Name: preparation of bead-supported lipid bilayers to study the particulate output of t cell immune synapses
Uploaded: 2022-04-01T13:30:00
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Nous sommes reconnaissants aux membres de notre laboratoire et à la communauté du Kennedy Institute of Rheumatology pour leurs discussions scientifiques constructives, en particulier notre gestionnaire d’installations de cytométrie en flux, Jonathan Webber. Ce travail a été financé par wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z, l’ERC Advanced Grant (SYNECT AdG 670930) et le Kennedy Trust for Rheumatology Research (KTRR) (tous trois à MLD). Le PFCD a été soutenu par embooca Long-Term Fellowship (ALTF 1420-2015, en collaboration avec la Commission européenne (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) et Marie Sklodowska-Curie Actions) et une bourse Oxford-Bristol Myers Squibb.

1. Mesure des densités de protéines de surface cellulaire par cytométrie quantitative en flux
<ol><li>Préparer un tampon de cytométrie en flux humain (hFCB) filtré à 0,22 μm en ajoutant de l’EDTA (à une concentration finale de 2 mM) et du sérum AB humain (jusqu’à un final de 10 %) à une solution saline tamponnée stérile au phosphate (PBS), pH 7,4 (voir le tableau 1). Filtrer la solution à l’aide d’un filtre à pores de 0,22 μm pour éliminer les impuretés séri...

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	<li>Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+to+reconstitute+immune+cell+signaling.">Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling.</a> FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).</li><li>Choudhuri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+release+of+T-cell-receptor-enriched+microvesicles+at+the+immunological+synapse.">Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological synapse.</a> Nature. 507 (7490), 118-123 (2014).</li><li>Saliba, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+structure+of+synaptic+ectosomes+exporting+antigen+receptor+linked+to+functional+CD40+ligand+from+helper+T+cells.">Composition and structure of synaptic ectosomes exporting antigen receptor linked to functional CD40 ligand from helper T cells.</a> elife. 8, 47528 (2019).</li><li>Barcia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+polarization+of+IFN-gamma+at+Kupfer+and+non-Kupfer+immunological+synapses+during+the+clearance+of+virally+infected+brain+cells.">In vivo polarization of IFN-gamma at Kupfer and non-Kupfer immunological synapses during the clearance of virally infected brain cells.</a> Journal of Immunology. 180 (3), 1344-1352 (2008).</li><li>Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+use+two+directionally+distinct+pathways+for+cytokine+secretion.">T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion.</a> Nature Immunology. 7 (3), 247-255 (2006).</li><li>Kupfer, A., Mosmann, T. R., Kupfer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+expression+of+cytokines+in+cell+conjugates+of+helper+T+cells+and+splenic+B+cells.">Polarized expression of cytokines in cell conjugates of helper T cells and splenic B cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (3), 775-779 (1991).</li><li>Kupfer, H., Monks, C. R., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+splenic+B+cells+that+bind+to+antigen-specific+T+helper+(Th)+cells+and+face+the+site+of+cytokine+production+in+the+Th+cells+selectively+proliferate:+immunofluorescence+microscopic+studies+of+Th-B+antigen-presenting+cell+interactions.">Small splenic B cells that bind to antigen-specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate: immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen-presenting cell interactions.</a> Journal of Experimental Medicine. 179 (5), 1507-1515 (1994).</li><li>Reichert, P., Reinhardt, R. L., Ingulli, E., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+in+vivo+identification+of+TCR+redistribution+and+polarized+IL-2+production+by+naive+CD4+T+cells.">Cutting edge: in vivo identification of TCR redistribution and polarized IL-2 production by naive CD4 T cells.</a> Journal of Immunology. 166 (7), 4278-4281 (2001).</li><li>Gerard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+T+cell-T+cell+synaptic+interactions+drive+the+differentiation+of+protective+CD8++T+cells.">Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8+ T cells.</a> Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).</li><li>Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+planar+bilayers+for+study+of+the+immunological+synapse.">Supported planar bilayers for study of the immunological synapse.</a> Current Protocols in Immunology. , (2007).</li><li>Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2021)</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+compensation+for+flow+cytometry:+visualization+artifacts,+limitations,+and+caveats.">Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats.</a> Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).</li><li>Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+T+cells+is+induced+by+binding+to+nickel-chelating+lipids+in+supported+lipid+bilayers.">Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers.</a> Frontiers in Physiology. 11, 613367 (2020).</li><li>Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+spillover+spreading+for+comparing+instrument+performance+and+aiding+in+multicolor+panel+design.">Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design.</a> Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).</li><li>C&#233;spedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+antigen-presenting+cells+reveal+the+diversity+and+functional+specialisation+of+extracellular+vesicles+composing+the+fourth+signal+of+T+cell+immunological+synapses.">Synthetic antigen-presenting cells reveal the diversity and functional specialisation of extracellular vesicles composing the fourth signal of T cell immunological synapses.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Yoon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+non-activated+lymphocytes+using+three-dimensional+refractive+index+tomography+and+machine+learning.">Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distributions+of+autofluorescence+after+compensation:+Be+panglossian,+fret+not.">Distributions of autofluorescence after compensation: Be panglossian, fret not.</a> Cytometry A. 89 (4), 398-402 (2016).</li><li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+controls,+instrument+setup,+and+the+determination+of+positivity.">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li><li>Balint, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+attack+particles+are+autonomous+killing+entities+released+from+cytotoxic+T+cells.">Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells.</a> Science. 368 (6493), 897-901 (2020).</li><li>Cespedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+expression+of+the+hRSV+nucleoprotein+impairs+immunological+synapse+formation+with+T+cells.">Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).</li></ol>

