Name: preparation of bead-supported lipid bilayers to study the particulate output of t cell immune synapses
Uploaded: 2022-04-01T13:30:00
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Wir danken unseren Labormitgliedern und der Gemeinschaft des Kennedy Institute of Rheumatology für konstruktive wissenschaftliche Diskussionen, insbesondere unserem Durchflusszytometrie-Facility-Manager Jonathan Webber. Diese Arbeit wurde durch das Wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z, den ERC Advanced Grant (SYNECT AdG 670930) und den Kennedy Trust for Rheumatology Research (KTRR) (alle drei an MLD) finanziert. PFCD wurde durch embo Long-Term Fellowship (ALTF 1420-2015, in Zusammenarbeit mit der Europäischen Kommission (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) und Marie Sklodowska-Curie Actions) und ein Oxford-Bristol Myers Squibb Fellowship unterstützt.

1. Messung der Zelloberflächenproteindichten mit quantitativer Durchflusszytometrie
<ol><li>Herstellen eines 0,22 μm-gefilterten menschlichen Durchflusszytometriepuffers (hFCB) durch Zugabe von EDTA (auf eine endgültige Konzentration von 2 mM) und humanem AB-Serum (auf letzte 10 %) zu steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4 (siehe Tabelle 1). Die Lösung wird mit einer 0,22 μm Porenfiltereinheit filtriert, um Serumverunreinigungen zu entfernen, und bei 4 °C gela...

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	<li>Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+to+reconstitute+immune+cell+signaling.">Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling.</a> FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).</li><li>Choudhuri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+release+of+T-cell-receptor-enriched+microvesicles+at+the+immunological+synapse.">Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological synapse.</a> Nature. 507 (7490), 118-123 (2014).</li><li>Saliba, D. 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Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2021)</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+compensation+for+flow+cytometry:+visualization+artifacts,+limitations,+and+caveats.">Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats.</a> Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).</li><li>Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+T+cells+is+induced+by+binding+to+nickel-chelating+lipids+in+supported+lipid+bilayers.">Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers.</a> Frontiers in Physiology. 11, 613367 (2020).</li><li>Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+spillover+spreading+for+comparing+instrument+performance+and+aiding+in+multicolor+panel+design.">Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design.</a> Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).</li><li>C&#233;spedes, P. 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T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+controls,+instrument+setup,+and+the+determination+of+positivity.">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li><li>Balint, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+attack+particles+are+autonomous+killing+entities+released+from+cytotoxic+T+cells.">Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells.</a> Science. 368 (6493), 897-901 (2020).</li><li>Cespedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+expression+of+the+hRSV+nucleoprotein+impairs+immunological+synapse+formation+with+T+cells.">Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).</li></ol>

BSLBs sind vielseitige Werkzeuge zur Untersuchung der Partikelabgabe von T-Zellen, die mit Modell-APC-Membranen stimuliert werden. Die Flexibilität der Methode ermöglicht die Rekonstitution komplexer und reduktionistischer Membranzusammensetzungen, um die Auswirkungen von Liganden und deren Signalen auf die Sekretion von tSVs und supramolekularen Angriffspartikeln und deren Komponenten zu untersuchen. Wir haben diese Technologie an verschiedenen T-Zellen getestet, darunter voraktivierte TH, CTL, Tregs und <sup class="x...

