekening van fysiologische dichtheden als moleculen/μm2 mogelijk. Dit kwantificeringsprotocol kan ook worden aangepast aan de meting van eiwitdichtheden op T-cellen en de biochemische reconstitutie van membraansamenstellingen die de vorming van homotypische T-cel synapsen (d.w.z. T-T-synapsen9) bemiddelen. Indien nodig kan de valentie van antilichaambinding verder worden geschat door recombinante doelen te gebruiken die zijn gelabeld met bekende aantallen fluorochromen per molecuul. Vervolgens kan de antilichaambindende valentie voor dezelfde BSLB-populatie worden berekend door tegelijkertijd het aantal gebonden fluorescerende eiwitten en kwantificeringsantistoffen te vergelijken (met behulp van twee verschillende kwantificeringsfluorocchromen en MESF-normen).
De reconstitutie van APC-membranen vereist de assemblage van ondersteunde lipide bilayers (SLBs) op silicakorrels1. Liposoomvoorraden die verschillende fosfolipidesoorten bevatten, kunnen worden gebruikt om een veelzijdige lipide-dubbellaagsmatrix te vormen, waardoor recombinante eiwitten met verschillende bindingschemie kunnen worden verankerd (de bereiding van liposomen wordt beschreven in 10). Zodra de fysiologische dichtheid (of dichtheden) van het relevante ligand "op cellen" is gedefinieerd, wordt hetzelfde flowcytometrieprotocol aangepast om de concentratie van recombinant eiwit te schatten die nodig is om BSLBs te coaten met de beoogde fysiologische dichtheid. Twee verschillende verankeringssystemen kunnen in combinatie of afzonderlijk worden gebruikt.
Ten eerste is SLB met een laatste 12,5 mol% Ni2+-bevattende fosfolipiden voldoende om ongeveer 10.000 His-tag bindingsplaatsen per vierkante micron10 te leveren en werkt het goed om BSLBs te versieren met de meeste in de handel verkrijgbare eiwitten waarvan de fysiologische dichtheden deze maximale laadcapaciteit niet overschrijden. Het tweede laadsysteem maakt gebruik van biotinebevattende fosfolipiden (als mol%) om gebiotinyleerde anti-CD3e Fab (of HLA/MHC-monomeren) te laden via streptavidinbruggen. De combinatie van deze twee BSLB-decoratiemethoden maakt vervolgens de flexibele afstemming van BSLBs als synthetische APC's mogelijk. Voor zeer complexe APC-oppervlaktesamenstellingen kan de mol% van fosfolipiden en eiwitten worden verhoogd om zoveel eiwitten te laden als de vraag vereist. Zodra de werkconcentraties van eiwitten en mol% van gebiotinyleerde fosfolipiden zijn gedefinieerd, kunnen BSLBs worden geassembleerd om de synaptische output van T-cellen te ondervragen met multiparametrische flowcytometrie.

preparation of bead-supported lipid bilayers to study the particulate output of t cell immune synapses

Antigeen-presenterende cellen (APC's) presenteren drie activerende signalen aan T-cellen die betrokken zijn bij fysiek contact: 1) antigeen, 2) costimulatie / corepressie en 3) oplosbare cytokines. T-cellen geven twee soorten effectordeeltjes af als reactie op activering: trans-synaptische blaasjes (tSV's) en supramoleculaire aanvalsdeeltjes, die respectievelijk intercellulaire boodschappers overbrengen en cytotoxiciteit bemiddelen. Deze entiteiten worden snel geïnternaliseerd door APC's die fysiek contact hebben met T-cellen, waardoor hun karakterisering ontmoedigend is. Dit artikel presenteert het protocol om Bead-Supported Lipid Bilayers (BSLBs) te fabriceren en te gebruiken als antigeen-presenterende cel (APC) mimetica om deze trans-synaptische deeltjes te vangen en te analyseren. Ook worden de protocollen beschreven voor de absolute metingen van eiwitdichtheden op celoppervlakken, de reconstitutie van BSLBs met dergelijke fysiologische niveaus en de flowcytometrieprocedure voor het volgen van de afgifte van synaptische deeltjes door T-cellen. Dit protocol kan worden aangepast om de effecten van individuele eiwitten, complexe ligandmengsels, pathogene virulentiedeterminanten en geneesmiddelen op de effectoroutput van T-cellen te bestuderen, waaronder helper T-cellen, cytotoxische T-lymfocyten, regulerende T-cellen en chimere antigeenreceptor-expresserende T-cellen (CART).

