Name: preparation of bead-supported lipid bilayers to study the particulate output of t cell immune synapses
Uploaded: 2022-04-01T13:30:00
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Somos gratos aos nossos membros do laboratório e à comunidade do Instituto Kennedy de Reumatologia por discussões científicas construtivas, especialmente ao nosso gerente de instalações de citometria de fluxo, Jonathan Webber. Este trabalho foi financiado pela Wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z, o ERC Advanced Grant (SYNECT AdG 670930) e o Kennedy Trust for Reumatology Research (KTRR) (todos os três para MLD). O PFCD foi apoiado pela EMBO Long-Term Fellowship (ALTF 1420-2015, em conjunto com a Comissão Europeia (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) e Marie Sklodowska-Curie Actions) e uma Oxford-Bristol Myers Squibb Fellowship.

1. Medição das densidades proteicas da superfície celular com citometria quantitativa de fluxo
<ol><li>Prepare 0,22 μm filtrado tampão de citometria de fluxo humano (hFCB) adicionando EDTA (a uma concentração final de 2 mM) e soro AB humano (até 10% final para salina tamponada de fosfato estéril (PBS), pH 7.4 (ver Tabela 1). Filtre a solução usando uma unidade de filtro de poros de 0,22 μm para remover impurezas do soro e armazenar a 4 °C.</li>
	<li>Recupere as células e ...

<ol>
	<li>Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+to+reconstitute+immune+cell+signaling.">Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling.</a> FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).</li><li>Choudhuri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+release+of+T-cell-receptor-enriched+microvesicles+at+the+immunological+synapse.">Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological synapse.</a> Nature. 507 (7490), 118-123 (2014).</li><li>Saliba, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+structure+of+synaptic+ectosomes+exporting+antigen+receptor+linked+to+functional+CD40+ligand+from+helper+T+cells.">Composition and structure of synaptic ectosomes exporting antigen receptor linked to functional CD40 ligand from helper T cells.</a> elife. 8, 47528 (2019).</li><li>Barcia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+polarization+of+IFN-gamma+at+Kupfer+and+non-Kupfer+immunological+synapses+during+the+clearance+of+virally+infected+brain+cells.">In vivo polarization of IFN-gamma at Kupfer and non-Kupfer immunological synapses during the clearance of virally infected brain cells.</a> Journal of Immunology. 180 (3), 1344-1352 (2008).</li><li>Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+use+two+directionally+distinct+pathways+for+cytokine+secretion.">T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion.</a> Nature Immunology. 7 (3), 247-255 (2006).</li><li>Kupfer, A., Mosmann, T. R., Kupfer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+expression+of+cytokines+in+cell+conjugates+of+helper+T+cells+and+splenic+B+cells.">Polarized expression of cytokines in cell conjugates of helper T cells and splenic B cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (3), 775-779 (1991).</li><li>Kupfer, H., Monks, C. R., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+splenic+B+cells+that+bind+to+antigen-specific+T+helper+(Th)+cells+and+face+the+site+of+cytokine+production+in+the+Th+cells+selectively+proliferate:+immunofluorescence+microscopic+studies+of+Th-B+antigen-presenting+cell+interactions.">Small splenic B cells that bind to antigen-specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate: immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen-presenting cell interactions.</a> Journal of Experimental Medicine. 179 (5), 1507-1515 (1994).</li><li>Reichert, P., Reinhardt, R. L., Ingulli, E., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+in+vivo+identification+of+TCR+redistribution+and+polarized+IL-2+production+by+naive+CD4+T+cells.">Cutting edge: in vivo identification of TCR redistribution and polarized IL-2 production by naive CD4 T cells.</a> Journal of Immunology. 166 (7), 4278-4281 (2001).</li><li>Gerard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+T+cell-T+cell+synaptic+interactions+drive+the+differentiation+of+protective+CD8++T+cells.">Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8+ T cells.</a> Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).</li><li>Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+planar+bilayers+for+study+of+the+immunological+synapse.">Supported planar bilayers for study of the immunological synapse.</a> Current Protocols in Immunology. , (2007).</li><li>Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2021)</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+compensation+for+flow+cytometry:+visualization+artifacts,+limitations,+and+caveats.">Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats.</a> Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).</li><li>Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+T+cells+is+induced+by+binding+to+nickel-chelating+lipids+in+supported+lipid+bilayers.">Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers.</a> Frontiers in Physiology. 11, 613367 (2020).</li><li>Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+spillover+spreading+for+comparing+instrument+performance+and+aiding+in+multicolor+panel+design.">Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design.</a> Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).</li><li>C&#233;spedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+antigen-presenting+cells+reveal+the+diversity+and+functional+specialisation+of+extracellular+vesicles+composing+the+fourth+signal+of+T+cell+immunological+synapses.">Synthetic antigen-presenting cells reveal the diversity and functional specialisation of extracellular vesicles composing the fourth signal of T cell immunological synapses.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Yoon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+non-activated+lymphocytes+using+three-dimensional+refractive+index+tomography+and+machine+learning.">Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distributions+of+autofluorescence+after+compensation:+Be+panglossian,+fret+not.">Distributions of autofluorescence after compensation: Be panglossian, fret not.</a> Cytometry A. 89 (4), 398-402 (2016).</li><li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+controls,+instrument+setup,+and+the+determination+of+positivity.">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li><li>Balint, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+attack+particles+are+autonomous+killing+entities+released+from+cytotoxic+T+cells.">Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells.</a> Science. 368 (6493), 897-901 (2020).</li><li>Cespedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+expression+of+the+hRSV+nucleoprotein+impairs+immunological+synapse+formation+with+T+cells.">Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).</li></ol>

