Name: preparation of bead-supported lipid bilayers to study the particulate output of t cell immune synapses
Uploaded: 2022-04-01T13:30:00
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우리는 건설적인 과학적 토론, 특히 우리의 흐름 세포측정 시설 매니저 조나단 웨버에 대한 우리의 실험실 구성원과 류머티즘 지역 사회의 케네디 연구소에 감사드립니다. 이 작품은 웰컴 트러스트 수석 연구 펠로우십 100262Z/12/Z, ERC 고급 보조금(SYNECT AdG 670930), 유금학 연구를 위한 케네디 트러스트(KTRR) (3대 MLD)에 의해 지원되었습니다. PFCD는 EMBO 장기 펠로우십(ALTF 1420-2015)이 유럽위원회(LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) 및 마리 스클로도우스카-퀴리 액션과 옥스포드 브리스톨 마이어스 스퀴브 펠로우십과 함께 지원되었다.

1. 정량적 유동 세포측정을 사용하여 세포 표면 단백질 밀도 측정
<ol><li>EDTA(최종 2mM 농도)와 인간 AB 혈청(최종 10%)을 첨가하여 0.22 μm 필터링된 인간 유동 세포측정 버퍼(hFCB)를 멸균 인산완충식염수(PBS), pH 7.4( 표 1 참조)를 준비한다. 0.22 μm 모공 필터 유닛을 사용하여 용액을 필터링하여 혈청 불순물을 제거하고 4°C에 보관합니다.</li>
	<li>실온(RT)에서 5분 동안 300 × g</e...

<ol>
	<li>Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+to+reconstitute+immune+cell+signaling.">Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling.</a> FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).</li><li>Choudhuri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+release+of+T-cell-receptor-enriched+microvesicles+at+the+immunological+synapse.">Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological synapse.</a> Nature. 507 (7490), 118-123 (2014).</li><li>Saliba, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+structure+of+synaptic+ectosomes+exporting+antigen+receptor+linked+to+functional+CD40+ligand+from+helper+T+cells.">Composition and structure of synaptic ectosomes exporting antigen receptor linked to functional CD40 ligand from helper T cells.</a> elife. 8, 47528 (2019).</li><li>Barcia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+polarization+of+IFN-gamma+at+Kupfer+and+non-Kupfer+immunological+synapses+during+the+clearance+of+virally+infected+brain+cells.">In vivo polarization of IFN-gamma at Kupfer and non-Kupfer immunological synapses during the clearance of virally infected brain cells.</a> Journal of Immunology. 180 (3), 1344-1352 (2008).</li><li>Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+use+two+directionally+distinct+pathways+for+cytokine+secretion.">T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion.</a> Nature Immunology. 7 (3), 247-255 (2006).</li><li>Kupfer, A., Mosmann, T. R., Kupfer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+expression+of+cytokines+in+cell+conjugates+of+helper+T+cells+and+splenic+B+cells.">Polarized expression of cytokines in cell conjugates of helper T cells and splenic B cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (3), 775-779 (1991).</li><li>Kupfer, H., Monks, C. R., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+splenic+B+cells+that+bind+to+antigen-specific+T+helper+(Th)+cells+and+face+the+site+of+cytokine+production+in+the+Th+cells+selectively+proliferate:+immunofluorescence+microscopic+studies+of+Th-B+antigen-presenting+cell+interactions.">Small splenic B cells that bind to antigen-specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate: immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen-presenting cell interactions.</a> Journal of Experimental Medicine. 179 (5), 1507-1515 (1994).</li><li>Reichert, P., Reinhardt, R. L., Ingulli, E., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+in+vivo+identification+of+TCR+redistribution+and+polarized+IL-2+production+by+naive+CD4+T+cells.">Cutting edge: in vivo identification of TCR redistribution and polarized IL-2 production by naive CD4 T cells.</a> Journal of Immunology. 166 (7), 4278-4281 (2001).</li><li>Gerard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+T+cell-T+cell+synaptic+interactions+drive+the+differentiation+of+protective+CD8++T+cells.">Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8+ T cells.</a> Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).</li><li>Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+planar+bilayers+for+study+of+the+immunological+synapse.">Supported planar bilayers for study of the immunological synapse.</a> Current Protocols in Immunology. , (2007).</li><li>Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2021)</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+compensation+for+flow+cytometry:+visualization+artifacts,+limitations,+and+caveats.">Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats.</a> Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).</li><li>Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+T+cells+is+induced+by+binding+to+nickel-chelating+lipids+in+supported+lipid+bilayers.">Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers.</a> Frontiers in Physiology. 11, 613367 (2020).</li><li>Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+spillover+spreading+for+comparing+instrument+performance+and+aiding+in+multicolor+panel+design.">Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design.</a> Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).</li><li>C&#233;spedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+antigen-presenting+cells+reveal+the+diversity+and+functional+specialisation+of+extracellular+vesicles+composing+the+fourth+signal+of+T+cell+immunological+synapses.">Synthetic antigen-presenting cells reveal the diversity and functional specialisation of extracellular vesicles composing the fourth signal of T cell immunological synapses.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Yoon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+non-activated+lymphocytes+using+three-dimensional+refractive+index+tomography+and+machine+learning.">Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distributions+of+autofluorescence+after+compensation:+Be+panglossian,+fret+not.">Distributions of autofluorescence after compensation: Be panglossian, fret not.</a> Cytometry A. 89 (4), 398-402 (2016).</li><li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+controls,+instrument+setup,+and+the+determination+of+positivity.">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li><li>Balint, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+attack+particles+are+autonomous+killing+entities+released+from+cytotoxic+T+cells.">Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells.</a> Science. 368 (6493), 897-901 (2020).</li><li>Cespedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+expression+of+the+hRSV+nucleoprotein+impairs+immunological+synapse+formation+with+T+cells.">Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).</li></ol>