Die immunologische Synapse (IS) ist eine zentrale molekulare Struktur, die an der Schnittstelle von Zellen gebildet wird, die in physischem Kontakt stehen und den regulierten Austausch von Juxtracrin-Informationen erleichtern. Verschiedene ISs wurden in der Literatur beschrieben, und eine wachsende Zahl von Beweisen deutet darauf hin, dass diese molekularen Zentren ein konserviertes Merkmal zellulärer Netzwerke sind. Verschiedene Immunzellen, darunter B-Zellen, natürliche Killerzellen, dendritische Zellen, Makrophagen und T-Zellen, tauschen Informationen über den Aufbau kurzlebiger Kontakte aus1. Multiomische Studien fördern das Verständnis neuartiger Untergruppen von Leukozyten und Stromazellen, die pathogene zelluläre Netzwerke antreiben und Oberflächenproteine mit unbekannten Funktionen exprimieren. Als synthetische APCs erlauben BSLBs die direkte Untersuchung der funktionellen Rolle einzelner Proteine bei der Integration von aktivierenden Signalen, nämlich Antigenen und Kostimulation/Corepression, durch T-Zellen und die daraus resultierende Freisetzung von Effektorpartikeln, die als Signal vier bezeichnet werden.
In diesem Dokument werden die Protokolle und kritischen technischen Punkte beschrieben, die bei der Verwendung von BSLBs zur Nachahmung der Oberflächenzusammensetzung von Modell-APCs zu berücksichtigen sind. Die Protokolle für die quantitative Messung von Immunrezeptoren und anderen Oberflächenproteinen auf APCs werden zusammen mit dem Protokoll für die Rekonstitution synthetischer APCs, die diese gemessenen Größen enthalten, vorgestellt. Anschließend werden die schritte, die für die Kokulturation von T-Zellen und BSLB erforderlich sind, zusammen mit dem Protokoll für die quantitative Messung des transsynaptischen Partikeltransfers mittels Durchflusszytometrie vorgestellt. Am bemerkenswertesten ist, dass BSLBs die Untersuchung einer aus der Plasmamembran abgeleiteten Population von tSVs erleichtern, die als synaptische Ektosomen (SEs) bezeichnet werden. T-Zell-Antigenrezeptor-angereicherte (TCR+) SEs werden als Reaktion auf TCR-Triggerung2 abgestoßen und effizient von BSLBs3 abgefangen, was eine hervorragende Ablesung darstellt, um die agonistischen Eigenschaften von Antigenen und die modellierte Membranzusammensetzung zu bewerten. CD63+-Exosomen und supramolekulare Angriffspartikel (SMAPs) werden ebenfalls von stimulierten T-Zellen freigesetzt und von BSLBs eingefangen. Sie können als zusätzliche Auslesungen der Aktivierung und der daraus resultierenden exozytären und lytischen Granulensekretion durch T-Zellen verwendet werden. Die Mobilisierung exozytärer Vesikel zum interagierenden Pol der T-Zelle erleichtert auch die direktionale Freisetzung von Zytokinen wie IL-2, IFN-γ und IL-10 als Reaktion auf die Aktivierung4,5,6,7,8. Obwohl T-Zell-freigesetzte Zytokine auch auf BSLBs nachgewiesen werden können, befindet sich derzeit eine speziellere Studie in der Entwicklung, um die quantitative Analyse der Zytokinfreisetzung an der immunologischen Synapse zu validieren.
Um zu untersuchen, wie spezifische Membranzusammensetzungen die synaptische Leistung von T-Zellen beeinflussen, muss die physiologische Dichte der Zielmembrankomponente definiert werden. Durchflusszytometrie-basierte Quantifizierungen von Zelloberflächenproteinen sind ein wesentlicher Schritt in diesem Protokoll und erfordern: 1) die Verwendung von Antikörpern mit bekannter Anzahl von Fluorochromen pro Antikörper (F / P) und 2) Benchmark-Kügelchen, die eine Standardreferenz für die Interpolation von Fluorochrommolekülen aus gemessenen mittleren Fluoreszenzintensitäten (MFIs) darstellen.
