Name: preparation of bead-supported lipid bilayers to study the particulate output of t cell immune synapses
Uploaded: 2022-04-01T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses at JoVE.com

Vi er takknemlige til våre laboratoriemedlemmer og Kennedy Institute of Rheumatology samfunnet for konstruktive vitenskapelige diskusjoner, spesielt vår flyt cytometri anlegget leder Jonathan Webber. Dette arbeidet ble finansiert av Wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z, ERC Advanced Grant (SYNECT AdG 670930) og Kennedy Trust for Rheumatology Research (KTRR) (alle tre til MLD). PFCD ble støttet av EMBO Long-Term Fellowship (ALTF 1420-2015, i forbindelse med Europakommisjonen (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) og Marie Sklodowska-Curie Actions) og et Oxford-Bristol Myers Squibb Fellowship.

1. Måling av celleoverflateproteintetthet med kvantitativ strømningscytometri
<ol><li>Forbered 0,22 μm-filtrert human strømningscytometribuffer (hFCB) ved å tilsette EDTA (til en endelig 2 mM konsentrasjon) og humant AB-serum (til en endelig 10%) til steril fosfatbufret saltvann (PBS), pH 7,4 (se tabell 1). Filtrer oppløsningen ved hjelp av en 0,22 μm pore filterenhet for å fjerne serum urenheter og lagre ved 4 °C.</li>
	<li>Gjenopprett cellene og sedimenter dem ved sentrifuge...

<ol>
	<li>Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+to+reconstitute+immune+cell+signaling.">Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling.</a> FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).</li><li>Choudhuri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+release+of+T-cell-receptor-enriched+microvesicles+at+the+immunological+synapse.">Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological synapse.</a> Nature. 507 (7490), 118-123 (2014).</li><li>Saliba, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+structure+of+synaptic+ectosomes+exporting+antigen+receptor+linked+to+functional+CD40+ligand+from+helper+T+cells.">Composition and structure of synaptic ectosomes exporting antigen receptor linked to functional CD40 ligand from helper T cells.</a> elife. 8, 47528 (2019).</li><li>Barcia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+polarization+of+IFN-gamma+at+Kupfer+and+non-Kupfer+immunological+synapses+during+the+clearance+of+virally+infected+brain+cells.">In vivo polarization of IFN-gamma at Kupfer and non-Kupfer immunological synapses during the clearance of virally infected brain cells.</a> Journal of Immunology. 180 (3), 1344-1352 (2008).</li><li>Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+use+two+directionally+distinct+pathways+for+cytokine+secretion.">T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion.</a> Nature Immunology. 7 (3), 247-255 (2006).</li><li>Kupfer, A., Mosmann, T. R., Kupfer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+expression+of+cytokines+in+cell+conjugates+of+helper+T+cells+and+splenic+B+cells.">Polarized expression of cytokines in cell conjugates of helper T cells and splenic B cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (3), 775-779 (1991).</li><li>Kupfer, H., Monks, C. R., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+splenic+B+cells+that+bind+to+antigen-specific+T+helper+(Th)+cells+and+face+the+site+of+cytokine+production+in+the+Th+cells+selectively+proliferate:+immunofluorescence+microscopic+studies+of+Th-B+antigen-presenting+cell+interactions.">Small splenic B cells that bind to antigen-specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate: immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen-presenting cell interactions.</a> Journal of Experimental Medicine. 179 (5), 1507-1515 (1994).</li><li>Reichert, P., Reinhardt, R. L., Ingulli, E., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+in+vivo+identification+of+TCR+redistribution+and+polarized+IL-2+production+by+naive+CD4+T+cells.">Cutting edge: in vivo identification of TCR redistribution and polarized IL-2 production by naive CD4 T cells.</a> Journal of Immunology. 166 (7), 4278-4281 (2001).</li><li>Gerard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+T+cell-T+cell+synaptic+interactions+drive+the+differentiation+of+protective+CD8++T+cells.">Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8+ T cells.</a> Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).</li><li>Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+planar+bilayers+for+study+of+the+immunological+synapse.">Supported planar bilayers for study of the immunological synapse.</a> Current Protocols in Immunology. , (2007).</li><li>Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2021)</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+compensation+for+flow+cytometry:+visualization+artifacts,+limitations,+and+caveats.">Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats.</a> Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).</li><li>Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+T+cells+is+induced+by+binding+to+nickel-chelating+lipids+in+supported+lipid+bilayers.">Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers.</a> Frontiers in Physiology. 11, 613367 (2020).</li><li>Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+spillover+spreading+for+comparing+instrument+performance+and+aiding+in+multicolor+panel+design.">Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design.</a> Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).</li><li>C&#233;spedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+antigen-presenting+cells+reveal+the+diversity+and+functional+specialisation+of+extracellular+vesicles+composing+the+fourth+signal+of+T+cell+immunological+synapses.">Synthetic antigen-presenting cells reveal the diversity and functional specialisation of extracellular vesicles composing the fourth signal of T cell immunological synapses.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Yoon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+non-activated+lymphocytes+using+three-dimensional+refractive+index+tomography+and+machine+learning.">Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distributions+of+autofluorescence+after+compensation:+Be+panglossian,+fret+not.">Distributions of autofluorescence after compensation: Be panglossian, fret not.</a> Cytometry A. 89 (4), 398-402 (2016).</li><li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+controls,+instrument+setup,+and+the+determination+of+positivity.">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li><li>Balint, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+attack+particles+are+autonomous+killing+entities+released+from+cytotoxic+T+cells.">Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells.</a> Science. 368 (6493), 897-901 (2020).</li><li>Cespedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+expression+of+the+hRSV+nucleoprotein+impairs+immunological+synapse+formation+with+T+cells.">Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).</li></ol>

