Name: preparation of bead-supported lipid bilayers to study the particulate output of t cell immune synapses
Uploaded: 2022-04-01T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses at JoVE.com

אנו מודים לחברי המעבדה שלנו ולקהילת מכון קנדי לראומטולוגיה על דיונים מדעיים קונסטרוקטיביים, במיוחד מנהל מתקן ציטומטריית הזרימה שלנו, ג'ונתן וובר. עבודה זו מומנה על ידי מלגת המחקר הראשית של Wellcome Trust 100262Z/12/Z, המענק המתקדם של ERC (SYNECT AdG 670930), וקרן קנדי למחקר ראומטולוגיה (KTRR) (כל השלושה ל- MLD). PFCD נתמך על ידי EMBO ארוך טווח מלגה (ALTF 1420-2015, בשיתוף עם הנציבות האירופית (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) ומארי Sklodowska-Curie פעולות) ומלגת אוקספורד-בריסטול מאיירס סקוויב.

1. מדידה של צפיפות חלבון פני התא עם ציטומטריית זרימה כמותית
<ol><li>הכינו מאגר ציטומטריה של זרימה אנושית מסוננת ב-0.22 מיקרומטר (hFCB) על-ידי הוספת EDTA (לריכוז סופי של 2 מ"מM) וסרום AB אנושי (ל-10%) סופיים לתמיסת מלח סטרילית עם חוצץ פוספט (PBS), pH 7.4 (ראו טבלה 1). לסנן את הפתרון באמצעות יחידת ?...

<ol>
	<li>Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+to+reconstitute+immune+cell+signaling.">Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling.</a> FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).</li><li>Choudhuri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+release+of+T-cell-receptor-enriched+microvesicles+at+the+immunological+synapse.">Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological synapse.</a> Nature. 507 (7490), 118-123 (2014).</li><li>Saliba, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+structure+of+synaptic+ectosomes+exporting+antigen+receptor+linked+to+functional+CD40+ligand+from+helper+T+cells.">Composition and structure of synaptic ectosomes exporting antigen receptor linked to functional CD40 ligand from helper T cells.</a> elife. 8, 47528 (2019).</li><li>Barcia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+polarization+of+IFN-gamma+at+Kupfer+and+non-Kupfer+immunological+synapses+during+the+clearance+of+virally+infected+brain+cells.">In vivo polarization of IFN-gamma at Kupfer and non-Kupfer immunological synapses during the clearance of virally infected brain cells.</a> Journal of Immunology. 180 (3), 1344-1352 (2008).</li><li>Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+use+two+directionally+distinct+pathways+for+cytokine+secretion.">T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion.</a> Nature Immunology. 7 (3), 247-255 (2006).</li><li>Kupfer, A., Mosmann, T. R., Kupfer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+expression+of+cytokines+in+cell+conjugates+of+helper+T+cells+and+splenic+B+cells.">Polarized expression of cytokines in cell conjugates of helper T cells and splenic B cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (3), 775-779 (1991).</li><li>Kupfer, H., Monks, C. R., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+splenic+B+cells+that+bind+to+antigen-specific+T+helper+(Th)+cells+and+face+the+site+of+cytokine+production+in+the+Th+cells+selectively+proliferate:+immunofluorescence+microscopic+studies+of+Th-B+antigen-presenting+cell+interactions.">Small splenic B cells that bind to antigen-specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate: immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen-presenting cell interactions.</a> Journal of Experimental Medicine. 179 (5), 1507-1515 (1994).</li><li>Reichert, P., Reinhardt, R. L., Ingulli, E., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+in+vivo+identification+of+TCR+redistribution+and+polarized+IL-2+production+by+naive+CD4+T+cells.">Cutting edge: in vivo identification of TCR redistribution and polarized IL-2 production by naive CD4 T cells.</a> Journal of Immunology. 166 (7), 4278-4281 (2001).</li><li>Gerard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+T+cell-T+cell+synaptic+interactions+drive+the+differentiation+of+protective+CD8++T+cells.">Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8+ T cells.</a> Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).</li><li>Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+planar+bilayers+for+study+of+the+immunological+synapse.">Supported planar bilayers for study of the immunological synapse.</a> Current Protocols in Immunology. , (2007).</li><li>Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2021)</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+compensation+for+flow+cytometry:+visualization+artifacts,+limitations,+and+caveats.">Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats.</a> Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).</li><li>Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+T+cells+is+induced+by+binding+to+nickel-chelating+lipids+in+supported+lipid+bilayers.">Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers.</a> Frontiers in Physiology. 11, 613367 (2020).</li><li>Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+spillover+spreading+for+comparing+instrument+performance+and+aiding+in+multicolor+panel+design.">Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design.</a> Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).</li><li>C&#233;spedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+antigen-presenting+cells+reveal+the+diversity+and+functional+specialisation+of+extracellular+vesicles+composing+the+fourth+signal+of+T+cell+immunological+synapses.">Synthetic antigen-presenting cells reveal the diversity and functional specialisation of extracellular vesicles composing the fourth signal of T cell immunological synapses.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Yoon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+non-activated+lymphocytes+using+three-dimensional+refractive+index+tomography+and+machine+learning.">Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distributions+of+autofluorescence+after+compensation:+Be+panglossian,+fret+not.">Distributions of autofluorescence after compensation: Be panglossian, fret not.</a> Cytometry A. 89 (4), 398-402 (2016).</li><li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+controls,+instrument+setup,+and+the+determination+of+positivity.">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li><li>Balint, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+attack+particles+are+autonomous+killing+entities+released+from+cytotoxic+T+cells.">Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells.</a> Science. 368 (6493), 897-901 (2020).</li><li>Cespedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+expression+of+the+hRSV+nucleoprotein+impairs+immunological+synapse+formation+with+T+cells.">Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).</li></ol>