Diese Benchmark-Standards bestehen aus fünf Perlenpopulationen, die jeweils eine zunehmende Anzahl äquivalenter löslicher Fluorochrome (MESFs) enthalten, die den Dynamikbereich der willkürlichen Fluoreszenzdetektion abdecken. Diese Standardpopulationen liefern diskrete Fluoreszenzpeaks, die die Umwandlung beliebiger Fluoreszenzeinheiten in MESFs durch einfache lineare Regression erleichtern. Die resultierenden MESFs werden dann zusammen mit Antikörper-F/P-Werten verwendet, um die durchschnittliche Anzahl der gebundenen Moleküle pro Zelle (oder BSLB in späteren Schritten) zu berechnen. Die Anwendung der geschätzten Zelloberflächen auf die durchschnittliche Anzahl der nachgewiesenen Moleküle ermöglicht dann die Berechnung physiologischer Dichten als Moleküle/μm2. Dieses Quantifizierungsprotokoll kann auch an die Messung von Proteindichten auf T-Zellen und die biochemische Rekonstitution von Membranzusammensetzungen angepasst werden, die die Bildung homotypischer T-Zell-Synapsen (d.h. T-T-Synapsen9) vermitteln. Bei Bedarf kann die Wertigkeit der Antikörperbindung weiter geschätzt werden, indem rekombinante Targets verwendet werden, die mit einer bekannten Anzahl von Fluorochromen pro Molekül markiert sind. Dann kann die Antikörper-bindende Valenz für die gleiche BSLB-Population berechnet werden, indem gleichzeitig die Anzahl der gebundenen fluoreszierenden Proteine und Quantifizierungsantikörper verglichen wird (unter Verwendung von zwei verschiedenen Quantifizierungsfluorochromen und MESF-Standards).
Die Rekonstitution von APC-Membranen erfordert die Montage von gestützten Lipiddoppelschichten (SLBs) auf Silica-Perlen1. Liposomenbestände, die verschiedene Phospholipidspezies enthalten, können zu einer vielseitigen Lipid-Doppelschicht-Matrix genutzt werden, die die Verankerung rekombinanter Proteine mit unterschiedlicher Bindungschemie ermöglicht (die Herstellung von Liposomen ist in 10 beschrieben). Sobald die physiologische Dichte (oder Dichte) des relevanten Liganden "auf Zellen" definiert ist, wird das gleiche Durchflusszytometrieprotokoll angepasst, um die Konzentration des rekombinanten Proteins abzuschätzen, das benötigt wird, um BSLBs mit der physiologischen Zieldichte zu beschichten. Zwei verschiedene Verankerungssysteme können entweder in Kombination oder separat verwendet werden.
Erstens reicht SLB, das die letzten 12,5 Mol-% Ni2+-haltiger Phospholipide enthält, aus, um etwa 10.000 His-Tag-Bindungsstellen pro Quadratmikron10 bereitzustellen, und eignet sich gut, um BSLBs mit den meisten kommerziell erhältlichen Proteinen zu dekorieren, deren physiologische Dichten diese maximale Beladungskapazität nicht überschreiten. Das zweite Ladesystem nutzt biotinhaltige Phospholipide (als mol%), um biotinylierte Anti-CD3e Fab (oder HLA /MHC-Monomere) über Streptavidinbrücken zu laden. Die Kombination dieser beiden BSLB-Dekorationsmethoden ermöglicht dann die flexible Anpassung von BSLBs als synthetische APCs. Bei hochkomplexen APC-Oberflächenzusammensetzungen kann der Mol-Anteil an Phospholipiden und Proteinen erhöht werden, um so viele Proteine zu laden, wie die vorliegende Frage erfordert. Sobald die Arbeitskonzentrationen von Proteinen und Mol-% biotinylierter Phospholipide definiert sind, können BSLBs zusammengestellt werden, um die synaptische Leistung von T-Zellen mit multiparametrischer Durchflusszytometrie zu abfragen.