BSLB는 모델 APC 멤브레인으로 자극된 T 세포의 미립자 출력을 연구하기 위한 다목적 도구입니다. 이 방법의 유연성은 복잡하고 환량주의 막 조성물의 재구성을 통해 리간드의 효과와 그 신호가 tSV 및 수분자 공격 입자 및 그 구성요소의 분비에 미치는 영향을 연구할 수 있게 합니다. 우리는 사전 활성화 TH, CTL, Tregs 및 CART15를 포함하여 다양한 T 세포에 이 기술을 시험했습니다. 이 ?...

면역학적 시냅스(IS)는 병트라크 정보의 조절된 교환을 용이하게 하는 물리적 접촉에 종사하는 세포의 인터페이스에서 형성된 중추적인 분자 구조이다. 다른 IS는 문헌에 기술되었습니다, 증거의 성장 몸은 이 분자 허브가 세포 네트워크의 보존 된 기능임을 시사한다. B 세포, 자연 킬러 세포, 수지상 세포, 대식세포 및 T 세포를 포함한 다양한 면역 세포는 단명 한 접촉1의 조립을 통해 정보를 교환합니다. 다세포 연구는 병원성 세포 네트워크를 운전하고 알 수없는 기능을 가진 표면 단백질을 표현하는 백혈구와 기질 세포의 새로운 하위 집합에 대한 이해를 발전시키고 있습니다. 합성 APC로서, BSLB는 신호, 즉 항원 및 비용 절전/코어 프레스의 통합에서 개별 단백질의 기능적 역할에 대한 직접적인 조사를 허용하고, T 세포및 신호 4라고 하는 이펙터 입자의 결과 방출을 허용한다.
이 문서에서는 BSLB를 사용하여 모델 APC의 표면 구성을 모방하는 동안 고려해야 할 프로토콜 및 중요한 기술 포인트를 설명합니다. APC에 면역 수용체 및 기타 표면 단백질의 정량적 측정을 위한 프로토콜은 이러한 측정된 양을 포함하는 합성 APC의 재구성을 위한 프로토콜과 함께 제시된다. 이어서, T 세포와 BSLB를 응모하는 데 필요한 단계는 유동 세포측정법을 사용하여 트랜스 시냅스 입자 전달의 정량적 측정을 위한 프로토콜과 함께 제시된다. 가장 놀랍게도, BSLBs는 시냅스 ectosomes (SEs)라고 불리는 tSV의 플라즈마 막 유래 인구를 연구하는 것을 용이하게합니다. T 세포 항원 수용체 농축(TCR+) SEs는 TCR 트리거ing2에 반응하여 창고되고 BSLBs3에 의해 효율적으로 포획되며, 이는 항원 및 모델링된 멤브레인 조성물의 작용특성을 평가하기 위한 우수한 판독을 나타낸다. CD63+ 엑소좀 및 수퍼분자 공격 입자(SMAP)는 또한 자극된 T 세포에 의해 방출되고 BSLBs에 의해 포획된다. 그(것)들은 T 세포에 의하여 활성화 및 결과 엑소세포 및 lytic 과립 분비의 추가 판독으로 이용될 수 있습니다. T 세포의 상호작용극에 외세포 소포의 동원은 또한 활성화에 대한 응답으로 IL-2, IFN-γ 및 IL-10과 같은 사이토카인의 방향 방출을 용이하게 한다4,5,6,7,8. T 세포 방출 된 사이토카인은 또한 BSLBs에서 검출될 수 있더라도, 면역학적 시냅스에서 사이토카인 방출의 정량적 분석을 검증하기 위하여 더 헌신적인 연구 결과는 현재 개발되고 있습니다.
