Name: preparation of bead-supported lipid bilayers to study the particulate output of t cell immune synapses
Uploaded: 2022-04-01T13:30:00
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Siamo grati ai nostri membri del laboratorio e alla comunità del Kennedy Institute of Rheumatology per le discussioni scientifiche costruttive, in particolare il nostro responsabile della struttura di citometria a flusso Jonathan Webber. Questo lavoro è stato finanziato dalla Wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z, dall'ERC Advanced Grant (SYNECT AdG 670930) e dal Kennedy Trust for Rheumatology Research (KTRR) (tutti e tre a MLD). PFCD è stato sostenuto da EMBO Long-Term Fellowship (ALTF 1420-2015, in collaborazione con la Commissione Europea (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) e Marie Sklodowska-Curie Actions) e una Oxford-Bristol Myers Squibb Fellowship.

1. Misurazione delle densità proteiche di superficie cellulare con citometria quantitativa a flusso
<ol><li>Preparare il tampone citometrico a flusso umano filtrato (hFCB) filtrato da 0,22 μm aggiungendo EDTA (a una concentrazione finale di 2 mM) e siero AB umano (a un 10%) finale a soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4 (vedere Tabella 1). Filtrare la soluzione utilizzando un'unità filtrante dei pori da 0,22 μm per rimuovere le impurità sieriche e conservare...

<ol>
	<li>Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+to+reconstitute+immune+cell+signaling.">Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling.</a> FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).</li><li>Choudhuri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+release+of+T-cell-receptor-enriched+microvesicles+at+the+immunological+synapse.">Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological synapse.</a> Nature. 507 (7490), 118-123 (2014).</li><li>Saliba, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+structure+of+synaptic+ectosomes+exporting+antigen+receptor+linked+to+functional+CD40+ligand+from+helper+T+cells.">Composition and structure of synaptic ectosomes exporting antigen receptor linked to functional CD40 ligand from helper T cells.</a> elife. 8, 47528 (2019).</li><li>Barcia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+polarization+of+IFN-gamma+at+Kupfer+and+non-Kupfer+immunological+synapses+during+the+clearance+of+virally+infected+brain+cells.">In vivo polarization of IFN-gamma at Kupfer and non-Kupfer immunological synapses during the clearance of virally infected brain cells.</a> Journal of Immunology. 180 (3), 1344-1352 (2008).</li><li>Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+use+two+directionally+distinct+pathways+for+cytokine+secretion.">T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion.</a> Nature Immunology. 7 (3), 247-255 (2006).</li><li>Kupfer, A., Mosmann, T. R., Kupfer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+expression+of+cytokines+in+cell+conjugates+of+helper+T+cells+and+splenic+B+cells.">Polarized expression of cytokines in cell conjugates of helper T cells and splenic B cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (3), 775-779 (1991).</li><li>Kupfer, H., Monks, C. R., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+splenic+B+cells+that+bind+to+antigen-specific+T+helper+(Th)+cells+and+face+the+site+of+cytokine+production+in+the+Th+cells+selectively+proliferate:+immunofluorescence+microscopic+studies+of+Th-B+antigen-presenting+cell+interactions.">Small splenic B cells that bind to antigen-specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate: immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen-presenting cell interactions.</a> Journal of Experimental Medicine. 179 (5), 1507-1515 (1994).</li><li>Reichert, P., Reinhardt, R. L., Ingulli, E., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+in+vivo+identification+of+TCR+redistribution+and+polarized+IL-2+production+by+naive+CD4+T+cells.">Cutting edge: in vivo identification of TCR redistribution and polarized IL-2 production by naive CD4 T cells.</a> Journal of Immunology. 166 (7), 4278-4281 (2001).</li><li>Gerard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+T+cell-T+cell+synaptic+interactions+drive+the+differentiation+of+protective+CD8++T+cells.">Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8+ T cells.</a> Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).</li><li>Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+planar+bilayers+for+study+of+the+immunological+synapse.">Supported planar bilayers for study of the immunological synapse.</a> Current Protocols in Immunology. , (2007).</li><li>Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2021)</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+compensation+for+flow+cytometry:+visualization+artifacts,+limitations,+and+caveats.">Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats.</a> Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).</li><li>Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+T+cells+is+induced+by+binding+to+nickel-chelating+lipids+in+supported+lipid+bilayers.">Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers.</a> Frontiers in Physiology. 11, 613367 (2020).</li><li>Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+spillover+spreading+for+comparing+instrument+performance+and+aiding+in+multicolor+panel+design.">Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design.</a> Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).</li><li>C&#233;spedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+antigen-presenting+cells+reveal+the+diversity+and+functional+specialisation+of+extracellular+vesicles+composing+the+fourth+signal+of+T+cell+immunological+synapses.">Synthetic antigen-presenting cells reveal the diversity and functional specialisation of extracellular vesicles composing the fourth signal of T cell immunological synapses.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Yoon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+non-activated+lymphocytes+using+three-dimensional+refractive+index+tomography+and+machine+learning.">Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distributions+of+autofluorescence+after+compensation:+Be+panglossian,+fret+not.">Distributions of autofluorescence after compensation: Be panglossian, fret not.</a> Cytometry A. 89 (4), 398-402 (2016).</li><li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+controls,+instrument+setup,+and+the+determination+of+positivity.">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li><li>Balint, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+attack+particles+are+autonomous+killing+entities+released+from+cytotoxic+T+cells.">Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells.</a> Science. 368 (6493), 897-901 (2020).</li><li>Cespedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+expression+of+the+hRSV+nucleoprotein+impairs+immunological+synapse+formation+with+T+cells.">Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).</li></ol>