Les BSLB sont des outils polyvalents pour étudier la production de particules des lymphocytes T stimulés par des membranes APC modèles. La flexibilité de la méthode permet la reconstitution de compositions membranaires complexes et réductionnistes pour étudier les effets des ligands et de leurs signaux sur la sécrétion de tSV et de particules d’attaque supramoléculaire et leurs composants. Nous avons testé cette technologie sur diverses cellules T, y compris les cellules TH, CTL, Tregs et C...

La synapse immunologique (IS) est une structure moléculaire pivot formée à l’interface des cellules engagées dans un contact physique qui facilite l’échange régulé d’informations sur la juxtracrine. Différents SYSTÈMES ont été décrits dans la littérature, et un nombre croissant de preuves suggère que ces centres moléculaires sont une caractéristique conservée des réseaux cellulaires. Diverses cellules immunitaires, y compris les cellules B, les cellules tueuses naturelles, les cellules dendritiques, les macrophages et les cellules T, échangent des informations via l’assemblage de contacts de courte durée1. Les études multiomiques font progresser la compréhension de nouveaux sous-ensembles de leucocytes et de cellules stromales conduisant des réseaux cellulaires pathogènes et exprimant des protéines de surface aux fonctions inconnues. En tant qu’APC synthétiques, les BSLEB permettent l’étude directe du rôle fonctionnel des protéines individuelles dans l’intégration des signaux activateurs, à savoir les antigènes et la costimulation/corépression, par les lymphocytes T et la libération résultante de particules effectrices appelées signal quatre.
Cet article décrit les protocoles et les points techniques critiques à prendre en compte lors de l’utilisation de BSLB pour imiter la composition de surface des APC modèles. Les protocoles pour la mesure quantitative des récepteurs immunitaires et d’autres protéines de surface sur les APC sont présentés avec le protocole pour la reconstitution des APC synthétiques contenant ces quantités mesurées. Ensuite, les étapes nécessaires à la coculture des lymphocytes T et du BSLB sont présentées avec le protocole de mesure quantitative du transfert transsynaptique de particules à l’aide de la cytométrie en flux. Plus remarquable encore, les BSLB facilitent l’étude d’une population dérivée de la membrane plasmique de tSV appelées ectosomes synaptiques (SE). Les SE enrichis en récepteurs d’antigènes des lymphocytes T (TCR+) sont éliminés en réponse au déclenchement du TCR2 et capturés efficacement par les BSLB3, ce qui représente une excellente lecture pour évaluer les propriétés agonistes des antigènes et la composition membranaire modélisée. Les exosomes CD63+ et les particules d’attaque supramoléculaire (SAP) sont également libérés par les lymphocytes T stimulés et capturés par les BSLB. Ils peuvent être utilisés comme lectures supplémentaires de l’activation et de la sécrétion de granules exocytaires et lytiques qui en résultent par les lymphocytes T. La mobilisation des vésicules exocytaires vers le pôle en interaction de la cellule T facilite également la libération directionnelle de cytokines, telles que l’IL-2, l’IFN-γ et l’IL-10 en réponse à l’activation4,5,6,7,8. Bien que les cytokines libérées par les lymphocytes T puissent également être détectées sur les BSLEB, une étude plus dédiée est actuellement en cours de développement pour valider l’analyse quantitative de la libération de cytokines au niveau de la synapse immunologique.