특정 멤브레인 조성이 T 세포의 시냅스 출력에 미치는 영향을 심문하려면 표적 멤브레인 성분의 생리적 밀도를 정의해야 합니다. 세포 표면 단백질의 유동 세포측정 기반 정량화는 이 프로토콜에서 필수적인 단계이며, 항체당 불소크롬의 알려진 수(F/P) 및 2) 벤치마크 비드의 사용은 측정된 평균 형광 성소 인텐션(MFIs)에서 형광 분자를 보간하는 표준 기준을 제공한다.
이러한 벤치마크 표준은 5개의 구슬 모집단으로 구성되며, 각각 임의형 광채 검출의 동적 범위에 걸쳐 있는 동등한 용해성 형광(MESFs)의 수가 증가하고 있습니다. 이러한 표준 인구는 간단한 선형 회귀에 의해 임의형형 단위를 MESF로 변환하는 것을 용이하게 하는 이산 형광 피크를 산출합니다. 결과 MESFs는 그 때 세포 당 결합된 분자의 평균 수를 계산하기 위하여 항체 F/P 값과 함께 이용됩니다 (또는 나중에 단계에서 BSLB). 검출된 분자의 평균 수에 추정된 세포 표면 영역의 응용은 분자/μm2로 생리적 밀도의 계산을 가능하게 합니다. 이러한 정량화 프로토콜은 또한 T 세포에 대한 단백질 밀도 의 측정및 동종성 T 세포 시냅스의 형성을 중재하는 막 조성물의 생화학적 재구성(즉, T-T 시냅스9)에 적응될 수 있다. 필요한 경우, 항체 결합의 valency는 분자 당 불소크롬의 알려진 숫자로 표지된 재조합 표적을 사용하여 더 추정될 수 있습니다. 이어서, 항체 결합 발렛은 결합형 형광 단백질및 정량화 항체의 수를 동시에 비교하여 동일한 BSLB 집단에 대해 계산될 수 있다(2개의 상이한 정량화 형광 및 MESF 표준을 사용).
APC 멤브레인의 재구성은 실리카 구슬1에 지원되는 지질 양층(SLBs)의 조립이 필요합니다. 상이한 인지질종을 함유하는 리포솜 스톡은 다재다능한 지질 이중층 매트릭스를 형성하기 위해 활용될 수 있으며, 상이한 결합 화학을 이용한 재조합 단백질의 고정을 가능하게 한다(리포솜의 제조는 10에서 상세하다). 관련 리간드의 생리밀도(또는 밀도)가 정의되면, 동일한 유동 세포측정 프로토콜은 표적 생리밀도로 BSLB를 코팅하는 데 필요한 재조합 단백질의 농도를 추정하도록 조정된다. 두 개의 서로 다른 앵커링 시스템을 조합하거나 별도로 사용할 수 있습니다.
첫째, Ni2+함유 인지질의 최종 12.5 mol%를 함유하는 SLB는 평방 마이크로란10 당 약 10,000개의 그의 태그 결합 부위를 제공하기에 충분하며, 생리학적 밀도가 최대 적재 용량을 초과하지 않는 대부분의 상업적으로 이용 가능한 단백질로 BSLB를 장식하는 데 효과적입니다. 두 번째 로딩 시스템은 스테렙타비딘 다리를 통해 바이오티닝 방지 CD3e Fab(또는 HLA/MHC 모노머)을 적재하기 위해 비오틴 함유 인지질(mol%)을 이용합니다. 이러한 두 가지 BSLB 장식 방법의 조합은 합성 APC로 BSLBs의 유연한 테일러링을 가능하게합니다. 매우 복잡한 APC 표면 조성물의 경우, 인지질및 단백질의 몰%는 당면한 질문만큼 많은 단백질을 적재하도록 증가시킬 수 있다. 단백질의 작동 농도와 바이오타이니지의 몰%가 정의되면, BSLB는 다중 파라메트릭 유동 세포측정을 사용하여 T 세포의 시냅스 출력을 심문하기 위해 조립될 수 있다.