BSLD-er er allsidige verktøy for å studere partikkelutgangen til T-celler stimulert med modell APC-membraner. Fleksibiliteten til metoden gjør det mulig for rekonstituering av komplekse og reduksjonistiske membransammensetninger å studere effekten av ligander og deres signaler på sekresjon av TSVer og supramolekulære angrepspartikler og deres komponenter. Vi har testet denne teknologien på forskjellige T-celler, inkludert forhåndsaktivert TH, CTL, Tregs og CART15. Denne protokollen fungere...

Den immunologiske synapsen (IS) er en pivotal molekylær struktur dannet ved grensesnittet av celler engasjert i fysisk kontakt som letter regulert utveksling av jukstracrininformasjon. Ulike ISer har blitt beskrevet i litteraturen, og en voksende mengde bevis tyder på at disse molekylære knutepunktene er et bevart trekk ved mobilnettverk. Ulike immunceller, inkludert B-celler, naturlige morderceller, dendrittiske celler, makrofager og T-celler, utveksler informasjon via montering av kortvarige kontakter1. Multiomiske studier fremmer forståelsen av nye undergrupper av leukocytter og stromale celler som driver patogene cellulære nettverk og uttrykker overflateproteiner med ukjente funksjoner. Som syntetiske APC-er tillater BSLD-er direkte undersøkelse av enkeltproteinenes funksjonelle rolle i integreringen av aktiveringssignaler, nemlig antigener og kostimulering /kjernetrykk, av T-celler og den resulterende frigjøringen av effektorpartikler referert til som signal fire.
Dette dokumentet beskriver protokollene og kritiske tekniske punkter du bør vurdere når du bruker BSLD-er til å etterligne overflatesammensetningen til modell-APCer. Protokollene for kvantitativ måling av immunreseptorer og andre overflateproteiner på APC-er presenteres sammen med protokollen for rekonstituering av syntetiske APC-er som inneholder disse målte mengdene. Deretter presenteres trinnene som kreves for kokulturerende T-celler og BSLB sammen med protokollen for kvantitativ måling av transsynaptisk partikkeloverføring ved hjelp av strømningscytometri. Mest bemerkelsesverdig er BSLD-er lette å studere en plasmamembran-avledet populasjon av TV-er kalt synaptiske ektosomer (SE). T-celle antigenreseptorberiket (TCR +) SE kastes som svar på TCR-utløser2 og effektivt fanget av BSLBs3, som representerer en utmerket avlesning for å vurdere de agonistiske egenskapene til antigener og den modellerte membransammensetningen. CD63+ eksosomer og supramolekulære angrepspartikler (SMAPer) frigjøres også av stimulerte T-celler og fanges opp av BSLD-er. De kan brukes som ytterligere avlesninger av aktivering og den resulterende eksocytiske og lytiske granulatsekresjonen av T-celler. Mobiliseringen av eksocytiske vesikler til den interagerende polen til T-cellen letter også retningsutløsningen av cytokiner, som IL-2, IFN-γ og IL-10 som svar på aktivering4,5,6,7,8. Selv om T-celle utgitt cytokiner også kan påvises på BSLD-er, er en mer dedikert studie for tiden under utvikling for å validere den kvantitative analysen av cytokinfrigjøring ved immunologisk synapse.
For å forhøre hvordan spesifikke membransammensetninger påvirker T-cellenes synaptiske utgang, må du definere den fysiologiske tettheten til målmembrankomponenten. Strømningscytometribaserte kvantifiseringer av celleoverflateproteiner er et viktig skritt i denne protokollen og krever: 1) bruk av antistoffer med kjent antall fluorokromer per antistoff (F/P) og 2) benchmarkperler som gir en standardreferanse for interpolerende fluorokrommolekyler fra målte gjennomsnittlige fluorescensintensiviteter (MFIer).