Pour interroger comment des compositions membranaires spécifiques influencent le rendement synaptique des lymphocytes T, il faut définir la densité physiologique du composant membranaire cible. Les quantifications basées sur la cytométrie en flux des protéines de surface cellulaire sont une étape essentielle de ce protocole et nécessitent : 1) l’utilisation d’anticorps avec un nombre connu de fluorochromes par anticorps (F/P), et 2) des billes de référence fournissant une référence standard pour l’interpolation des molécules de fluorochrome à partir des intensités moyennes de fluorescence (IMF) mesurées.
Ces étalons de référence se composent de cinq populations de billes, chacune contenant un nombre croissant de fluorochromes solubles équivalents (MESF), qui couvrent la plage dynamique de la détection arbitraire par fluorescence. Ces populations standard produisent des pics de fluorescence discrets, facilitant la conversion d’unités de fluorescence arbitraires en MESF par simple régression linéaire. Les MESF résultants sont ensuite utilisés avec les valeurs f/P des anticorps pour calculer le nombre moyen de molécules liées par cellule (ou BSLB dans les étapes ultérieures). L’application de surfaces cellulaires estimées au nombre moyen de molécules détectées permet alors le calcul de densités physiologiques sous forme de molécules/μm2. Ce protocole de quantification peut également être adapté à la mesure des densités protéiques sur les lymphocytes T et à la reconstitution biochimique des compositions membranaires médiant la formation de synapses homotypiques des lymphocytes T (c.-à-d. synapses T-T9). Si nécessaire, la valence de la liaison aux anticorps peut être davantage estimée en utilisant des cibles recombinantes marquées avec un nombre connu de fluorochromes par molécule. Ensuite, la valence de liaison aux anticorps peut être calculée pour la même population BSLB en comparant simultanément le nombre de protéines fluorescentes liées et d’anticorps de quantification (en utilisant deux fluorochromes de quantification différents et des normes MESF).
La reconstitution des membranes APC nécessite l’assemblage de bicouches lipidiques supportées (SLB) sur des billes de silice1. Les stocks de liposomes contenant différentes espèces de phospholipides peuvent être exploités pour former une matrice lipido-bicouche polyvalente, permettant l’ancrage de protéines recombinantes avec une chimie de liaison différente (la préparation des liposomes est détaillée en 10). Une fois que la densité physiologique (ou les densités) du ligand pertinent « sur les cellules » est définie, le même protocole de cytométrie en flux est adapté pour estimer la concentration de protéine recombinante nécessaire pour recouvrir les BSLB de la densité physiologique cible. Deux systèmes d’ancrage différents peuvent être utilisés en combinaison ou séparément.
Tout d’abord, le SLB contenant un dernier 12,5 mol% de phospholipides contenant du Ni2+ est suffisant pour fournir environ 10 000 sites de liaison His-tag par micron carré10 et fonctionne bien pour décorer les BSLB avec la plupart des protéines disponibles dans le commerce dont les densités physiologiques ne dépassent pas cette capacité de charge maximale. Le deuxième système de chargement exploite les phospholipides contenant de la biotine (en mol%) pour charger des anti-CD3e Fab biotinylés (ou monomères HLA/MHC) via des ponts streptavidines. La combinaison de ces deux méthodes de décoration BSLB permet ensuite la personnalisation flexible des BSLB en tant qu’APC synthétiques. Pour les compositions de surface APC très complexes, le mol% de phospholipides et de protéines peut être augmenté pour charger autant de protéines que la question en question l’exige. Une fois que les concentrations de travail des protéines et mol% des phospholipides biotinylés sont définies, les BSLB peuvent être assemblés pour interroger la sortie synaptique des lymphocytes T avec cytométrie en flux multiparamétrique.