preparation of bead-supported lipid bilayers to study the particulate output of t cell immune synapses

항원 제시 세포(APC)는 물리적 접촉에 종사하는 T 세포에 3개의 활성화 신호를 제시한다: 1) 항원, 2) 비용 절임/코어프레스, 및 3) 수용성 사이토카인. T 세포는 활성화에 응하여 이펙터 입자의 2종류를 방출합니다: 세포간 메신저와 중화 세포 독성을 각각 전송하는 트랜스 시냅스 소포(tSV) 및 수근 분자 공격 입자. 이러한 엔터티는 T 셀과의 물리적 접촉에 종사하는 APC에 의해 빠르게 내면화되어 특성화가 어려워집니다. 이 논문은 비드 지원 지질 양층(BSLBs)을 항원 제시 세포(APC) 모방으로 제조하고 사용하여 이러한 시냅스 입자를 포착하고 분석하는 프로토콜을 제시합니다. 또한 세포 표면에 단백질 밀도의 절대 측정을 위한 프로토콜, 그러한 생리적 수준으로 BSLB의 재구성, T 세포에 의한 시냅스 입자 방출을 추적하기 위한 유동 세포측정 절차 등이 설명되어 있다. 이 프로토콜은 개별 단백질, 복잡한 리간드 혼합물, 병원균 결정제 및 약물의 효과를 조력자 T 세포, 세포 독성 T 림프구, 규제 T 세포 및 키메라 항원 수용체 발현 T 세포(CART)를 포함한 T 세포의 이펙터 출력에 대한 효과를 연구하도록 조정할 수 있다.

세포 표면에 절대 단백질 정량화를 위한 FCM 리간드의 생리밀도를 제시하는 BSLBs의 재구성은 모델링된 세포 하위 집합에 대한 총 단백질 밀도의 추정을 요구한다. BSLB를 재구성하기 위해, ICAM-1 및 비용 류 분자와 같은 BSLB 와 세포 사이의 접착 및 기능적 상호 작용을 지원하는 단백질과 함께 관심의 신호 축에서 역할을 할 것으로 예상되는 관련 리간드(CD80 및 CD86)를 포함한다. 추가 단?...

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Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses

여기에서 우리는 비드 지원 지질 Bilayers를 사용하여 합성 항원 제시 세포의 단계별 재구성을 위한 프로토콜을 제시하고 활성화된 T 세포에서 시냅스 출력을 심문하는 그들의 사용.