Disse referansestandardene består av fem perlepopulasjoner, som hver inneholder et økende antall tilsvarende løselige fluorokromer (MESFer), som spenner over det dynamiske spekteret av vilkårlig fluorescensdeteksjon. Disse standardpopulasjonene gir diskrete fluorescenstopper, noe som letter konverteringen av vilkårlige fluorescensenheter til MESFer ved enkel lineær regresjon. De resulterende MESF-ene brukes deretter sammen med antistoff F/P-verdier for å beregne gjennomsnittlig antall bundne molekyler per celle (eller BSLB i senere trinn). Anvendelsen av estimerte celleoverflateområder til gjennomsnittlig antall påviste molekyler muliggjør deretter beregning av fysiologiske tettheter som molekyler / μm2. Denne kvantifiseringsprotokollen kan også tilpasses måling av proteintettheter på T-celler og den biokjemiske rekonstitueringen av membransammensetninger som formidler dannelsen av homotypiske T-cellesynapser (dvs. T-T synapses9). Om nødvendig kan valensen av antistoffbinding videre estimeres ved å bruke rekombinante mål merket med kjent antall fluorokromer per molekyl. Deretter kan antistoffbindende valens beregnes for samme BSLB-populasjon ved samtidig å sammenligne antall bundne fluorescerende proteiner og kvantifiseringsantistoffer (ved hjelp av to forskjellige kvantifiseringsfluorikromer og MESF-standarder).
Rekonstituering av APC membraner krever montering av støttede lipid bilayers (SLD) på silikaperler1. Liposomebestander som inneholder forskjellige fosfolipidarter kan utnyttes til å danne en allsidig lipid-bilayermatrise, noe som muliggjør forankring av rekombinante proteiner med forskjellig bindende kjemi (fremstillingen av liposomer er detaljert i 10). Når den fysiologiske tettheten (eller tettheten) til den aktuelle liganden "på celler" er definert, er den samme strømningscytometriprotokollen tilpasset for å estimere konsentrasjonen av rekombinant protein som trengs for å belegge BSLD-er med målfysiologisk tetthet. To forskjellige forankringssystemer kan brukes enten i kombinasjon eller separat.
For det første er SLB som inneholder en endelig 12,5 mol% av Ni2 +-inneholdende fosfolipider tilstrekkelig til å gi omtrent 10.000 His-tag bindingssteder per kvadrat micron10 og fungerer godt for å dekorere BSLD-er med de fleste kommersielt tilgjengelige proteiner hvis fysiologiske tettheter ikke overstiger denne maksimale lastekapasiteten. Det andre lastesystemet utnytter biotinholdige fosfolipider (som mol%) for å laste biotinylerte anti-CD3e Fab (eller HLA / MHC monomerer) via streptavidinbroer. Kombinasjonen av disse to BSLB dekorasjonsmetodene muliggjør deretter fleksibel skreddersøm av BSLD-er som syntetiske APC-er. For svært komplekse APC-overflatesammensetninger kan mol% av fosfolipider og proteiner økes for å laste så mange proteiner som spørsmålet krever. Når arbeidskonsentrasjonene av proteiner og mol% av biotinylerte fosfolipider er definert, kan BSLD-er monteres for å forhøre den synaptiske utgangen av T-celler med multiparametrisk strømningcytometri.

preparation of bead-supported lipid bilayers to study the particulate output of t cell immune synapses