BSLBs הם כלים רב-תכליתיים לחקר תפוקת החלקיקים של תאי T מגורה עם ממברנות APC מודל. הגמישות של השיטה מאפשרת שחזור של הרכבי ממברנות מורכבים ורדוקציוניסטיים כדי לחקור את ההשפעות של ליגנדים ואת האותות שלהם על הפרשת tSVs וחלקיקי התקפה סופרמולקולרית ורכיביהם. בדקנו טכנולוגיה זו בתאי T שונים, כולל TH, CTL, ?...

הסינפסה החיסונית (IS) היא מבנה מולקולרי מרכזי שנוצר בממשק של תאים העוסקים במגע פיזי המאפשר חילופי מידע מוסדר של juxtracrine. ISs שונים תוארו בספרות, וגוף גדל והולך של ראיות מצביע על כך שרכזות מולקולריות אלה הן תכונה שמורה של רשתות סלולריות. תאי חיסון שונים, כולל תאי B, תאי רוצח טבעיים, תאים דנדריטיים, מקרופאגים ותאי T, מחליפים מידע באמצעות הרכבה של מגעים קצרי מועד1. מחקרים רב-לאומיים מקדמים את ההבנה של תת-קבוצות חדשות של לויקוציטים ותאי סטרומה המניעים רשתות תאיות פתוגניות ומבטאים חלבוני שטח בעלי פונקציות לא ידועות. כמו APCs סינתטיים, BSLBs לאפשר חקירה ישירה של התפקיד התפקודי של חלבונים בודדים בשילוב של הפעלת אותות, כלומר אנטיגנים ו costimulation / corepression, על ידי תאי T ואת שחרור וכתוצאה מכך שחרור של חלקיקים מפעילים המכונה אות ארבע.
מאמר זה מתאר את הפרוטוקולים ואת הנקודות הטכניות הקריטיות שיש לקחת בחשבון בעת שימוש ב- BSLBs כדי לחקות את הרכב פני השטח של APCs מודל. הפרוטוקולים למדידה כמותית של קולטני מערכת החיסון וחלבוני שטח אחרים ב- APCs מוצגים יחד עם הפרוטוקול לשחזור של נגמ"שים סינתטיים המכילים כמויות נמדדות אלה. לאחר מכן, השלבים הנדרשים עבור coculturing תאי T ו- BSLB מוצגים יחד עם הפרוטוקול למדידה הכמותית של העברת חלקיקים טרנס-סינפטית באמצעות cytometry זרימה. למרבה הפלא, BSLBs להקל על לימוד אוכלוסייה שמקורה קרום פלזמה של tSVs המכונה אקטואוזומים סינפטיים (SEs). תאי T-cell antigen מועשרים בקולטן (TCR+) SEs נשפכים בתגובה TCR מפעיל2 ביעילות נתפס על ידי BSLBs3, המייצג קריאה מצוינת כדי להעריך את המאפיינים האגוניסטיים של אנטיגנים ואת הרכב הממברנה מודל. אקסוזומים CD63+ וחלקיקי התקפה סופרמולקולריים (SMAPs) משתחררים גם הם על ידי תאי T מגורים ונלכדים על ידי BSLBs. הם יכולים לשמש כקריאות נוספות של הפעלה והפרשת גרגיר אקסוציטית וליטית וכתוצאה מכך על ידי תאי T. גיוס שלפוחיות אקסוציאטיות לקוטב האינטראקציה של תא T מקל גם על שחרור כיווני של ציטוקינים, כגון IL-2, IFN-γ ו- IL-10 בתגובה להפעלה 4,5,6,7,8. למרות ציטוקינים שוחררו תאי T ניתן לזהות גם על BSLBs, מחקר ייעודי יותר נמצא כעת בפיתוח כדי לאמת את הניתוח הכמותי של שחרור ציטוקינים בסינפסה החיסונית.
כדי לחקור כיצד הרכבי ממברנה ספציפיים משפיעים על התפוקה הסינפטית של תאי T דורש להגדיר את הצפיפות הפיזיולוגית של רכיב קרום היעד. כימות מבוססי ציטומטריה זרימה של חלבונים על פני התא הם צעד חיוני בפרוטוקול זה ודורשים: 1) שימוש בנוגדנים עם מספר ידוע של פלואורוכרום לנוגדן (F/P), ו -2) חרוזי בנצ'מרק המספקים התייחסות סטנדרטית לאינטרפולציה של מולקולות פלואורוכרום מעוצמות פלואורסצנטיות ממוצעות נמדדות (MFIs).