T 세포 면역 시냅스의 미립자 출력을 연구하기 위해 비드 지원 지질 이중층의 준비

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) ...

면역 시 냅 스의 출력의 연구 는 현미경 방법으로 주로 제한 되었습니다. BSLB는 유동 세포측정, 현미경 검사법, 프로테오믹스 및 RNA 염기서열 분석 기술을 포함하여 T 세포 면역 시냅스의 출력을 연구하는 데 사용할 수 있는 공구의 레퍼토리를 확장했습니다. 이와 같이, BSLB는 다양한 면역학 질문에서 사용할 수 있으며 T 세포 출력의 조성 및 생화학적 조절을 식별할 수 있다.이것은, 예를 들면, 키메라 항원 수용체의 연구 결과, 특정 신호 통로를 억제하는 약, 또는 관심있는 유전자의 유전 절제를 포함합니다. 이 프로토콜의 가장 중요한 측면 중 하나는 관심있는 시냅스 입자를 추적하는 데 필요한 단백질 교정 및 다색 흐름 세포 측정 패널을 최적화하는 것입니다. 이를 위해서는 단백질 농도, 항체 농도 및 기기 설정의 체계적인 반복이 필요합니다.PBS의 1, 000 마이크로리터와 비드 용액의 마이크로리터 1개를 희석하는 것으로 시작합니다. 혈전계 챔버를 사용하여 구슬을 계산하고 밀리리터당 농도를 계산합니다. 그런 다음 적정 점당 500, 000 최종 BSLB에 필요한 실리카 구슬의 양을 계산합니다.실리카 구슬의 필요한 부피를 멸균 1.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브로 이송합니다. 실리카 구슬을 멸균 PBS 1밀리리터로 세 번 씻고 구슬을 원심분리합니다. 니켈 함유 인지질의 최종 12.5 두더지 퍼센트를 포함하는 3권의 리포솜 마스터 믹스를 준비합니다.리포솜 마스터 믹스를 사용하여 세척된 실리카 구슬을 재보습합니다. 그런 다음 총 볼륨의 절반을 위아래로 파이프로 부드럽게 섞습니다. 멸균 기술을 사용하여, 공기를 대체하고 혼합하는 동안 산화로부터 지질을 보호하기 위해 튜브에 아르곤 또는 질소 가스를 추가합니다.0.4 밀리머 지질 주식에 아르곤을 추가합니다. 스톡을 보관하고 멸균 기술을 사용하여 조작하십시오. BSLB를 수직 믹서로 이동하고 10 RPM에서 궤도 혼합을 사용하여 실온에서 30 분 동안 혼합하십시오.그런 다음 벤치 탑 미니 원심 분리기에서 실온에서 15 초 동안 원심 분리하여 구슬을 회전시합니다. BSLB의 NTA 부위를 포화시키는 니켈 황산염 100 마이크로몰라를 포함하는 5%BSA의 밀리리터 1밀리리터를 첨가하여 형성된 BSLB를 차단합니다.새로운 U-바닥 또는 V-바닥 96-well 플레이트를 가지고 단백질의 두 배 연속 희석을 준비합니다. HBS-HSA 버퍼의 100 마이크로리터가 500, 000 BSLB를 함유할 수 있도록 준비된 BSLB를 부피로 재보선한다. 그런 다음, 다른 U-바닥 또는 V-바닥 96-웰 플레이트를 가지고 각각 잘 500, 000 BSBLs를 수신하는 방식으로 BSLB 서스펜션의 100 마이크로 리터를 우물로 전송합니다.300x G.에서 2분 동안 실온에서 두 번째 플레이트를 스핀다운하고 단백질 적정판에서 퇴적BSLB를 함유한 플레이트로 100마이크로리터 부피를 전달합니다. 알루미늄 호일을 사용하여 1, 000 RPM에서 30 분 동안 실온에서 가볍고 배양하십시오.이어서, 플레이트에 HBS-HSA 버퍼를 추가하여 플레이트를 세 번 세척하고 세탁 후 세포를 300x G.Count에서 2분 동안 실온에서 아래로 회전시한다. 그런 다음 시냅스 전달 분석 매체를 사용하여 밀리리터 당 250만 의 최종 농도로 희석합니다. BSLB가 단백질 믹스로 로드되면 HBS-HSA 버퍼로 BSLB를 두 번 세척하여 과도한 결합되지 않은 단백질을 제거하십시오.HBS-HSA 버퍼 200 마이크로리터에서 500, 000 BSLB를 재중단합니다. 