Os BSLBs são ferramentas versáteis para estudar a saída de partículas de células T estimuladas com membranas modelo APC. A flexibilidade do método permite a reconstituição de composições complexas e reducionistas da membrana para estudar os efeitos dos ligantes e seus sinais sobre a secreção de tSVs e partículas de ataque supramolecular e seus componentes. Testamos esta tecnologia em várias células T, incluindo TH pré-ativado, CTL, Tregs e CART15. Este protocolo também funciona pa...

A sinapse imunológica (IS) é uma estrutura molecular fundamental formada na interface de células envolvidas em contato físico que facilita a troca regulada de informações juxtracrinas. Diferentes ISs foram descritos na literatura, e um conjunto crescente de evidências sugere que esses hubs moleculares são uma característica conservada das redes celulares. Várias células imunes, incluindo células B, células assassinas naturais, células dendríticas, macrófagos e células T, trocam informações através da montagem de contatos de curta duração1. Estudos multiómicos estão avançando na compreensão de novos subconjuntos de leucócitos e células estromais que conduzem redes celulares patogênicas e expressam proteínas superficiais com funções desconhecidas. Como APCs sintéticos, os BSLBs permitem a investigação direta do papel funcional das proteínas individuais na integração de sinais de ativação, ou seja, antígenos e costimulação/corepressão, por células T e a consequente liberação de partículas de efeitos referidas como sinal quatro.
Este artigo descreve os protocolos e pontos técnicos críticos a serem considerados ao usar BSLBs para imitar a composição superficial dos APCs do modelo. Os protocolos para a medição quantitativa de receptores imunológicos e outras proteínas superficiais em APCs são apresentados juntamente com o protocolo para a reconstituição de APCs sintéticos contendo essas quantidades medidas. Em seguida, as etapas necessárias para coculturar células T e BSLB são apresentadas juntamente com o protocolo para a medição quantitativa da transferência de partículas trans-sinápticas usando citometria de fluxo. Mais notavelmente, os BSLBs facilitam o estudo de uma população derivada de membrana plasmática de tSVs denominadas ectomosse sináptico (ECtos). As SEs enriquecidas com receptor de antígeno de células T (TCR+) são lançadas em resposta ao Acionamento TCR2 e capturadas eficientemente por BSLBs3, representando uma excelente leitura para avaliar as propriedades agonizantes dos antígenos e a composição da membrana modelada. Exosomos CD63+ e partículas de ataque supramolecular (SMAPs) também são liberados por células T estimuladas e capturados por BSLBs. Eles podem ser usados como leituras adicionais da ativação e a secreção de grânulo exolítico e lítico resultante por células T. A mobilização de vesículas exocióticas ao polo interagente da célula T também facilita a liberação direcional de citocinas, como IL-2, IFN-γ e IL-10 em resposta à ativação4,5,6,7,8. Embora citocinas liberadas por células T também possam ser detectadas em BSLBs, um estudo mais dedicado está atualmente em desenvolvimento para validar a análise quantitativa da liberação de citocinas na sinapse imunológica.
Para questionar como as composições de membranas específicas influenciam a saída sináptica das células T requer a definição da densidade fisiológica do componente da membrana alvo. Quantificações baseadas em citometria de fluxo de proteínas superficiais celulares são um passo essencial neste protocolo e exigem: 1) o uso de anticorpos com números conhecidos de fluorochromes por anticorpo (F/P), e 2) contas de referência fornecendo uma referência padrão para interpolar moléculas fluorocromáticas a partir de intensidades de fluorescência média medida (MFIs).
Esses padrões de referência consistem em cinco populações de contas, cada uma contendo um número crescente de fluorocromes solúveis equivalentes (MESFs), que abrangem a faixa dinâmica de detecção arbitrária de fluorescência. Essas populações padrão produzem picos de fluorescência discreta, facilitando a conversão de unidades de fluorescência arbitrária em MESFs por simples regressão linear. Os MESFs resultantes são então usados juntamente com valores de anticorpos F/P para calcular o número médio de moléculas ligadas por célula (ou BSLB em etapas posteriores). A aplicação de áreas estimadas da superfície celular ao número médio de moléculas detectadas permite então o cálculo de densidades fisiológicas como moléculas/μm2. Este protocolo de quantificação também pode ser adaptado à medição de densidades proteicas em células T e à reconstituição bioquímica de composições de membrana mediando a formação de sinapses celulares T homotípicas (ou seja, sinapses T-T). Se necessário, a valência da ligação de anticorpos pode ser estimada usando alvos recombinantes rotulados com números conhecidos de fluorochromes por molécula. Em seguida, a valência de ligação de anticorpos pode ser calculada para a mesma população BSLB, comparando simultaneamente o número de proteínas fluorescentes ligadas e anticorpos de quantificação (usando dois fluorochromes de quantificação diferentes e padrões MESF).
A reconstituição das membranas APC requer a montagem de bicamadas lipídicas suportadas (SLBs) em contas de sílica1. Os estoques lipossomos contendo diferentes espécies fosfolipídicas podem ser aproveitados para formar uma versátil matriz lipídica-bicamada, permitindo a ancoragem de proteínas recombinantes com diferentes químicas de ligação (a preparação de lipossomos é detalhada em 10). Uma vez definida a densidade fisiológica (ou densidades) do ligante relevante "sobre células", o mesmo protocolo de citometria de fluxo é adaptado para estimar a concentração de proteína recombinante necessária para cobrir BSLBs com a densidade fisiológica alvo. Dois sistemas de ancoragem diferentes podem ser usados em combinação ou separadamente.
Primeiro, o SLB contendo 12,5% finais de fosfolipídios contendo Ni2+, é suficiente para fornecer aproximadamente 10.000 locais de ligação de sua etiqueta por micron10 quadrado e funciona bem para decorar BSLBs com a maioria das proteínas disponíveis comercialmente cujas densidades fisiológicas não excedem essa capacidade máxima de carregamento. O segundo sistema de carregamento aproveita fosfolipídios contendo biotina (como mol) para carregar os monomers anti-CD3e fab biotinilados (ou monômeros HLA/MHC) através de pontes streptavidinas. A combinação desses dois métodos de decoração BSLB permite, então, a alfaiataria flexível de BSLBs como APCs sintéticos. Para composições superficiais APC altamente complexas, o mol% de fosfolipídios e proteínas pode ser aumentado para carregar quantas proteínas a questão em questão exige. Uma vez definidas as concentrações de trabalho de proteínas e mol% de fosfolipídios biotinilados, os BSLBs podem ser montados para interrogar a saída sináptica de células T com citometria de fluxo multiparamétrico.