תקני אמת מידה אלה מורכבים מחמש אוכלוסיות חרוזים, שכל אחת מהן מכילה מספר גדל והולך של פלואורכומים מסיסים מקבילים (MESFs), המשתרעים על פני הטווח הדינמי של זיהוי פלואורסצנטיות שרירותי. אוכלוסיות סטנדרטיות אלה מניבות פסגות פלואורסצנטיות נפרדות, ומאפשרות המרה של יחידות פלואורסצנטיות שרירותיות ל- MESFs על ידי רגרסיה ליניארית פשוטה. ה- MESFs המתקבלים משמשים לאחר מכן לצד ערכי F/P נוגדנים כדי לחשב את המספר הממוצע של מולקולות מאוגדות לכל תא (או BSLB בשלבים מאוחרים יותר). היישום של אזורי שטח תא משוערים למספר הממוצע של מולקולות שזוהו ואז מאפשר חישוב של צפיפות פיזיולוגית כמו מולקולות / μm2. פרוטוקול כימות זה יכול להיות מותאם גם למדידת צפיפות החלבון על תאי T ולשיקום הביוכימי של הרכבי הממברנה המתווכים את היווצרות הסינפסות ההומוטיפיות של תאי T (כלומר, סינפסות T-T9). במידת הצורך, ניתן להעריך עוד יותר את הערכיות של כריכת נוגדנים באמצעות מטרות רקומביננטיות המסומנות במספרים ידועים של פלואורוכרומים לכל מולקולה. לאחר מכן, ניתן לחשב את הערכיות המחייבת נוגדנים עבור אותה אוכלוסיית BSLB על ידי השוואת מספר חלבונים פלואורסצנטיים מאוגדים ונוגדני כימות (באמצעות שני פלואורוקרומים כימות שונים ותקני MESF).
השחזור של ממברנות APC דורש הרכבה של bilayers השומנים נתמך (SLBs) על חרוזי סיליקה1. מלאי ליפוזום המכיל מינים שונים של פוספוליפידים ניתן לרתום כדי ליצור מטריצת ליפיד-bilayer רב תכליתית, המאפשרת עיגון של חלבונים רקומביננטיים עם כימיה מחייבת שונה (הכנת ליפוזומים מפורטת ב 10). לאחר הגדרת הצפיפות הפיזיולוגית (או הצפיפות) של הליגנד הרלוונטי "על התאים", אותו פרוטוקול ציטומטריית זרימה מותאם להערכת ריכוז החלבון הרומביננטי הדרוש לציפוי BSLBs בצפיפות הפיזיולוגית של המטרה. ניתן להשתמש בשתי מערכות עיגון שונות בשילוב או בנפרד.
ראשית, SLB המכיל 12.5 mol% סופי של Ni2 + המכיל פוספוליפידים מספיק כדי לספק כ -10,000 אתרי כריכת התג שלו לכל micron10 מרובע ועובד היטב כדי לקשט BSLBs עם רוב החלבונים הזמינים מסחרית אשר צפיפות פיזיולוגית שלהם אינה עולה על קיבולת טעינה מקסימלית זו. מערכת הטעינה השנייה רותמת פוספוליפידים המכילים ביוטין (כמו מול%) לטעינת ביו-טיניל נגד CD3e Fab (או מונומרים HLA/MHC) באמצעות גשרי סטרפטאבידין. השילוב של שתי שיטות קישוט BSLB אלה מאפשר תפירה גמישה של BSLBs כנגמ"שים סינתטיים. עבור קומפוזיציות משטח APC מורכבות מאוד, ניתן להגדיל את המול% של פוספוליפידים וחלבונים כדי לטעון חלבונים רבים ככל שהשאלה בהישג יד דורשת. לאחר ריכוזי העבודה של חלבונים מול% של פוספוליפידים biotinylated מוגדרים, BSLBs ניתן להרכיב כדי לחקור את הפלט הסינפטי של תאי T עם cytometry זרימה multiparametric.