Antigen-presenterende celler (APCer) presenterer tre aktiveringssignaler til T-celler engasjert i fysisk kontakt: 1) antigen, 2) costimulation / corepression, og 3) oppløselige cytokiner. T-celler frigjør to typer effektorpartikler som svar på aktivering: henholdsvis transsynaptiske vesyrer (TSVer) og supramolekulære angrepspartikler, som overfører intercellulære budbringere og formidler cytotoksisitet. Disse enhetene blir raskt internalisert av APC-er som er engasjert i fysisk kontakt med T-celler, noe som gjør karakteriseringen skremmende. Dette dokumentet presenterer protokollen for å fremstille og bruke Perlestøttede Lipid Bilayers (BSLD-er) som antigen-presenting celle (APC) mimetics for å fange og analysere disse transsynaptiske partiklene. Også beskrevet er protokollene for absolutte målinger av proteintettheter på celleoverflater, rekonstituering av BSLD-er med slike fysiologiske nivåer, og strømningscytometriprosedyren for sporing av synaptisk partikkelfrigjøring av T-celler. Denne protokollen kan tilpasses for å studere effekten av individuelle proteiner, komplekse ligandblandinger, patogene virulens determinanter og legemidler på effektorutgangen av T-celler, inkludert hjelper T-celler, cytotoksiske T-lymfocytter, regulatoriske T-celler og chimeric antigenreseptor-uttrykkende T-celler (CART).

FCM for absolutt protein kvantifisering på celleoverflaten Rekonstituering av BSLD-er som presenterer fysiologiske tettheter av ligander krever estimering av totale proteintettheter på det modellerte celleundersettet. For å rekonstituere BSLD-er må du inkludere alle relevante ligander som forventes å spille en rolle i signalaksen av interesse sammen med proteiner som støtter vedheft og funksjonell interaksjon mellom BSLB og celler, for eksempel ICAM-1 og costimulatoriske molekyler, for eksempel ...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses at JoVE.com

Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses

Her presenterer vi protokollen for trinnvis rekonstituering av syntetiske antigen-presenting celler ved hjelp av Perle-støttede Lipid Bilayers og deres bruk for å forhøre synaptisk utgang fra aktiverte T-celler.

Fremstilling av perlestøttede Lipid Bilayers for å studere partikkelutgangen av T-celle immunsynapser

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) ...