preparation of bead-supported lipid bilayers to study the particulate output of t cell immune synapses

As células que apresentam antígenos (APCs) apresentam três sinais de ativação para células T envolvidas no contato físico: 1) antígeno, 2) costimulação/corepressão e 3) citocinas solúveis. As células T liberam dois tipos de partículas efeitos em resposta à ativação: vesículas transsintálicas (tSVs) e partículas de ataque supramolecular, que transferem mensageiros intercelulares e mediam a citotoxicidade, respectivamente. Essas entidades são rapidamente internalizadas por APCs engajados no contato físico com células T, tornando sua caracterização assustadora. Este artigo apresenta o protocolo para fabricar e usar bicamadas lipídicas apoiadas por contas (BSLBs) como miméticas de células que apresentam antígenos (APC) para capturar e analisar essas partículas trans-sinápticas. Também são descritos os protocolos para as medições absolutas de densidades proteicas nas superfícies celulares, a reconstituição de BSLBs com tais níveis fisiológicos e o procedimento de citometria de fluxo para rastreamento da liberação de partículas sinápticas por células T. Este protocolo pode ser adaptado para estudar os efeitos de proteínas individuais, misturas complexas de ligantes, determinantes de virulência de patógenos e drogas na saída de células T, incluindo células T auxiliares, linfócitos T citotóxicos, células T regulatórias e células T que expressam receptor de antígeno quimérico (CART).