I BSLB sono strumenti versatili per studiare la produzione di particolato delle cellule T stimolate con membrane APC modello. La flessibilità del metodo consente la ricostituzione di composizioni di membrana complesse e riduzioniste per studiare gli effetti dei ligandi e dei loro segnali sulla secrezione di tSV e particelle di attacco supramolecolare e dei loro componenti. Abbiamo testato questa tecnologia su varie cellule T, tra cui TH, CTL, Tregs e CART15 preattivati. Questo protocollo funziona...

La sinapsi immunologica (IS) è una struttura molecolare cardine formata all'interfaccia di cellule impegnate nel contatto fisico che facilita lo scambio regolato di informazioni juxtracrine. Diversi IS sono stati descritti in letteratura e un numero crescente di prove suggerisce che questi hub molecolari sono una caratteristica conservata delle reti cellulari. Varie cellule immunitarie, tra cui cellule B, cellule natural killer, cellule dendritiche, macrofagi e cellule T, si scambiano informazioni attraverso l'assemblaggio di contatti di breve durata1. Studi multiomici stanno facendo progredire la comprensione di nuovi sottoinsiemi di leucociti e cellule stromali che guidano reti cellulari patogene ed esprimono proteine di superficie con funzioni sconosciute. Come APC sintetici, i BSLB consentono lo studio diretto del ruolo funzionale delle singole proteine nell'integrazione dei segnali attivanti, vale a dire antigeni e costimolazione/corepressione, da parte delle cellule T e il conseguente rilascio di particelle effettrici denominate segnale quattro.
Questo documento descrive i protocolli e i punti tecnici critici da considerare durante l'utilizzo dei BSLB per imitare la composizione superficiale degli APC modello. I protocolli per la misurazione quantitativa dei recettori immunitari e di altre proteine di superficie sulle APC sono presentati insieme al protocollo per la ricostituzione di APC sintetici contenenti queste quantità misurate. Quindi, i passaggi necessari per la coculturazione delle cellule T e BSLB vengono presentati insieme al protocollo per la misurazione quantitativa del trasferimento di particelle trans-sinaptiche utilizzando la citometria a flusso. Più sorprendentemente, i BSLB facilitano lo studio di una popolazione di TSV derivati dalla membrana plasmatica chiamati ectosomi sinaptici (SE). Le SE arricchite con recettore dell'antigene delle cellule T (TCR+) vengono eliminate in risposta all'attivazione del TCR2 e catturate in modo efficiente dai BSLB3, rappresentando un'eccellente lettura per valutare le proprietà agonistiche degli antigeni e la composizione della membrana modellata. Gli esosomi CD63+ e le particelle di attacco supramolecolare (SMAP) vengono anche rilasciati dalle cellule T stimolate e catturati dai BSLB. Possono essere utilizzati come letture aggiuntive dell'attivazione e della conseguente secrezione di granuli esocitici e litici da parte delle cellule T. La mobilizzazione delle vescicole esocitiche al polo interagente della cellula T facilita anche il rilascio direzionale di citochine, come IL-2, IFN-γ e IL-10 in risposta all'attivazione4,5,6,7,8. Sebbene le citochine rilasciate dalle cellule T possano essere rilevate anche sui BSLB, uno studio più dedicato è attualmente in fase di sviluppo per convalidare l'analisi quantitativa del rilascio di citochine nella sinapsi immunologica.