preparation of bead-supported lipid bilayers to study the particulate output of t cell immune synapses

תאים המציגים אנטיגן (נגמ"שים) מציגים שלושה אותות מפעילים לתאי T העוסקים במגע פיזי: 1) אנטיגן, 2) תמחיר / דיכוי ליבה, ו -3) ציטוקינים מסיסים. תאי T משחררים שני סוגים של חלקיקי מפעיל בתגובה להפעלה: שלפוחיות טרנס-סינפטיות (tSVs) וחלקיקי התקפה סופרמולקולריים, המעבירים שליחים בין-תאיים ומתווכים ציטוטוקסיות, בהתאמה. ישויות אלה מופנמות במהירות על ידי נגמ"שים העוסקים במגע פיזי עם תאי T, מה שהופך את האפיון שלהם להרתיע. מאמר זה מציג את הפרוטוקול כדי לפברק ולהשתמש ב-Belayers השומנים הנתמכים על ידי חרוזים (BSLBs) כחיקויים של תאים מציגי אנטיגן (APC) כדי ללכוד ולנתח חלקיקים טרנס-סינפטיים אלה. כמו כן מתוארים הפרוטוקולים למדידות המוחלטות של צפיפות חלבונים על משטחי תאים, שחזור של BSLBs עם רמות פיזיולוגיות כאלה, ואת הליך ציטומטריית הזרימה למעקב אחר שחרור חלקיקים סינפטיים על ידי תאי T. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי ללמוד את ההשפעות של חלבונים בודדים, תערובות ליגנד מורכבות, דטרמיננטים פתוגן virulence, ותרופות על תפוקת האפקט של תאי T, כולל תאי T עוזר, לימפוציטים T ציטוטוקסיים, תאי T רגולטוריים, ותאי T קולטני אנטיגן כימריים מבטאים (CART).

FCM לכימות חלבונים מוחלט על פני התא שחזור של BSLBs המציגים צפיפות פיזיולוגית של ליגנדים דורש הערכה של צפיפות החלבון הכוללת בקבוצת המשנה של התאים המעוצבים. כדי לשקם את ה-BSLBs, כלול כל ליגנד רלוונטי שצפוי למלא תפקיד בציר האיתות של עניין לצד חלבונים התומכים בהידבקות ובאינטראקציה תפקודי...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses at JoVE.com

Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses

כאן אנו מציגים את הפרוטוקול לשחזור צעדים של תאים סינתטיים המציגים אנטיגן באמצעות Bilayers השומנים הנתמכים על ידי חרוזים ואת השימוש בהם כדי לחקור את הפלט הסינפטי מתאי T מופעלים.

הכנת Bilayers השומנים הנתמכים על ידי חרוזים לחקר תפוקת החלקיקים של הסינפסות החיסוניות של תאי T

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) ...