preparation of bead-supported lipid bilayers to study the particulate output of t cell immune synapses

Antigen-präsentierende Zellen (APCs) präsentieren drei aktivierende Signale an T-Zellen, die in physischem Kontakt stehen: 1) Antigen, 2) Kostimulation / Kernpression und 3) lösliche Zytokine. T-Zellen setzen als Reaktion auf die Aktivierung zwei Arten von Effektorpartikeln frei: transsynaptische Vesikel (tSVs) und supramolekulare Angriffspartikel, die interzelluläre Botenstoffe übertragen bzw. Zytotoxizität vermitteln. Diese Entitäten werden schnell von APCs verinnerlicht, die in physischem Kontakt mit T-Zellen stehen, was ihre Charakterisierung entmutigend macht. Dieser Artikel stellt das Protokoll zur Herstellung und Verwendung von Bead-Supported Lipid Bilayers (BSLBs) als Antigen-präsentierende Zell (APC) Mimetika vor, um diese transsynaptischen Partikel zu erfassen und zu analysieren. Ebenfalls beschrieben sind die Protokolle für die absoluten Messungen von Proteindichten auf Zelloberflächen, die Rekonstitution von BSLBs mit solchen physiologischen Werten und das Durchflusszytometrieverfahren zur Verfolgung der synaptischen Partikelfreisetzung durch T-Zellen. Dieses Protokoll kann angepasst werden, um die Auswirkungen einzelner Proteine, komplexer Ligandengemische, Pathogenvirulenzdeterminanten und Medikamente auf den Effektorausgang von T-Zellen, einschließlich Helfer-T-Zellen, zytotoxischen T-Lymphozyten, regulatorischen T-Zellen und chimären Antigenrezeptor-exprimierenden T-Zellen (CART), zu untersuchen.

FCM zur absoluten Proteinquantifizierung auf der Zelloberfläche Die Rekonstitution von BSLBs, die physiologische Dichten von Liganden aufweisen, erfordert die Abschätzung der Gesamtproteindichten auf der modellierten Zelluntergruppe. Um BSLBs zu rekonstruieren, schließen Sie alle relevanten Liganden ein, von denen erwartet wird, dass sie eine Rolle in der Signalachse von Interesse spielen, neben Proteinen, die die Adhäsion und funktionelle Interaktion zwischen BSLB und Zellen unterstützen, wie IC...

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Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses

Hier stellen wir das Protokoll für die schrittweise Rekonstitution synthetischer Antigen-präsentierender Zellen unter Verwendung von Bead-Supported Lipid Bilayers und deren Verwendung zur Abfrage der synaptischen Ausgabe von aktivierten T-Zellen vor.

Herstellung von perlengestützten Lipiddoppelschichten zur Untersuchung der partikulären Ausscheidung von T-Zell-Immunsynapsen

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) ...