Per interrogarsi su come specifiche composizioni di membrana influenzano l'output sinaptico delle cellule T è necessario definire la densità fisiologica della componente della membrana bersaglio. Le quantificazioni basate sulla citometria a flusso delle proteine di superficie cellulare sono un passo essenziale in questo protocollo e richiedono: 1) l'uso di anticorpi con un numero noto di fluorocromi per anticorpo (F / P) e 2) perline di riferimento che forniscono un riferimento standard per l'interpolazione di molecole di fluorocromo da intensità medie di fluorescenza misurate (MFI).
Questi standard di riferimento sono costituiti da cinque popolazioni di perline, ciascuna contenente un numero crescente di fluorocromi solubili equivalenti (MESF), che coprono la gamma dinamica di rilevamento arbitrario della fluorescenza. Queste popolazioni standard producono picchi di fluorescenza discreti, facilitando la conversione di unità di fluorescenza arbitrarie in MESF mediante semplice regressione lineare. I MESF risultanti vengono quindi utilizzati insieme ai valori degli anticorpi F / P per calcolare il numero medio di molecole legate per cellula (o BSLB nelle fasi successive). L'applicazione di aree di superficie cellulare stimate al numero medio di molecole rilevate consente quindi il calcolo delle densità fisiologiche come molecole/μm2. Questo protocollo di quantificazione può anche essere adattato alla misurazione delle densità proteiche sulle cellule T e alla ricostituzione biochimica delle composizioni di membrana che mediano la formazione di sinapsi omotipiche delle cellule T (cioè le sinapsi T-T9). Se necessario, la valenza del legame anticorpale può essere ulteriormente stimata utilizzando bersagli ricombinanti etichettati con un numero noto di fluorocromi per molecola. Quindi, la valenza legante gli anticorpi può essere calcolata per la stessa popolazione BSLB confrontando contemporaneamente il numero di proteine fluorescenti legate e gli anticorpi di quantificazione (utilizzando due diversi fluorocromi di quantificazione e standard MESF).
La ricostituzione delle membrane APC richiede l'assemblaggio di doppi strati lipidici supportati (SLB) su perle di silice1. Gli stock di liposomi contenenti diverse specie di fosfolipidi possono essere sfruttati per formare una matrice lipidico-bistrato versatile, consentendo l'ancoraggio di proteine ricombinanti con una diversa chimica di legame (la preparazione dei liposomi è dettagliata in 10). Una volta definita la densità fisiologica (o densità) del ligando pertinente "sulle cellule", lo stesso protocollo di citometria a flusso viene adattato per stimare la concentrazione di proteina ricombinante necessaria per rivestire i BSLB con la densità fisiologica target. Due diversi sistemi di ancoraggio possono essere utilizzati in combinazione o separatamente.
In primo luogo, SLB contenente un ultimo 12,5 mol% di fosfolipidi contenenti Ni2+ è sufficiente a fornire circa 10.000 siti di legame His-tag per micron quadrato10 e funziona bene per decorare BSLB con la maggior parte delle proteine disponibili in commercio le cui densità fisiologiche non superano questa capacità di carico massima. Il secondo sistema di carico sfrutta i fosfolipidi contenenti biotina (come mol%) per caricare i biotinilati anti-CD3e Fab (o monomeri HLA / MHC) tramite ponti di streptavidina. La combinazione di questi due metodi di decorazione BSLB consente quindi la personalizzazione flessibile dei BSLB come APC sintetici. Per composizioni superficiali APC altamente complesse, il mol% di fosfolipidi e proteine può essere aumentato per caricare tutte le proteine richieste dalla domanda in questione. Una volta definite le concentrazioni di lavoro delle proteine e il mol% dei fosfolipidi biotinilati, i BSLB possono essere assemblati per interrogare l'output sinaptico delle cellule T con citometria a flusso multiparametrica.