חקר התפוקה של הסינפסה החיסונית הוגבל בעיקר לשיטות מיקרוסקופיות. BSLBs הרחיבו את רפרטואר הכלים שלנו שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את הפלט של סינפסות חיסוניות של תאי T, כולל ציטומטריית זרימה, מיקרוסקופיה, פרוטאומיקה וטכנולוגיות ריצוף RNA. ככזה, ניתן להשתמש ב- BSLBs במגוון רחב של שאלות אימונולוגיות ובזיהוי ההרכב והרגולציה הביוכימית של תפוקת תאי ה- T.זה כולל, למשל, את המחקר של קולטני אנטיגן כימריים, תרופות המעכבות מסלולי איתות ספציפיים, או אבלציה גנטית של גנים מעניינים. אחד ההיבטים הקריטיים ביותר של פרוטוקול זה הוא לייעל את כיול החלבון ואת לוח ציטומטריית הזרימה הצבעוני הנדרש למעקב אחר החלקיק הטרנס-סינפטי של עניין. זה דורש איטרציה שיטתית של ריכוזי חלבון, ריכוזי נוגדנים, והגדרות מכשירים.התחל על ידי דילול מיקרוליטר אחד של תמיסת חרוזים עם 1,000 מיקרוליטרים של PBS. לספור את החרוזים באמצעות תא hemocytometer ולחשב את הריכוז שלהם למיליליטר. לאחר מכן, לחשב את הנפח של חרוזי סיליקה הדרושים עבור 500, 000 BSLBs הסופי לכל נקודת טיטרציה.העבר את הנפח הנדרש של חרוזי סיליקה לצינור מיקרו-צנטריפוגה סטריליטר של 1.5 מיליליטר. לשטוף את חרוזי סיליקה שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS סטרילי וצנטריפוגות החרוזים. הכינו שלושה כרכים של תערובת מאסטר ליפוזום המכילה אחוז סופי של 12.5 מול של פוספוליפידים המכילים ניקל.השתמש בתערובת מאסטר ליפוזום כדי resuspend חרוזי סיליקה שטף. לאחר מכן, ערבבו אותו בעדינות על-ידי צנרת מעלה ומטה של מחצית מהנפח הכולל. באמצעות טכניקה סטרילית, מוסיפים גז ארגון או חנקן לצינור כדי לעקור אוויר ולהגן על השומנים מפני חמצון במהלך ערבוב.הוסף ארגון למניות השומנים 0.4 מילימולרי. לאחסן את המלאי ולתפעל באמצעות טכניקה סטרילית. העבירו את ה-BSLBs למיקסר האנכי וערבבו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות ערבוב מסלולי ב-10 סל"ד.לאחר מכן, לסובב את החרוזים על ידי צנטריפוגה במשך 15 שניות בטמפרטורת החדר על מיני-מרכזי ספסל העליון. חסום את ה- BSLBs שנוצרו על-ידי הוספת מיליליטר אחד של 5% BSA המכיל 100 מיקרומולר של ניקל גופרתי כדי להרוות אתרי NTA ב- BSLBs. לשטוף שלוש פעמים באמצעות מאגר HBS-HSA כדי להסיר את פתרון החסימה העודף.קחו צלחת חדשה של 96 בארות עם תחתית U או V-bottom והכנו דילול סדרתי כפול של החלבונים. תנצל מחדש את ה- BSLBs המוכנים באמצעי אחסון כך ש- 100 מיקרוליטרים של מאגר HBS-HSA יכילו 500, 000 BSLBs. לאחר מכן, קח עוד צלחת U-bottom או V-bottom 96-well ולהעביר 100 מיקרוליטרים של השעיית BSLB לבארות באופן כזה שכל באר מקבלת 500, 000 BSBLs.סובבו את הצלחת השנייה בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות ב-300x G.Discard את הסופר-נרטיב והעבירו נפחים של 100 מיקרוליטרים מלוחית החלבון לצלחת המכילה את ה-BSLBs המשושקעים. השתמש בנייר אלומיניום כדי להגן עליו מפני אור ודגר בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות ב 1, 000 סל"ד.