Die Untersuchung des Outputs der Immunsynapse beschränkte sich meist auf mikroskopische Methoden. BSLBs haben unser Repertoire an Werkzeugen erweitert, mit denen die Ausgabe von T-Zell-Immunsynapsen untersucht werden kann, einschließlich Durchflusszytometrie, Mikroskopie, Proteomik und RNA-Sequenzierungstechnologien. Als solche können BSLBs in einer Vielzahl von immunologischen Fragen und bei der Identifizierung der Zusammensetzung und biochemischen Regulation des T-Zell-Outputs verwendet werden.Dazu gehören beispielsweise die Untersuchung chimärer Antigenrezeptoren, Medikamente, die bestimmte Signalwege hemmen, oder die genetische Ablation von Interessanten. Einer der kritischsten Aspekte dieses Protokolls ist die Optimierung der Proteinkalibrierungen und des mehrfarbigen Durchflusszytometrie-Panels, die für die Verfolgung des transsynaptischen Partikels von Interesse erforderlich sind. Dies erfordert die systematische Iteration von Proteinkonzentrationen, Antikörperkonzentrationen und Instrumenteneinstellungen.Beginnen Sie mit der Verdünnung eines Mikroliters Perlenlösung mit 1.000 Mikroliter PBS. Zählen Sie die Kügelchen mit einer Hämozytometerkammer und berechnen Sie ihre Konzentration pro Milliliter. Berechnen Sie dann das Volumen der Silica-Perlen, die für 500.000 endgültige BSLBs pro Titrationspunkt benötigt werden.Übertragen Sie das erforderliche Volumen an Silica-Kügelchen in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Waschen Sie die Silica-Perlen dreimal mit einem Milliliter sterilem PBS und zentrifugieren Sie die Perlen. Bereiten Sie drei Bände Liposomen-Master-Mix vor, die einen letzten 12,5-Mol-Prozentsatz nickelhaltiger Phospholipide enthalten.Verwenden Sie die Liposomen-Mastermischung, um die gewaschenen Silica-Perlen wieder zu versenken. Mischen Sie es dann vorsichtig, indem Sie die Hälfte des Gesamtvolumens nach oben und unten pipettieren. Fügen Sie dem Röhrchen mit einer sterilen Technik Argon- oder Stickstoffgas hinzu, um die Luft zu verdrängen und die Lipide während des Mischens vor Oxidation zu schützen.Argon zu den 0,4-millimolaren Lipidvorräten hinzufügen. Lagern Sie die Brühe und manipulieren Sie sie mit einer sterilen Technik. Bewegen Sie die BSLBs zum vertikalen Mischer und mischen Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur mit Orbitalmischung bei 10 U / min.Drehen Sie dann die Perlen herunter, indem Sie sie 15 Sekunden lang bei Raumtemperatur auf einer Tisch-Minizentrifuge zentrifugieren. Blockieren Sie die gebildeten BSLBs, indem Sie einen Milliliter 5% BSA mit 100 Mikromol Nickelsulfat hinzufügen, um NTA-Stellen auf den BSLBs zu sättigen. Waschen Sie dreimal mit HBS-HSA-Puffer, um die überschüssige Blockierungslösung zu entfernen.Nehmen Sie eine neue U-Boden- oder V-Boden-96-Well-Platte und bereiten Sie zweifache serielle Verdünnungen der Proteine vor. Resuspendieren Sie die hergestellten BSLBs in einem Volumen, so dass 100 Mikroliter HBS-HSA-Puffer 500.000 BSLBs enthalten. Nehmen Sie dann eine weitere U-Bottom- oder V-Bottom-96-Well-Platte und übertragen Sie 100 Mikroliter der BSLB-Suspension so in die Wells, dass jede Bohrung 500.000 BSBLs erhält.Drehen Sie die zweite Platte bei Raumtemperatur für zwei Minuten bei 300x G hinunter.Entsorgen Sie den Überstand und übertragen Sie 100-Mikroliter-Volumen von der Proteintitrationsplatte auf die Platte, die die sedimentierten BSLBs enthält. Mischen Sie vorsichtig, um eine übermäßige Blasenbildung während des Pipettierens zu vermeiden. Verwenden Sie Aluminiumfolie, um es vor Licht zu schützen und bei Raumtemperatur für 30 Minuten bei 1.000 U / min zu inkubieren.Waschen Sie dann die Platte dreimal, indem Sie einen HBS-HSA-Puffer auf die Platte geben, und drehen Sie sie bei Raumtemperatur für zwei Minuten bei 300x G herunter.Zählen Sie die Zellen nach dem Waschen. Verdünnen Sie sie dann mit einem synaptischen Transfer-Assay-Medium auf eine Endkonzentration von 2,5 Millionen pro Milliliter. Sobald die BSLBs mit der Proteinmischung beladen sind, waschen Sie die BSLBs zweimal mit HBS-HSA-Puffer, um die überschüssigen ungebundenen Proteine zu entfernen.Resuspend 500.000 BSLBs pro Vertiefung in 200 Mikroliter HBS-HSA-Puffer. Übertragen Sie 100 Mikroliter BSLBs pro Bohrloch auf eine neue U-Bodenplatte mit 96 Bohrlöchern, um ein Duplikat herzustellen, so dass die endgültige Menge an BSLB pro Bohrloch 250.000 beträgt. Drehen Sie die BSLBs bei 300x G für zwei Minuten bei Raumtemperatur herunter.Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie dann die BSLBs mit 100 Mikrolitern T-Zell-Suspension. Mischen Sie vorsichtig, um die Bildung von Blasen zu verhindern. Die Co-Kulturen 90 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.Schützen Sie die Zellen vor Licht und kühlen Sie die Co-Kulturen ab, indem Sie sie zunächst bei Raumtemperatur für mindestens 15 Minuten inkubieren. Zentrifugieren Sie die Co-Kulturen bei Raumtemperatur für fünf Minuten bei 500x G.Entsorgen Sie den Überstand und resuspenieren Sie die Co-Kulturen in Calcium- und Magnesium-Ionen-freiem 2% BSA PBS bei Raumtemperatur zur Blockierung. Legen Sie die Zellen für 45 Minuten auf Eis und schützen Sie sie vor Licht.Bereiten Sie die Antikörper-Master-Mischung mit eiskaltem 0,22-Mikrometer-gefiltertem 2% BSA und PBS als Färbepuffer vor. Dieser Master-Mix bietet zusätzliche Blockierung. Drehen Sie die Co-Kulturen bei 500x G für fünf Minuten und vier Grad Celsius herunter.Verwerfen Sie die Überstände und verwenden Sie dann eine Mehrkanalpipette, um die Zellen in der Färbemastermischung mit optimierten Antikörperkonzentrationen wieder zu versuspenden. Dazu gehören isotypmarkierte Zellen und BSLBs, fluoreszierende und nicht fluoreszierende BSLBs sowie zellen und BSLBs, die allein gefärbt wurden. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie die Hälfte des Volumens nach oben und unten pipettieren.Inkubieren Sie 30 Minuten auf Eis und schützen Sie sie vor Licht. Waschen Sie die Zellen und BSLBs zweimal mit eiskaltem 2% BSA PBS. Drehen Sie sie bei 500x G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius nach unten.Überprüfen Sie nach der Zentrifugation die auf dem Boden der Vertiefungen sedimentierte Kokultur. Dann resuspendieren Sie die gewaschenen Co-Kulturen in 100 Mikroliter PBS und erwerben Sie sofort. Aktivieren Sie die Log-Skala für seitlich gestreutes Licht und den Time-of-Flight-Parameter für seitlich und vorwärts gestreute Lichter.Erwerben Sie MESF-Standards, um sicherzustellen, dass sowohl die gedämpfte als auch die hellste Population in den linearen Bereich des Instruments fallen. Erwerben Sie dann Kompensationsproben, berechnen Sie die Kompensation und wenden Sie die Kompensationsmatrix auf das Experiment an. Erwerben und speichern Sie mindestens 20.000 MESF-Standards für jeden Quantifizierungskanal.Vermeiden Sie die Verwendung von FACS-Mantelflüssigkeit oder ähnlichem wie resuspend MESF-Perlen, da diese Salze und Alkohole enthalten, die die Fluorochrome zerstören, was zu breiteren Fluoreszenzspitzen und hohem Fehler führt. Stellen Sie für die Erfassung mit Hochdurchsatz-Probenehmern die Geräteerfassung auf Standard und die Probenerfassung auf 80 Mikroliter ein. Probendurchflussrate zwischen zwei und drei Mikrolitern pro Sekunde, Probenmischvolumen bei 50 Mikrolitern, Probenmischen von 150 Mikrolitern pro Sekunde und Mischen pro Vertiefung zwischen drei und fünf.Erwerben Sie mindestens 10.000 einzelne BSLBs pro Probe. Exportieren Sie abschließend die FCS-Dateien. Ein Beispiel für quantitative durchflusszytometrische Messungen von ICAM-1 auf der Oberfläche von Tonsillar-B-Zellen und Helfer-T-Zellen ist hier dargestellt.Die repräsentativen Bilder beschreiben die Gating-Strategie zur Analyse einzelner CXCR5 B-Zellen und follikulärer Helfer-T-Zellen, die aus menschlichen Gaumenmandeln isoliert wurden. Diese sequenzielle Gating-Strategie identifiziert einzelne Live-Ereignisse innerhalb des kontinuierlichen