Studien av utgangen av immunsynapsen har hovedsakelig vært begrenset til mikroskopiske metoder. BSLD-er har utvidet vårt repertoar av verktøy som kan brukes til å studere utgangen av T-celle immunsynapser, inkludert strømningscytometri, mikroskopi, proteomikk og RNA-sekvenseringsteknologier. Som sådan kan BSLD-er brukes i et bredt spekter av immunologispørsmål og for å identifisere sammensetningen og biokjemisk regulering av T-celleutgangen.Dette inkluderer for eksempel studiet av chimeriske antigenreseptorer, legemidler som hemmer spesifikke signalveier, eller genetisk ablasjon av gener av interesse. Et av de mest kritiske aspektene ved denne protokollen er å optimalisere proteinkalibreringene og flerfarget strømningscytometripanelet som kreves for å spore den transsynaptiske partikkelen av interesse. Dette krever systematisk gjentakelse av proteinkonsentrasjoner, antistoffkonsentrasjoner og instrumentinnstillinger.Begynn med å fortynne en mikroliter perleoppløsning med 1000 mikroliter PBS. Tell perlene ved hjelp av et hemocytometerkammer og beregn konsentrasjonen per milliliter. Beregn deretter volumet av silikaperler som trengs for 500.000 endelige BSLD-er per titreringspunkt.Overfør det nødvendige volumet av silikaperler til et sterilt 1,5 milliliter mikrosentermikrosenterrør. Vask silikaperlene tre ganger med en milliliter steril PBS og sentrifuger perlene. Forbered tre bind liposom master mix som inneholder en endelig 12,5-mole prosent av nikkelholdige fosfolipider.Bruk liposomets mesterblanding til å resuspendere de vaskede silikaperlene. Bland den deretter forsiktig ved å pipettere opp og ned halvparten av det totale volumet. Bruk en steril teknikk, tilsett argon eller nitrogengass til røret for å fortrenge luft og beskytte lipidene mot oksidasjon under blanding.Legg argon til 0,4 millimolar lipid aksjer. Oppbevar lageret og manipuler ved hjelp av en steril teknikk. Flytt BSLD-ene til den vertikale mikseren og bland i 30 minutter ved romtemperatur ved hjelp av orbital blanding ved 10 RPM.Deretter kan du spinne ned perlene ved å sentrifugere i 15 sekunder ved romtemperatur på en benk-topp minisenter. Blokker de dannede BSLD-ene ved å legge til en milliliter 5%BSA som inneholder 100 mikromolar nikkelsulfat for å mette NTA-anlegg på BSLD-ene. Vask tre ganger ved hjelp av HBS-HSA-buffer for å fjerne overflødig blokkeringsløsning.Ta en ny U-bunn eller V-bunn 96-brønns plate og lag to ganger seriell fortynning av proteinene. Resuspend de forberedte BSLD-ene i et volum slik at 100 mikroliter HBS-HSA-buffer inneholder 500 000 BSLD-er. Ta deretter en annen U-bunn- eller V-bunn 96-brønnsplate og overfør 100 mikroliter av BSLB-fjæringen til brønnene på en slik måte at hver brønn mottar 500.000 BSBLer.Snurr ned den andre platen ved romtemperatur i to minutter ved 300x G.Kast supernatanten og overfør 100 mikrolitervolumer fra proteintitreringsplaten til platen som inneholder de sedimenterte BSLD-ene. Bland forsiktig, unngå overflødig boblegenerering mens du piper. Bruk aluminiumsfolie for å beskytte den mot lys og inkubere ved romtemperatur i 30 minutter ved 1000 RPM.Vask deretter platen tre ganger ved å legge HBS-HSA-bufferen til platen og spinn den ned ved romtemperatur i to minutter ved 300x G.Count cellene etter vask. Deretter fortynner du dem til en endelig konsentrasjon på 2,5 millioner per milliliter ved hjelp av synaptisk overføringsanalysemedium. Når BSLD-ene er lastet med proteinblandingen, vask BSLD-ene to ganger med HBS-HSA-bufferen for å fjerne overflødige ubundne proteiner.Resuspend 500 000 BSLB per brønn i 200 mikroliter HBS-HSA buffer. Overfør 100 mikroliter BSLD per brønn til en ny U-bottom 96-brønnsplate for å lage en duplikat, slik at den endelige mengden BSLB per brønn er 250.000. Spinn ned BSLD-ene ved 300x G i to minutter ved romtemperatur.Kast supernatanten og bruk deretter BSLD-ene på nytt ved hjelp av 100 mikroliter T-cellefjæring. Bland forsiktig for å forhindre dannelse av bobler. Inkuber medkulturene i 90 minutter ved 37 grader Celsius.Beskytt cellene mot lys og avkjøl co-kulturene ved først å inkubere dem ved romtemperatur i minst 15 minutter. Sentrifuger medkulturene ved romtemperatur i fem minutter ved 500x G.Kast supernatanten og resuspender medkulturene i kalsium- og magnesiumionfrie 2% BSA PBS ved romtemperatur for blokkering. Plasser cellene på is i 45 minutter og beskytt dem mot lys.Forbered antistoffmasterblandingen ved hjelp av iskald 0,22 mikrometerfiltrert 2% BSA og PBS som en fargingsbuffer. Denne hovedmiksen vil gi ekstra blokkering. Spinn ned co-kulturer på 500x G i fem minutter og fire grader Celsius.Kast supernatantene, og bruk deretter en flerkanals pipette for å resuspendere cellene i fargingsmasterblandingen som inneholder optimaliserte antistoffkonsentrasjoner. Inkluder isotypemerkede celler og BSLD-er, fluorescerende og ikke-fluorescerende BSLD-er, og celler