preparation of bead-supported lipid bilayers to study the particulate output of t cell immune synapses

Les cellules présentatrices d’antigènes (APC) présentent trois signaux d’activation aux lymphocytes T engagés dans un contact physique : 1) l’antigène, 2) la costimulation/corépression et 3) les cytokines solubles. Les lymphocytes T libèrent deux types de particules effectrices en réponse à l’activation : les vésicules transsysylétiques (vST) et les particules d’attaque supramoléculaires, qui transfèrent respectivement des messagers intercellulaires et médient la cytotoxicité. Ces entités sont rapidement internalisées par les APC engagés dans un contact physique avec les lymphocytes T, ce qui rend leur caractérisation décourageante. Cet article présente le protocole de fabrication et d’utilisation des bicouches lipidiques supportées par des billes (BSLB) en tant que mimétiques de cellules présentatrices d’antigènes (APC) pour capturer et analyser ces particules transsynaptiques. Sont également décrits les protocoles pour les mesures absolues des densités de protéines à la surface des cellules, la reconstitution des BSLB avec de tels niveaux physiologiques et la procédure de cytométrie en flux pour suivre la libération de particules synaptiques par les cellules T. Ce protocole peut être adapté pour étudier les effets de protéines individuelles, de mélanges de ligands complexes, de déterminants de virulence pathogène et de médicaments sur la sortie effectrice des cellules T, y compris les cellules T auxiliaires, les lymphocytes T cytotoxiques, les cellules T régulatrices et les cellules T exprimant les récepteurs de l’antigène chimérique (CART).

FCM pour la quantification absolue des protéines à la surface de la cellule La reconstitution des BSLB présentant des densités physiologiques de ligands nécessite l’estimation des densités protéiques totales sur le sous-ensemble cellulaire modélisé. Pour reconstituer les BSLB, inclure tout ligand pertinent censé jouer un rôle dans l’axe de signalisation d’intérêt aux côtés des protéines soutenant l’adhésion et l’interaction fonctionnelle entre BSLB et les cellules, telles qu...

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Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses

Nous présentons ici le protocole pour la reconstitution par étapes de cellules synthétiques présentatrices d’antigènes à l’aide de bicouches lipidiques soutenues par des billes et leur utilisation pour interroger la sortie synaptique des cellules T activées.

Préparation de bicouches lipidiques soutenues par des perles pour étudier la production de particules des synapses immunitaires des lymphocytes T

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) ...