FCM voor absolute eiwitkwantificering op het celoppervlak De reconstitutie van BSLBs met fysiologische dichtheden van liganden vereist de schatting van de totale eiwitdichtheden op de gemodelleerde celsubset. Om BSLBs te reconstitueren, moet u alle relevante ligand opnemen die naar verwachting een rol zal spelen in de signaalas van belang naast eiwitten die de adhesie en functionele interactie tussen BSLB en cellen ondersteunen, zoals ICAM-1 en kostenimulatorische moleculen, bijvoorbeeld CD40-, CD58- ...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses at JoVE.com

Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses

Hier presenteren we het protocol voor de stapsgewijze reconstitutie van synthetische antigeen-presenterende cellen met behulp van Bead-Supported Lipid Bilayers en hun gebruik om de synaptische output van geactiveerde T-cellen te ondervragen.

Voorbereiding van door kralen ondersteunde lipide bilayers om de deeltjesoutput van T-cel immuunsynapsen te bestuderen

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) ...

De studie van de output van de immuunsynaps is meestal beperkt gebleven tot microscopische methoden. BSLBs hebben ons repertoire van hulpmiddelen uitgebreid die kunnen worden gebruikt om de output van T-cel immuun synapsen te bestuderen, waaronder flowcytometrie, microscopie, proteomics en RNA-sequencingtechnologieën. Als zodanig kunnen BSLBs worden gebruikt in een breed scala aan immunologische vragen en bij het identificeren van de samenstelling en biochemische regulatie van de T-celoutput.Dit omvat bijvoorbeeld de studie van chimere antigeenreceptoren, geneesmiddelen die specifieke signaalroutes remmen of de genetische ablatie van genen van belang. Een van de meest kritieke aspecten van dit protocol is het optimaliseren van de eiwitkalibraties en het meerkleurige flowcytometriepaneel dat nodig is voor het volgen van het transsyptische deeltje van belang. Dit vereist de systematische iteratie van eiwitconcentraties, antilichaamconcentraties en instrumentinstellingen.Begin met het verdunnen van één microliter kraaloplossing met 1.000 microliter PBS. Tel de kralen met behulp van een hemocytometerkamer en bereken hun concentratie per milliliter. Bereken vervolgens het volume silicaparels dat nodig is voor 500.000 uiteindelijke BSLBs per titratiepunt.Breng het vereiste volume silicaparels over in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Was de silicakorrels drie keer met één milliliter steriel PBS en centrifugeer de kralen. Bereid drie volumes liposoommastermix met een laatste 12,5 mol procent nikkelbevattende fosfolipiden.Gebruik de liposoommastermix om de gewassen silicaparels opnieuw te suspenderen. Meng het vervolgens voorzichtig door de helft van het totale volume op en neer te pipetteren. Voeg met behulp van een steriele techniek argon- of stikstofgas toe aan de buis om lucht te verplaatsen en de lipiden te beschermen tegen oxidatie tijdens het mengen.Voeg argon toe aan de 0,4-millimolaire lipidevoorraden. Bewaar de voorraad en manipuleer met behulp van een steriele techniek. Verplaats de BSLBs naar de verticale mixer en meng gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met behulp van orbitaal mengen bij 10 RPM.Draai vervolgens de kralen naar beneden door 15 seconden bij kamertemperatuur te centrifugeren op een minicentrifuge op de bank. Blokkeer de gevormde BSLBs door één milliliter 5% BSA met 100 micromolair nikkelsulfaat toe te voegen om NTA-locaties op de BSLBs te verzadigen. Was drie keer met HBS-HSA-buffer om de overtollige blokkerende oplossing te verwijderen.Neem een nieuwe U-bottom of V-bottom 96-well plaat en bereid tweevoudige seriële verdunningen van de eiwitten voor. Resuspend de bereide BSLBs in een zodanig volume dat 100 microliter HBS-HSA-buffer 500.000 BSLBs bevat. Neem vervolgens nog een U-bodem of V-bodem 96-putplaat en breng 100 microliter van de BSLB-suspensie over naar de putten op zo'n manier dat