לאחר מכן, לשטוף את הצלחת שלוש פעמים על ידי הוספת מאגר HBS-HSA לצלחת לסובב אותו בטמפרטורת החדר במשך שתי דקות ב 300x G.Count התאים לאחר הכביסה. לאחר מכן, לדלל אותם לריכוז סופי של 2.5 מיליון למיליליטר באמצעות מדיום בדיקת העברה סינפטית. לאחר שה-BSLBs עמוסים בתערובת החלבון, שטפו את ה-BSLBs פעמיים עם מאגר HBS-HSA כדי להסיר את עודפי החלבונים הלא מאוגדים.Resuspend 500, 000 BSLBs לבאר ב 200 מיקרוליטרים של מאגר HBS-HSA. העבר 100 מיקרוליטרים של BSLBs לבאר לצלחת חדשה של 96 בארות תחתון U כדי ליצור שכפול, כך שהכמות הסופית של BSLB לבאר היא 250, 000. לסובב את BSLBs ב 300x G במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר.השלך את supernatant ולאחר מכן resuspend BSLBs באמצעות 100 מיקרוליטרים של השעיית תא T. מערבבים בעדינות כדי למנוע היווצרות של בועות. לדגור על תרבויות משותפות במשך 90 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.הגן על התאים מפני אור וקרר את התרבויות המשותפות על ידי הדגירה הראשונה שלהם בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לפחות. צנטריפוגות תרבויות משותפות בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות ב 500x G.להשליך את supernatant ו resuspend את התרבויות המשותפות בסידן ומגנזיום יון ללא 2% BSA PBS בטמפרטורת החדר לחסימה. מניחים את התאים על קרח במשך 45 דקות ולהגן עליהם מפני אור.הכינו את תערובת הנוגדנים הראשית באמצעות 0.22 מיקרומטר מסונן כקרח מסונן 2%BSA ו- PBS כחוצץ כתמים. תערובת ראשית זו תספק חסימה נוספת. סובב את תרביות המשנה ב 500x G במשך חמש דקות וארבע מעלות צלזיוס.השלך את supernatants, ולאחר מכן להשתמש פיפטה רב ערוצית כדי resuspend התאים בתערובת מאסטר כתמים המכיל ריכוזי נוגדנים ממוטבים. כלול תאים בעלי תווית איזוטיפ ו- BSLBs, BSLBs פלואורסצנטיים ולא פלואורסצנטיים, ותאים ו- BSLBs מוכתמים לבדם. יש לערבב בעדינות על-ידי צנרת מעלה ומטה של חצי מהנפח.דגירה במשך 30 דקות על קרח ולהגן עליהם מפני אור. לשטוף את התאים BSLBs פעמיים באמצעות קר כקרח 2% BSA PBS. סובב אותם ב 500x G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר צנטריפוגה, לבדוק את התרבות המשותפת משקע בתחתית הבארות. לאחר מכן, resuspend את תרבויות co שטף ב 100 microliters של PBS לרכוש מיד. הפעל את קנה המידה של יומן הרישום עבור אור מפוזר בצד ופרמטר זמן הטיסה עבור אורות מפוזרים בצד ובקדימה.רכש תקני MESF, המבטיחים שהאוכלוסיות העמומות והבהירות ביותר ייפלו בטווח הליניארי של המכשיר. לאחר מכן, לרכוש דגימות פיצוי, לחשב פיצוי, ולהחיל את מטריצת הפיצוי לניסוי. השג ושמור לפחות 20,000 תקני MESF כוללים עבור כל ערוץ כימות.הימנע משימוש בנוזל נדן FACS או דומה לחרוזי MESF resuspend, שכן אלה מכילים מלחים ואלכוהול שישמידו את הפלואורוכרומים, מה שיוביל לפסגות פלואורסצנטיות רחבות יותר וטעות גבוהה. לרכישה באמצעות דוגמים בעלי תפוקה גבוהה, הגדר רכישת מכשירים לסטנדרט, הגדר רכישה לדוגמה ל- 80 מיקרוליטרים. קצב זרימה לדוגמה בין שניים לשלושה מיקרוליטרים לשנייה, נפח ערבוב מדגם ב-50 מיקרוליטרים, ערבוב מדגם של 150 מיקרוליטר לשנייה וערבוב לבאר בין שלוש לחמש.להשיג מינימום של 10, 000 BSLBs בודדים לכל מדגם. לבסוף, יצא את קבצי FCS. דוגמה למדידות ציטומטריית זרימה כמותית של ICAM-1 על פני השטח של תאי שקדים B ותאי T עוזר מוצגת כאן.