L’étude de la sortie de la synapse immunitaire a été limitée principalement à des méthodes microscopiques. Les BSLB ont élargi notre répertoire d’outils pouvant être utilisés pour étudier la production de synapses immunitaires des lymphocytes T, y compris la cytométrie en flux, la microscopie, la protéomique et les technologies de séquençage de l’ARN. En tant que tels, les BSLB peuvent être utilisés dans une grande variété de questions d’immunologie et dans l’identification de la composition et de la régulation biochimique de la sortie des lymphocytes T.Cela inclut, par exemple, l’étude des récepteurs d’antigènes chimériques, des médicaments qui inhibent des voies de signalisation spécifiques ou l’ablation génétique de gènes d’intérêt. L’un des aspects les plus critiques de ce protocole est d’optimiser les étalonnages de protéines et le panel de cytométrie en flux multicolore requis pour suivre la particule transsynaptique d’intérêt. Cela nécessite l’itération systématique des concentrations de protéines, des concentrations d’anticorps et des paramètres de l’instrument.Commencez par diluer un microlitre de solution de billes avec 1 000 microlitres de PBS. Comptez les billes à l’aide d’une chambre hémocytométrique et calculez leur concentration par millilitre. Ensuite, calculez le volume de billes de silice nécessaire pour 500 000 BSLB finaux par point de titrage.Transférer le volume requis de billes de silice dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 millilitre. Lavez les billes de silice trois fois avec un millilitre de PBS stérile et centrifugez les billes. Préparez trois volumes de mélange maître de liposomes contenant un pourcentage final de 12,5 moles de phospholipides contenant du nickel.Utilisez le mélange maître de liposomes pour remettre en suspension les billes de silice lavées. Ensuite, mélangez-le doucement en pipetant de haut en bas la moitié du volume total. À l’aide d’une technique stérile, ajoutez de l’argon ou de l’azote gazeux au tube pour déplacer l’air et protéger les lipides de l’oxydation pendant le mélange.Ajouter de l’argon aux stocks lipidiques de 0,4 millimolaire. Stockez le stock et manipulez-le à l’aide d’une technique stérile. Déplacez les BSLB vers le mélangeur vertical et mélangez pendant 30 minutes à température ambiante en utilisant le mélange orbital à 10 tr / min.Ensuite, faites tourner les perles en centrifugant pendant 15 secondes à température ambiante sur une minicentrifugeuse de paillasse. Bloquer les BSLEB formés en ajoutant un millilitre de 5% de BSA contenant 100 micromolaires de sulfate de nickel pour saturer les sites NTA sur les BSLB. Laver trois fois à l’aide d’un tampon HBS-HSA pour éliminer l’excès de solution bloquante.Prenez une nouvelle plaque de 96 puits à fond en U ou à fond en V et préparez deux dilutions en série des protéines. Remettre en suspension les BSLEB préparés dans un volume tel que 100 microlitres de tampon HBS-HSA contiennent 500 000 BSLEB. Ensuite, prenez une autre plaque de 96 puits à fond en U ou à fond en V et transférez 100 microlitres de la suspension BSLB aux puits de manière à ce que chaque puits reçoive 500 000 BSEL.Faire tourner la deuxième plaque à température ambiante pendant deux minutes à 300x G.Jeter le surnageant et transférer des volumes de 100 microlitres de la plaque de titrage des protéines vers la plaque contenant les BSLB sédimentés. Mélanger doucement, en évitant la génération excessive de bulles lors du pipetage. Utilisez du papier d’aluminium pour le protéger de la lumière et incubé à température ambiante pendant 30 minutes à 1 000 tr / min.Ensuite, lavez la plaque trois fois en ajoutant un tampon HBS-HSA à la plaque et faites-la tourner à température ambiante pendant deux minutes à 300x G.Comptez les cellules après le lavage. Ensuite, diluez-les à une concentration finale de 2,5 millions par millilitre à l’aide d’un milieu de dosage de transfert synaptique. Une fois que les BSLEB sont chargés avec le mélange de protéines, lavez les BSLB deux fois avec un tampon HBS-HSA pour éliminer l’excès de protéines non liées.Remettre en suspension 500 000 BSLB par puits dans 200 microlitres de tampon HBS-HSA. Transférer 100 microlitres de BSLB par puits vers une nouvelle plaque de 96 puits à fond en U pour en faire un double, de sorte que la quantité finale de BSLB par puits soit de 250 000. Faites tourner les BSLB à 300x G pendant deux minutes à température ambiante.Jetez le surnageant, puis remettez en suspension les BSLEB à l’aide de 100 microlitres de suspension de lymphocytes T. Mélanger doucement pour éviter la formation de bulles. Incuber les co-cultures pendant 90 minutes à 37 degrés Celsius.Protégez les cellules de la lumière et refroidissez les co-cultures en les incubant d’abord à température ambiante pendant au moins 15 minutes. Centrifuger les co-cultures à température ambiante pendant cinq minutes à 500x G.Jeter le surnageant et remettre en suspension les co-cultures dans du CALCIUM et du magnésium sans 2% BSA PBS à température ambiante pour les bloquer. Placez les cellules sur la glace pendant 45 minutes et protégez-les de la lumière.Préparez le mélange maître d’anticorps en utilisant du BSA et du PBS