elke put 500.000 BSBL's ontvangt.Draai de tweede plaat bij kamertemperatuur gedurende twee minuten af op 300x G.Gooi het supernatant weg en breng 100 microliter volumes over van de eiwittitratieplaat naar de plaat met de gesedimenteerde BSLBs. Meng voorzichtig, vermijd overmatige bubbelgeneratie tijdens het pipetteren. Gebruik aluminiumfolie om het te beschermen tegen licht en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten bij 1.000 RPM.Was de plaat vervolgens drie keer door HBS-HSA-buffer aan de plaat toe te voegen en draai deze twee minuten op kamertemperatuur bij 300x G.Tel de cellen na het wassen. Verdun ze vervolgens tot een eindconcentratie van 2,5 miljoen per milliliter met behulp van synaptisch transfertestmedium. Zodra de BSLBs zijn geladen met het eiwitmengsel, wast u de BSLBs tweemaal met HBS-HSA-buffer om de overtollige ongebonden eiwitten te verwijderen.Resuspend 500, 000 BSLBs per put in 200 microliter HBS-HSA buffer. Breng 100 microliter BSLBs per put over naar een nieuwe U-bottom 96-well plaat om een duplicaat te maken, zodat de uiteindelijke hoeveelheid BSLB per put 250.000 is. Draai de BSLBs gedurende twee minuten bij kamertemperatuur op 300x G.Gooi het supernatant weg en resuspend de BSLBs met behulp van 100 microliter T-celsuspensie. Meng voorzichtig om de vorming van bubbels te voorkomen. Incubeer de co-culturen gedurende 90 minuten bij 37 graden Celsius.Bescherm de cellen tegen licht en koel de coculturen af door ze eerst minimaal 15 minuten bij kamertemperatuur te incuberen. Centrifugeer de coculturen bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten bij 500x G.Gooi het supernatant weg en resuspend de co-culturen in calcium- en magnesiumionenvrij 2% BSA PBS bij kamertemperatuur voor blokkering. Plaats de cellen gedurende 45 minuten op ijs en bescherm ze tegen licht.Bereid de antilichaammastermix met ijskoude 0,22-micrometer-gefilterde 2% BSA en PBS als kleurbuffer. Deze mastermix zorgt voor extra blokkering. Draai de co-culturen op 500x G gedurende vijf minuten en vier graden Celsius.Gooi de supernatanten weg en gebruik vervolgens een meerkanaalspion om de cellen in de kleuringsmastermix met geoptimaliseerde antilichaamconcentraties opnieuw op te suspenderen. Inclusief isotype-gelabelde cellen en BSLBs, fluorescerende en niet-fluorescerende BSLBs, en cellen en BSLBs alleen gekleurd. Meng zachtjes door de helft van het volume op en neer te pipetteren.Incubeer gedurende 30 minuten op ijs en bescherm ze tegen licht. Was de cellen en BSLBs tweemaal met ijskoude 2% BSA PBS. Draai ze vijf minuten op 500x G bij vier graden Celsius.Controleer na het centrifugeren de co-culture sedimented op de bodem van de putten. Resuspend de gewassen co-culturen vervolgens in 100 microliter PBS en verkrijg onmiddellijk. Activeer de logschaal voor zijwaarts verstrooid licht en de parameter time-of-flight voor zij- en voorwaarts verstrooide lichten.Verkrijg MESF-standaarden, zodat zowel de zwak ingestelde als de helderste populaties in het lineaire bereik van het instrument vallen. Verkrijg vervolgens compensatiemonsters, bereken compensatie en pas de compensatiematrix toe op het experiment. Verwerf en bewaar minimaal 20.000 totale MESF-standaarden voor elk kwantificeringskanaal.Vermijd het gebruik van FACS-schedevloeistof of vergelijkbaar met geresuspend MESF-kralen, omdat deze zouten en alcoholen bevatten die de fluorchromen vernietigen, wat leidt tot bredere fluorescentiepieken en hoge fouten. Voor acquisitie met behulp van high-throughput samplers stelt u de instrumentacquisitie in op Standard, stelt u de monsteracquisitie in op 80 microliter. Sample Flow Rate tussen twee en drie microliter per seconde, sample Mixing Volume bij 50 microliter, sample Mixing van 150 microliter per seconde, en mengen per put tussen drie en vijf.Verkrijg minimaal 10.000 afzonderlijke BSLBs per monster. Exporteer ten slotte de FCS-bestanden. Een voorbeeld van kwantitatieve