Erfassungsfensters. Die Dubletten, die Zelloberflächenexpression von ICAM-1 im Vergleich zu FMO-Kontrollen und FMO-Kontrollen, die mit relevanten Isotypen der Populationen markiert sind, sind hier dargestellt.Gating und Messung von MFIs aus verschiedenen Standard-MESF-Populationen in den überlagerten Histogrammen der MESF-Populationen sind hier dargestellt. Die Werte stellen die MFIs für jede der fünf MESF-Populationen dar. Die lineare Regression von MESF über cMFI für die MESF-Populationen wird hier vorgestellt.Die Steigung extrahiert MESF, die an Zellen gebunden sind, aus den FCM-Daten von ICAM-1 auf der Oberfläche von Tonsillar-B-Zellen in TFH. Die Umrechnung in absolute Moleküldichten folgt diesen einfachen mathematischen Operationen. Die repräsentativen Bilder zeigen die durchflusszytometrische Analyse von BSLBs rekonstituiert mit erhöhten Dichten rekombinanter monomerer ICAM-1 12 Histidine.Regressionsanalysen der ICAM-1-Referenzkonzentration über der gemessenen Dichte sind hier dargestellt. Die Steigung wird verwendet, um Zielkonzentrationen von Protein zu berechnen, um die Dichte der Zellen zu erreichen. Die Flussdiagramme zeigen die kritischen Schritte zur Kokulturierung von T-Zellen mit BSLBs und rekonstituieren Modellmembranen bei der anschließenden Messung des Partikeltransfers mit Durchflusszytometrie.Die Gating-Strategie zur Identifizierung einzelner BSLBs und Zellen innerhalb des kontinuierlichen Erfassungsfensters wird hier gezeigt. Einer der wichtigsten Aspekte dieses Protokolls ist, dass Sie jedes Mal, wenn Sie Protein- oder Lipidvorräte ändern, eine neue Kalibrierungsanalyse durchführen müssen, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse aufrechtzuerhalten. Um neue wirksame Moleküle zu entdecken, die von verschiedenen T-Zell-Untergruppen sezerniert werden, können BSLBs durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung weiter isoliert werden, während sie einer transkriptomischen und proteomischen Analyse unterzogen werden.Unsere Kollegen an der Universität Oxford haben diese Technologie verwendet, um neue Rezeptor-Ligand-Interaktionen zu untersuchen und zu demonstrieren und auch um die Auswirkungen genetischer Ablationen auf die Produktion der T-Zell-Immunsynapse zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Competitive Homing-Assays auf Gut-trope T-Zell-Migration Study

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Forschung

Immunologie und Infektion

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Eine Einführung in die parasitischen Wespen<em&gt; Drosophila</em&gt; Und die antiparasitäre Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Imaging von HIV-1 Envelope-induzierte virologische Synapse und Signalisierung auf Synthetic Lipiddoppelschichten

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

Isolierung und Differenzierung von Th17 Naive CD4-T-Lymphozyten

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

Generierung von Lymphknoten-Fett-Pad Chimären für die Studie der Lymphknoten Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Transplantation von Haut-Schwanz zu allogene CD4-T-Zellantworten in Mäusen untersucht

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Maus Naive CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zell-Isolierung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Differenzierung in T-Zell-Populationen

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Methoden Lipidveränderungen in Neutrophilen und die anschließende Bildung von Neutrophilen Extracellular Traps zu studieren

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Retrovirale Transduktion von T-Helferzellen als genetischer Ansatz zur Untersuchung Mechanismen der Kontrolle ihrer Differenzierung und Funktion

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Ein Saug Blister-Protokoll, menschliche T-Zelle Recall Antworten In Vivo zu studieren

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...