preparation of bead-supported lipid bilayers to study the particulate output of t cell immune synapses

Le cellule che presentano l'antigene (APC) presentano tre segnali attivanti alle cellule T impegnate nel contatto fisico: 1) antigene, 2) costimolazione/corepressione e 3) citochine solubili. Le cellule T rilasciano due tipi di particelle effettrici in risposta all'attivazione: vescicole trans-sinaptiche (tSV) e particelle di attacco supramolecolare, che trasferiscono rispettivamente messaggeri intercellulari e mediano la citotossicità. Queste entità vengono rapidamente interiorizzate da APC impegnate in contatto fisico con le cellule T, rendendo la loro caratterizzazione scoraggiante. Questo documento presenta il protocollo per fabbricare e utilizzare i BSLB lipidici supportati da perline come mimetici delle cellule che presentano l'antigene (APC) per catturare e analizzare queste particelle trans-sinaptiche. Vengono inoltre descritti i protocolli per le misurazioni assolute delle densità proteiche sulle superfici cellulari, la ricostituzione dei BSLB con tali livelli fisiologici e la procedura di citometria a flusso per il monitoraggio del rilascio di particelle sinaptiche da parte delle cellule T. Questo protocollo può essere adattato per studiare gli effetti di singole proteine, miscele di ligandi complessi, determinanti di virulenza patogena e farmaci sulla produzione effettrice delle cellule T, comprese le cellule T helper, i linfociti T citotossici, le cellule T regolatorie e le cellule T che esprimono il recettore dell'antigene chimerico (CART).

FCM per la quantificazione assoluta delle proteine sulla superficie cellulare La ricostituzione di BSLB che presentano densità fisiologiche di ligandi richiede la stima delle densità proteiche totali sul sottoinsieme cellulare modellato. Per ricostituire i BSLB, includere qualsiasi ligando rilevante che si prevede svolga un ruolo nell'asse di segnalazione di interesse insieme alle proteine che supportano l'adesione e l'interazione funzionale tra BSLB e cellule, come ICAM-1 e molecole costimulatorie,...

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Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses

Qui presentiamo il protocollo per la ricostituzione graduale di cellule sintetiche che presentano antigene utilizzando Bead-Supported Lipid Bilayers e il loro uso per interrogare l'output sinaptico dalle cellule T attivate.

Preparazione di doppi strati lipidici supportati da perline per studiare la produzione di particolato delle sinapsi immunitarie delle cellule T

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) ...