flowcytometriemetingen van ICAM-1 op het oppervlak van tonsillaire B-cellen en helper-T-cellen wordt hier getoond.De representatieve afbeeldingen beschrijven de gating-strategie voor het analyseren van enkele CXCR5 B-cellen en folliculaire-helper T-cellen geïsoleerd uit menselijke palatinale amandelen. Deze sequentiële gating-strategie identificeert afzonderlijke live-gebeurtenissen binnen het continue acquisitievenster. De doubletten, de celoppervlakexpressie van ICAM-1 in vergelijking met FMO-controles en FMO-controles gelabeld met relevante isotypen van de populaties, worden hier weergegeven.Gating en meting van MFI's van verschillende standaard MESF-populaties in de overlayd histogrammen van de MESF-populaties worden hier getoond. De waarden vertegenwoordigen de MFI's voor elk van de vijf MESF-populaties. Lineaire regressie van MESF ten opzichte van cMFI voor de MESF-populaties worden hier gepresenteerd.De helling extraheert MESF gebonden aan cellen uit de FCM-gegevens van ICAM-1 op het oppervlak van tonsillaire B-cellen in TFH. De omzetting naar absolute moleculaire dichtheden volgt deze eenvoudige wiskundige bewerkingen. De representatieve beelden tonen de flowcytometrie-analyse van BSLBs gereconstitueerd met verhoogde dichtheden van recombinant monomere ICAM-1 12 histidines.Regressieanalyses van ICAM-1 referentieconcentratie over gemeten dichtheid worden hier getoond. De helling wordt gebruikt om doelconcentraties van eiwitten te berekenen om de dichtheid van cellen te bereiken. De stroomdiagrammen tonen de kritieke stappen voor het co-kweken van T-cellen met BSLBs, het reconstitueren van modelmembranen in de daaropvolgende meting van deeltjesoverdracht met flowcytometrie.De gating-strategie om afzonderlijke BSLBs en cellen binnen het continue acquisitievenster te identificeren, wordt hier weergegeven. Een van de belangrijkste aspecten van dit protocol is dat, om de reproduceerbaarheid van de resultaten te behouden, elke keer dat u eiwit- of lipidenvoorraden verandert, u een nieuwe kalibratieanalyse moet uitvoeren. Om nieuwe effectieve moleculen te ontdekken die door verschillende T-celsubsets worden uitgescheiden, kunnen BSLBs verder worden geïsoleerd door fluorescentie-geactiveerde celsortering als onderworpen aan transcriptomische en proteomische analyse.Onze collega's binnen de Universiteit van Oxford hebben deze technologie gebruikt om nieuwe receptor-ligandinteracties te bestuderen en te demonstreren, en ook om de effecten van genetische ablaties op de output van de T-cel immuun synaps te bestuderen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Concurrerende Homing Testen om de Gut-tropische T-cel-migratie Study

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Een inleiding tot sluipwespen van<em&gt; Drosophila</em&gt; En de Antiparasite immuunrespons

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Imaging van HIV-1 Envelope-geïnduceerde Virologische Synapse en signalering op synthetische lipidendubbellagen

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

Isolatie en Th17 Differentiatie van naïeve CD4 T-lymfocyten

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Transplantatie van Tail Skin aan allogene CD4 T-cel responsen bij muizen

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Muis Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolatie en<em&gt; In vitro</em&gt; Differentiatie in T cel subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Methoden om te studeren Lipidenveranderingen in neutrofielen en de daaropvolgende vorming van neutrofielen Extracellulaire Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Retrovirale Transductie van helper T-cellen als een genetische benadering om te studeren mechanismen die hun differentiatie en functie

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Een zuig Blister-Protocol om menselijke T-cel Recall reacties In Vivo te studeren

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...