filtrés à 0,22 micromètre et du PBS comme tampon de coloration. Ce mélange principal fournira un blocage supplémentaire. Faites tourner les co-cultures à 500x G pendant cinq minutes et quatre degrés Celsius.Jetez les surnageants, puis utilisez une pipette multicanal pour remettre en suspension les cellules dans le mélange maître de coloration contenant des concentrations d’anticorps optimisées. Inclure les cellules marquées par isotype et les BSLECB, les BSLB fluorescents et non fluorescents, ainsi que les cellules et les BSLB colorés seuls. Mélanger doucement en pipetant vers le haut et vers le bas la moitié du volume.Incuber pendant 30 minutes sur de la glace et les protéger de la lumière. Lavez les cellules et les BSLEB deux fois à l’aide de PBS 2% BSA glacé. Faites-les tourner à 500x G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Après centrifugation, vérifier la co-culture sédimentée au fond des puits. Ensuite, remettez en suspension les co-cultures lavées dans 100 microlitres de PBS et acquérez-les immédiatement. Activez l’échelle logarithmique pour la lumière diffusée latéralement et le paramètre de temps de vol pour les lumières diffusées latéralement et vers l’avant.Acquérir les normes MESF, en veillant à ce que les populations les plus sombres et les plus brillantes se situent dans la gamme linéaire de l’instrument. Ensuite, acquérez des échantillons de compensation, calculez la compensation et appliquez la matrice de compensation à l’expérience. Acquérir et enregistrer un minimum de 20 000 normes MESF au total pour chaque canal de quantification.Évitez d’utiliser du liquide de gaine FACS ou similaire pour remettre en suspension des billes MESF, car celles-ci contiennent des sels et des alcools qui détruiront les fluorochromes, entraînant des pics de fluorescence plus larges et une erreur élevée. Pour l’acquisition à l’aide d’échantillonneurs à haut débit, réglez l’acquisition d’instruments sur Standard, réglez l’acquisition d’échantillons sur 80 microlitres. Débit de l’échantillon entre deux et trois microlitres par seconde, volume de mélange de l’échantillon à 50 microlitres, mélange de l’échantillon de 150 microlitres par seconde et mélange par puits entre trois et cinq.Acquérir un minimum de 10 000 BSLB uniques par échantillon. Enfin, exportez les fichiers FCS. Un exemple de mesures quantitatives de cytométrie en flux de l’ICAM-1 à la surface des lymphocytes B amygdaliens et des lymphocytes T auxiliaires est présenté ici.Les images représentatives décrivent la stratégie de contrôle pour l’analyse des lymphocytes B CXCR5 uniques et des lymphocytes T folliculaires auxiliaires isolés des amygdales palatines humaines. Cette stratégie de contrôle séquentiel identifie des événements en direct uniques dans la fenêtre d’acquisition continue. Les doublets, l’expression de la surface cellulaire de l’ICAM-1 par rapport aux contrôles FMO et aux contrôles FMO étiquetés avec les isotypes pertinents des populations, sont montrés ici.La vérification et la mesure des IMF de différentes populations MESF standard dans les histogrammes superposés des populations MESF sont présentées ici. Les valeurs représentent les IMF pour chacune des cinq populations MESF. La régression linéaire du MESF sur l’IFM pour les populations du MESF est présentée ici.La pente extrait mesF lié aux cellules à partir des données FCM de l’ICAM-1 à la surface des cellules B amygdales dans TFH. La conversion en densités moléculaires absolues suit ces opérations mathématiques simples. Les images représentatives montrent l’analyse par cytométrie en flux des BSLEB reconstitués avec des densités accrues d’histidines monomères recombinantes ICAM-1 12.Les analyses de régression de la concentration de référence ICAM-1 par rapport à la densité mesurée sont présentées ici. La pente est utilisée pour calculer les concentrations cibles de protéines afin d’atteindre la densité des cellules. Les diagrammes de flux montrent les étapes critiques pour la co-culture des lymphocytes T avec les BSLB, la reconstitution des membranes modèles dans la mesure ultérieure du transfert de particules avec cytométrie en flux.La stratégie de contrôle pour identifier les BSLB et les cellules uniques dans la fenêtre d’acquisition continue est présentée ici. L’un des aspects les plus importants de ce protocole est que, pour maintenir la reproductibilité des résultats, chaque fois que vous modifiez les stocks de protéines ou de lipides, vous devez effectuer une nouvelle analyse d’étalonnage. Pour découvrir de nouvelles molécules efficaces sécrétées par différents sous-ensembles de lymphocytes T, les BSLB peuvent être isolés davantage par tri cellulaire activé par fluorescence soumis à une analyse transcriptomique et protéomique.Nos collègues de l’Université d’Oxford ont utilisé cette technologie pour étudier et démontrer de nouvelles interactions récepteur-ligand, ainsi que pour étudier les effets des ablations génétiques sur la sortie de la synapse immunitaire des lymphocytes T.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

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Recherche

Immunologie et infection

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