Lo studio della produzione della sinapsi immunitaria è stato limitato principalmente a metodi microscopici. I BSLB hanno ampliato il nostro repertorio di strumenti che possono essere utilizzati per studiare l'output delle sinapsi immunitarie delle cellule T, tra cui citometria a flusso, microscopia, proteomica e tecnologie di sequenziamento dell'RNA. Come tale, i BSLB possono essere utilizzati in un'ampia varietà di domande di immunologia e nell'identificazione della composizione e della regolazione biochimica dell'output delle cellule T.Ciò include, ad esempio, lo studio dei recettori dell'antigene chimerico, i farmaci che inibiscono specifiche vie di segnalazione o l'ablazione genetica dei geni di interesse. Uno degli aspetti più critici di questo protocollo è l'ottimizzazione delle calibrazioni proteiche e del pannello di citometria a flusso multicolore necessario per tracciare la particella trans-sinaptica di interesse. Ciò richiede l'iterazione sistematica delle concentrazioni proteiche, delle concentrazioni di anticorpi e delle impostazioni dello strumento.Iniziare diluendo un microlitro di soluzione di perline con 1.000 microlitri di PBS. Conta le perline usando una camera emocitometrica e calcola la loro concentrazione per millilitro. Quindi, calcolare il volume di perline di silice necessarie per 500.000 BSLB finali per punto di titolazione.Trasferire il volume richiesto di perline di silice in un tubo microcentrifuga sterile da 1,5 millilitri. Lavare le perle di silice tre volte con un millilitro di PBS sterile e centrifugare le perline. Preparare tre volumi di mix principale di liposomi contenenti un ultimo 12,5 per cento di talpa di fosfolipidi contenenti nichel.Utilizzare il mix master di liposomi per risospese le perle di silice lavate. Quindi, mescolare delicatamente pipettando su e giù metà del volume totale. Utilizzando una tecnica sterile, aggiungere argon o azoto gassoso al tubo per spostare l'aria e proteggere i lipidi dall'ossidazione durante la miscelazione.Aggiungere argon alle scorte lipidiche 0,4 millimolari. Conservare il brodo e manipolare utilizzando una tecnica sterile. Spostare i BSLB sul mixer verticale e mescolare per 30 minuti a temperatura ambiente utilizzando la miscelazione orbitale a 10 RPM.Quindi, ruotare le perline centrifugando per 15 secondi a temperatura ambiente su una minicentrifuga da banco. Bloccare i BSLB formati aggiungendo un millilitro di BSA al 5% contenente 100 micromolari di solfato di nichel per saturare i siti NTA sui BSLB. Lavare tre volte utilizzando il tampone HBS-HSA per rimuovere la soluzione di blocco in eccesso.Prendi una nuova piastra a 96 pozzetti con fondo a U o A V e prepara due diluizioni seriali delle proteine. Sospendere i BSLB preparati in un volume tale che 100 microlitri di buffer HBS-HSA contengano 500.000 BSLB. Quindi, prendi un'altra piastra a 96 pozzetti con fondo a U o V e trasferisci 100 microlitri della sospensione BSLB ai pozzetti in modo tale che ogni pozzo riceva 500.000 BSBL.Far girare la seconda piastra a temperatura ambiente per due minuti a 300x G.Scartare il surnatante e trasferire volumi di 100 microlitri dalla piastra di titolazione proteica alla piastra contenente i BSLB sedimentati. Mescolare delicatamente, evitando la generazione di bolle in eccesso durante il pipettaggio. Utilizzare un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti a 1.000 RPM.Quindi, lavare la piastra tre volte aggiungendo il tampone HBS-HSA alla piastra e ruotarla a temperatura ambiente per due minuti a 300x G.Contare le celle dopo il lavaggio. Quindi, diluirli a una concentrazione finale di 2,5 milioni per millilitro utilizzando il mezzo di saggio di trasferimento sinaptico. Una volta che i BSLB sono caricati con la miscela proteica, lavare i BSLB due volte con tampone HBS-HSA per rimuovere le proteine non legate in eccesso.Sospendere 500.000 BSLB per pozzetto in 200 microlitri di buffer HBS-HSA. Trasferire 100 microlitri di BSLB per pozzetto a una nuova piastra a 96 pozzetti con fondo a U per creare un duplicato, in modo tale che la quantità finale di BSLB per pozzo sia 250.000. Abbassare i BSLB a 300x G per due minuti a temperatura ambiente.Scartare il surnatante e quindi risospescere i BSLB usando 100 microlitri di sospensione di cellule T. Mescolare delicatamente per evitare la formazione di bolle. Incubare le co-colture per 90 minuti a 37 gradi Celsius.Proteggere le cellule dalla luce e raffreddare le co-colture incubandole prima a temperatura ambiente per un minimo di 15 minuti. Centrifugare le co-colture a temperatura ambiente per cinque minuti a 500x G.Scartare il surnatante e risospese le co-colture in calcio e magnesio 2%BSA PBS senza ioni a temperatura ambiente per il blocco. Mettere le cellule sul ghiaccio per 45 minuti e proteggerle dalla luce.Preparare la miscela principale di anticorpi utilizzando il 2% BSA filtrato a 0,22 micrometri e PBS ghiacciato come tampone di colorazione. Questo mix principale fornirà un blocco extra. Abbassare le co-colture a 500x