התמונות הייצוגיות מתארות את אסטרטגיית ההצטברות לניתוח תאי CXCR5 B בודדים ותאי T מסייעי זקיקים המבודדים משקדים של פלטין אנושיים. אסטרטגיית גיור רציפה זו מזהה אירועים חיים בודדים בחלון הרכישה הרציף. הכפילים, ביטוי פני התא של ICAM-1 בהשוואה לבקרות FMO ובקרות FMO המסומנות באיזוטיפים רלוונטיים של האוכלוסיות, מוצגים כאן.Gating ומדידה של MFIs מאוכלוסיות MESF סטנדרטיות שונות בהיסטוגרמה המכסה של אוכלוסיות MESF מוצגים כאן. הערכים מייצגים את ממשקי ה- MF עבור כל אחת מחמש אוכלוסיות MESF. רגרסיה ליניארית של MESF מעל cMFI עבור אוכלוסיות MESF מוצגים כאן.השיפוע מחלץ MESF קשור לתאים מנתוני FCM של ICAM-1 על פני השטח של תאי B שקדים ב- TFH. ההמרה לצפיפות מולקולרית מוחלטת באה בעקבות פעולות מתמטיות פשוטות אלה. התמונות הייצוגיות מראות את ניתוח ציטומטריית הזרימה של BSLBs שהוחזר עם צפיפות מוגברת של היסטידינים ICAM-1 12 מונומריים רקומביננטיים.ניתוחי רגרסיה של ריכוז ייחוס ICAM-1 על פני צפיפות נמדדת מוצגים כאן. השיפוע משמש לחישוב ריכוזי היעד של חלבון כדי להשיג את צפיפות התאים. דיאגרמות הזרימה מציגות את השלבים הקריטיים לשיתוף תאי T עם BSLBs, ומשחזרות את קרומי המודל במדידה הבאה של העברת חלקיקים עם ציטומטריית זרימה.אסטרטגיית ההרחבה לזיהוי BSLBs ותאים בודדים בחלון הרכישה הרציף מוצגת כאן. אחד ההיבטים החשובים ביותר של פרוטוקול זה הוא, כדי לשמור על רבייה של התוצאות, בכל פעם שאתה משנה מלאי חלבון או שומנים בדם, אתה צריך לבצע ניתוח כיול חדש. כדי לגלות מולקולות יעילות חדשות המופרשות על ידי תת-קבוצות שונות של תאי T, ניתן לבודד עוד יותר BSLBs על ידי מיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנטיות כפי שהם נתונים לניתוח תמלול ופרוטאומי.עמיתינו באוניברסיטת אוקספורד השתמשו בטכנולוגיה זו כדי לחקור ולהדגים אינטראקציות קולטן-ליגנד חדשות, וגם כדי לחקור את ההשפעות של אבלציות גנטיות על הפלט של הסינפסה החיסונית של תאי T.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

מבחני ביות תחרותי לחקר נדידת גוט-טרופי T Cell

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

מבוא של צרעות טפיליות<em&gt; תסיסנית</em&gt; ואת התגובה החיסונית Antiparasite

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

הדמיה של HIV-1 מעטפה הנגרמת סינפסה Virological והאיתות על bilayers שומנים סינתטי

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

בידוד ובידול של Th17 הנאיביים T מסוג CD4 לימפוציטים

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

השתלה של עור זנב לחקר תגובות תא Allogeneic T מסוג CD4 בעכברים

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

העכבר נאיבי CD4<sup&gt; +</supו&gt; בידוד תא T<em&gt; במבחנה</em&gt; בידול לתוך תת תא T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

שיטות לחקר ליפידים שינויים נויטרופילים ואת הגיבוש העוקב של נויטרופילים תאיים מלכוד

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Retroviral תמרה של Helper T תאים כגישה גנטית לחקר מנגנוני בקרת הבידול והתפקוד שלהם

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

פרוטוקול שלפוחית היניקה לימודים אדם T-cell האחזור תגובות In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...