100 마이크로리터의 BSLB를 새로운 U-bottom 96-well 플레이트로 전송하여 복제할 수 있으며, 따라서 우물당 BSLB의 최종 양은 250, 000입니다. 실온에서 2분 동안 300x G에서 BSLB를 회전시보시면 됩니다.상체를 폐기한 다음 T 셀 서스펜션의 100 마이크로리터를 사용하여 BSLB를 다시 중단합니다. 거품의 형성을 방지하기 위해 부드럽게 혼합. 섭씨 37도에서 90분 동안 공동 문화를 배양합니다.빛으로부터 세포를 보호하고 최소 15 분 동안 실온에서 먼저 배양하여 공동 배양을 식힙니다. 원심분리는 500x G.에서 5분 동안 실온에서 공동 배양을 제거하고 칼슘과 마그네슘 이온이 없는 2% BSA PBS의 공동 배양을 차단용실온에서 재보선다. 세포를 얼음 위에 45분 간 놓고 빛으로부터 보호합니다.얼음-차가운 0.22 마이크로미터-여과 2%BSA 및 PBS를 염색 버퍼로 사용하여 항체 마스터 믹스를 준비한다. 이 마스터 믹스는 추가 차단을 제공합니다. 500x G에서 5분, 섭씨 4도로 공동 배양을 회전시다.수퍼나티를 폐기한 다음 다중 채널 파이펫을 사용하여 최적화된 항체 농도를 포함하는 염색 마스터 믹스에서 세포를 재일시 중단합니다. 동형 표지 된 세포와 BSLBs, 형광 및 비 형광 BSLBs, 세포 및 BSLB단독으로 염색 포함. 볼륨의 위쪽과 아래쪽을 피펫하여 부드럽게 섞습니다.얼음에 30 분 동안 배양하고 빛으로부터 보호하십시오. 얼음 차가운 2 % BSA PBS를 사용하여 셀과 BSLB를 두 번 세척하십시오. 섭씨 4도에서 5분간 500x G로 회전합니다.원심분리 후 우물 바닥에 퇴적한 공동 배양을 확인하십시오. 그런 다음, PBS의 100 마이크로 리터에서 세척 된 공동 배양을 다시 중단하고 즉시 취득합니다. 측면 산란 된 라이트와 측면 및 전방 분산 조명에 대한 비행 시간 매개 변수에 대한 로그 스케일을 활성화합니다.MESF 표준을 획득하여 딤세트와 가장 밝은 개체수가 계측기의 선형 범위에 속하도록 보장합니다. 그런 다음 보상 샘플을 획득하고 보상을 계산하고 보상 매트릭스를 실험에 적용합니다. 각 정량화 채널에 대해 최소 20, 000개의 총 MESF 표준을 획득하고 저장합니다.이러한 더 넓은 형광 피크와 높은 오류로 이어지는, 불소 크롬을 파괴 하는 소금과 알코올을 포함 하 여 MESF 구슬을 다시 중단 하기 위해 FACS 칼집 또는 이와 유사한 사용 하지 마십시오. 고처리량 샘플러를 사용하여 획득하기 위해 기기 를 표준으로 설정하고 샘플 수집을 80 마이크로리터로 설정합니다. 초당 2~3마이크로리터 사이의 샘플 유량, 50마이크로리터의 샘플 혼합 볼륨, 초당 150마이크로리터의 샘플 혼합, 3~5회 사이웰당 혼합.샘플당 최소 10, 000개의 단일 BSLB를 획득합니다. 마지막으로 FCS 파일을 내보냅니다. 편도선 B 세포 및 도우미 T 세포의 표면에 ICAM-1의 정량적 유량 세포 측정측정의 예가 여기에 나와 있다.대표적인 이미지는 인간 팔라틴 편도선으로부터 분리된 단일 CXCR5 B 세포 및 여포 도우미 T 세포를 분석하기 위한 게이팅 전략을 설명합니다. 이 순차 적 게이팅 전략은 연속 수집 창 내에서 단일 라이브 이벤트를 식별합니다. 이중, FMO 컨트롤 및 인구의 관련 등류형으로 표지된 FMO 컨트롤에 비해 ICAM-1의 세포 표면 발현이 여기에 나와 있다.MESF 인구의 오버레이 히스토그램에 있는 다른 표준 MESF 인구에서 MF의 게이팅 및 측정은 여기에서 표시됩니다. 값은 5개의 MESF 모집단 각각에 대한 M파이를 나타냅니다. MESF 인구에 대한 cMFI를 통해 MESF의 선형 회귀가 여기에 제시됩니다.