G per cinque minuti e quattro gradi Celsius.Scartare i supernatanti e quindi utilizzare una pipetta multicanale per risospescere le cellule nella miscela principale di colorazione contenente concentrazioni di anticorpi ottimizzate. Includere cellule marcate con isotipo e BSLB, BSLB fluorescenti e non fluorescenti e cellule e BSLB colorati da soli. Mescolare delicatamente pipettando su e giù metà del volume.Incubare per 30 minuti sul ghiaccio e proteggerli dalla luce. Lavare le cellule e i BSLB due volte usando il 2% BSA PBS ghiacciato. Girali verso il basso a 500x G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Dopo la centrifugazione, controllare la co-coltura sedimentata sul fondo dei pozzi. Quindi, risospendere le co-colture lavate in 100 microlitri di PBS e acquisire immediatamente. Attivare la scala di registro per la luce diffusa lateralmente e il parametro del tempo di volo per le luci sparse laterali e in avanti.Acquisire gli standard MESF, assicurando che sia le popolazioni dim-set che le popolazioni più brillanti rientrino nella gamma lineare dello strumento. Quindi, acquisire campioni di compensazione, calcolare la compensazione e applicare la matrice di compensazione all'esperimento. Acquisire e salvare un minimo di 20.000 standard MESF totali per ciascun canale di quantificazione.Evitare l'uso di liquido guaina FACS o simile alle perle MESF risospese, poiché contengono sali e alcoli che distruggeranno i fluorocromi, portando a picchi di fluorescenza più ampi e ad un elevato errore. Per l'acquisizione utilizzando campionatori ad alta produttività, impostare l'acquisizione dello strumento su Standard, impostare l'acquisizione del campione su 80 microlitri. Portata del campione tra due e tre microlitri al secondo, volume di miscelazione del campione a 50 microlitri, miscelazione del campione di 150 microlitri al secondo e miscelazione per pozzo tra tre e cinque.Acquisire un minimo di 10.000 BSLB singoli per campione. Infine, esporta i file FCS. Un esempio di misurazioni quantitative della citometria a flusso di ICAM-1 sulla superficie delle cellule B tonsillari e delle cellule T helper è mostrato qui.Le immagini rappresentative descrivono la strategia di gating per l'analisi di singole cellule CXCR5 B e cellule T follicolari-helper isolate da tonsille palatine umane. Questa strategia di gating sequenziale identifica i singoli eventi live all'interno della finestra di acquisizione continua. I doppietti, l'espressione della superficie cellulare di ICAM-1 rispetto ai controlli FMO e i controlli FMO etichettati con isotipi rilevanti delle popolazioni, sono mostrati qui.La gating e la misurazione delle IFM di diverse popolazioni MESF standard negli istogrammi sovrapposti delle popolazioni MESF sono mostrate qui. I valori rappresentano le IFM per ciascuna delle cinque popolazioni MESF. La regressione lineare del MESF su cMFI per le popolazioni MESF è presentata qui.La pendenza estrae MESF legato alle cellule dai dati FCM di ICAM-1 sulla superficie delle cellule B tonsillari in TFH. La conversione in densità molecolari assolute segue queste semplici operazioni matematiche. Le immagini rappresentative mostrano l'analisi citometrica a flusso di BSLB ricostituiti con densità aumentate di istidine monomeriche ricombinanti ICAM-1 12.Le analisi di regressione della concentrazione di riferimento ICAM-1 rispetto alla densità misurata sono mostrate qui. La pendenza viene utilizzata per calcolare le concentrazioni target di proteine per raggiungere la densità delle cellule. I diagrammi di flusso mostrano i passaggi critici per la co-coltura di cellule T con BSLB, ricostituendo membrane modello nella successiva misurazione del trasferimento di particelle con citometria a flusso.La strategia di gating per identificare singoli BSLB e celle all'interno della finestra di acquisizione continua è mostrata qui. Uno degli aspetti più importanti di questo protocollo è che, per mantenere la riproducibilità dei risultati, ogni volta che si cambiano le scorte proteiche o lipidiche, è necessario eseguire nuove analisi di calibrazione. Per scoprire nuove molecole efficaci secrete da diversi sottoinsiemi di cellule T, i BSLB possono essere ulteriormente isolati mediante selezione cellulare attivata dalla fluorescenza sottoposte ad analisi trascrittomico e proteomica.I nostri colleghi dell'Università di Oxford hanno utilizzato questa tecnologia per studiare e dimostrare nuove interazioni recettore-ligando e anche per studiare gli effetti delle ablazioni genetiche sulla produzione della sinapsi immunitaria delle cellule T.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

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In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

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Isolamento e differenziazione di Th17 Naïve linfociti T CD4

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A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

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