og BSLD-er farget alene. Bland forsiktig ved å pipettere opp og ned halvparten av volumet.Inkuber i 30 minutter på is og beskytt dem mot lys. Vask cellene og BSLD-ene to ganger ved hjelp av iskald 2 %BSA PBS. Snurr dem ned på 500x G i fem minutter ved fire grader Celsius.Etter sentrifugering, sjekk samkulturen sedimentert på bunnen av brønnene. Deretter resuspenderer de vaskede co-kulturene i 100 mikrolitere av PBS og skaffer seg umiddelbart. Aktiver loggskalaen for sidespredningslys og parameteren for flytid for side- og fremoverspredningslys.Oppnå MESF-standarder, noe som sikrer at både de svakeste og lyseste populasjonene faller i instrumentets lineære område. Deretter anskaffer du kompensasjonsprøver, beregner kompensasjon og bruker kompensasjonsmatrisen på eksperimentet. Anskaffe og lagre minst 20 000 totale MESF-standarder for hver kvantifiseringskanal.Unngå å bruke FACS hylsevæske eller lignende for å resuspendere MESF-perler, da disse inneholder salter og alkoholer som vil ødelegge fluorokromene, noe som fører til bredere fluorescenstopper og høy feil. For oppkjøp ved hjelp av prøvetakere med høy gjennomstrømning, sett instrumentanskaffelse til Standard, sett prøveanskaffelse til 80 mikroliter. Prøvestrømningshastighet mellom to og tre mikroliter per sekund, prøve blandingsvolum ved 50 mikroliter, prøve blanding av 150 mikroliter per sekund, og blanding per brønn mellom tre og fem.Skaff deg minst 10 000 enkle BSLD-er per prøve. Til slutt eksporterer du FCS-filene. Et eksempel på kvantitative strømningscytometrimålinger av ICAM-1 på overflaten av tonsillar B-celler og hjelper T-celler vises her.De representative bildene beskriver gating strategien for å analysere enkelt CXCR5 B celler og follikulær-hjelper T celler isolert fra menneskelige palatin mandler. Denne sekvensielle gatingstrategien identifiserer enkelthendelser i det kontinuerlige oppkjøpsvinduet. Doublets, celleoverflateuttrykket til ICAM-1 sammenlignet med FMO-kontroller og FMO-kontroller merket med relevante isotyper av populasjonene, vises her.Gating og måling av MFIer fra forskjellige standard MESF-populasjoner i de overlagte histogrammene til MESF-populasjonene vises her. Verdiene representerer MFIene for hver av de fem MESF-populasjonene. Lineær regresjon av MESF over cMFI for MESF-populasjonene presenteres her.Skråningen trekker ut MESF bundet til celler fra FCM-dataene til ICAM-1 på overflaten av tonsillar B-celler i TFH. Konverteringen til absolutte molekylære tettheter følger disse enkle matematiske operasjonene. De representative bildene viser strømningscytometrianalysen av BSLD-er rekonstituert med økte tettheter av rekombinant monomerisk ICAM-1 12 histidiner.Regresjonsanalyser av ICAM-1 referansekonsentrasjon over målt tetthet er vist her. Skråningen brukes til å beregne målkonsentrasjoner av protein for å oppnå tettheten av celler. Strømningsskjemaene viser de kritiske trinnene for samtidig dyrking av T-celler med BSLD-er, rekonstituering av modellmembraner i etterfølgende måling av partikkeloverføring med strømningscytometri.Gating strategien for å identifisere enkelt BSLD-er og celler i det kontinuerlige oppkjøpsvinduet vises her. En av de viktigste aspektene ved denne protokollen er at for å opprettholde reproduserbarheten av resultatene, hver gang du endrer protein- eller lipidlagre, må du utføre ny kalibreringsanalyse. For å oppdage nye effektive molekyler utskilt av forskjellige T-celleundersett, kan BSLD-er isoleres ytterligere ved fluorescensaktivert cellesortering som utsatt for transkripsjons- og proteomisk analyse.Våre kolleger ved University of Oxford har brukt denne teknologien til å studere og demonstrere nye reseptor-ligand interaksjoner, og også for å studere effekten av genetiske ablasjoner på utgangen av T-celle immunsynapse.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Imaging av HIV-1-konvolutt-indusert virologisk Synapse og signaliserer på Syntetiske Lipid bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

Isolasjon og Th17 Differensiering av naive CD4 T-lymfocytter

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Transplantasjon av Tail Skin Study Cell Responses Allogen CD4 T i Mus

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mus naive CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolasjon og<em&gt; In vitro</em&gt; Differensiering i T cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Metoder for å studere Lipidendringer av nøytrofile granulocytter og etterfølgende dannelse av Neutrofil Ekstracellulær feller

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Retroviral Transduksjon T-hjelpeceller som genetisk tilnærming å studere mekanismer kontrollere sine Differensiering og funksjon

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

En suge blemme protokoll å studere Human T-celle tilbakekalling svar i Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...