경사는 TFH에서 편도선 B 세포의 표면에 ICAM-1의 FCM 데이터에서 셀에 결합 된 MESF를 추출합니다. 절대 분자 밀도로의 변환은 이러한 간단한 수학적 작업을 따릅니다. 대표적인 이미지는 재조합 단황 ICAM-1 12 히스티딘의 밀도증가로 재구성된 BSLB의 유동 세포분석분석을 보여준다.측정된 밀도에 대한 ICAM-1 기준 농도의 회귀 분석은 여기에 나와 있다. 경사는 세포의 밀도를 달성하기 위해 단백질의 목표 농도를 계산하는 데 사용됩니다. 흐름 다이어그램은 BSLB와 T 세포를 공동 배양하기 위한 중요한 단계를 보여 주며, 흐름 세포측정을 사용하여 입자 전달의 후속 측정에서 모델 멤브레인을 재구성합니다.연속 획득 창 내에서 단일 BSLB 및 셀을 식별하는 게이팅 전략이 여기에 표시됩니다. 이 프로토콜의 가장 중요한 측면 중 하나는 결과의 재현성을 유지하기 위해 단백질 이나 지질 주식을 변경할 때마다 새로운 교정 분석을 수행해야한다는 것입니다. 다른 T 세포 서브셋에 의해 분비되는 새로운 효과적인 분자를 발견하기 위해, BSLB는 전사 및 프로테오믹 분석을 실시하는 바와 같이 형광 활성화 세포 분류에 의해 더 격리될 수 있다.옥스포드 대학 내의 우리의 동료는 연구하고 새로운 수용체 리간드 상호 작용을 입증하기 위해이 기술을 사용하고, 또한 T 세포 면역 시냅스의 출력에 유전 적 절제의 효과를 연구하기 위해.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

굿 - 트로픽 T 세포의 마이 그 레이션을 공부 경쟁력 호밍 Assays

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

연구

면역학 및 감염병학

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

의 기생충 말벌에 대한 소개<em&gt; Drosophila</em&gt; 그리고 Antiparasite 면역 반응

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

의 이미징 HIV-1 봉투 유발 Virological 시냅스와 합성 지질 Bilayers에 신호

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

분리 및 나이브 CD4 T 림프구의 TH17 분화

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

마우스에 동종 CD4 T 세포 반응을 연구하기 위해 테일 피부 이식

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

마우스 나이브 CD4<sup&gt; +</sup&gt; T 세포의 분리 및<em&gt; 시험관</em&gt; T 세포 하위 집합으로 차별화

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

방법은 지질 호중구의 변경 및 호중구 세포 외 트랩의 후속 형성을 연구하기 위해

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

공부하는 유전 적 접근으로 헬퍼 T 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 메커니즘 자신의 차별화 및 기능 제어

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

인간 T 세포 회수 응답에서 Vivo에서 공부 하는 흡입 물집 프로토콜

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...