FCM para quantificação absoluta de proteína na superfície celular A reconstituição de BSLBs apresentando densidades fisiológicas de ligantes requer a estimativa de densidades proteicas totais no subconjunto celular modelado. Para reconstituir os BSLBs, inclua qualquer ligante relevante esperado para desempenhar um papel no eixo de sinalização de interesse ao lado de proteínas que suportem a adesão e interação funcional entre bslb e células, como ICAM-1 e moléculas costimulatórias, por ...

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Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses

Aqui apresentamos o protocolo para a reconstituição stepwise de células que apresentam antígenos sintéticos usando Bicamadas lipídicas apoiadas por contas e seu uso para interrogar a saída sináptica de células T ativadas.

Preparação de Bicamadas lipídicas apoiadas por contas para estudar a saída de partículas de sinapses imunes de células T

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) ...

O estudo da saída da sinapse imunológica tem sido restrito principalmente a métodos microscópicos. Os BSLBs expandiram nosso repertório de ferramentas que podem ser usadas para estudar a saída de sinapses imunes de células T, incluindo citometria de fluxo, microscopia, proteômica e tecnologias de sequenciamento de RNA. Como tal, os BSLBs podem ser utilizados em uma ampla variedade de questões de imunologia e na identificação da composição e regulação bioquímica da produção celular T.Isso inclui, por exemplo, o estudo de receptores de antígeno quimérico, drogas que inibem vias específicas de sinalização, ou a ablação genética de genes de interesse. Um dos aspectos mais críticos deste protocolo é otimizar as calibrações proteicas e o painel de citometria de fluxo multicolor necessário para o rastreamento da partícula trans-sináptica de interesse. Isso requer a iteração sistemática de concentrações proteicas, concentrações de anticorpos e configurações de instrumentos.Comece diluindo um microliter de solução de contas com 1.000 microliters de PBS. Conte as contas usando uma câmara hemócica e calcule sua concentração por mililitro. Em seguida, calcule o volume de contas de sílica necessárias para 500.000 BSLBs finais por ponto de titulação.Transfira o volume necessário de contas de sílica para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro estéril. Lave as contas de sílica três vezes com um mililitro de PBS estéril e centrifugar as contas. Prepare três volumes de mistura mestre lipossosome contendo um percentual final de 12,5 mols de fosfolipídios contendo níquel.Use a mistura de mestre lipososome para resuspensar as contas de sílica lavadas. Em seguida, misture-o suavemente por pipetting para cima e para baixo metade do volume total. Usando uma técnica estéril, adicione argônio ou gás nitrogênio ao tubo para deslocar o ar e proteger os lipídios da oxidação durante a mistura.Adicione argônio aos estoques lipíduos de 0,4 milimilito. Armazene o estoque e manipule usando uma técnica estéril. Mova os BSLBs para a batedeira vertical e misture por 30 minutos à temperatura ambiente usando mistura orbital a 10 RPM.Em seguida, gire as contas por centrifugação por 15 segundos à temperatura ambiente em uma minicentrifuagem de bancada. Bloqueie os BSLBs formados adicionando um mililitro de 5%BSA contendo 100 micromolar de sulfato de níquel para saturar os locais NTA nos BSLBs. Lave três vezes usando o buffer HBS-HSA para remover a solução de bloqueio em excesso.Pegue uma nova placa U-bottom ou V-bottom 96-well e prepare diluições seriais duas vezes das proteínas. Resuspenja os BSLBs preparados em um volume de tal forma que 100 microliters de tampão HBS-HSA contenham 500.000 BSLBs. Em seguida, pegue outra placa de 96 poços de fundo U ou V e transfira 100 microliters da suspensão BSLB para os poços de tal forma que cada poço receba 500.000 BSBLs.Gire a segunda placa à temperatura ambiente por dois minutos a 300x G.Descarte o supernadante e transfira volumes de 100 microliter da placa de titulação proteica para a placa que contém os BSLBs sedimentados. Misture suavemente, evitando o excesso de geração de bolhas durante a pipetação. Use papel alumínio para protegê-lo da luz e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos a 1.000 RPM.Em seguida, lave a placa três vezes adicionando tampão HBS-HSA à placa e gire-a à temperatura ambiente por dois minutos a 300x G.Conte as células após a lavagem. Em seguida, dilui-os a uma concentração final de 2,5 milhões por mililitro usando o meio de ensaio de transferência sináptica. Uma vez que os BSLBs são carregados com a mistura de proteína, lave os BSLBs duas vezes com tampão HBS-HSA para remover o excesso de proteínas não ligadas.Resuspend 500.000 BSLBs por poço em 200 microliters de tampão HBS-HSA. Transfira 100 microliters de BSLBs por poço para uma nova placa U-bottom de 96 poços para fazer uma duplicata, de tal forma que a quantidade final de BSLB por poço seja de 250.000. Gire os BSLBs a 300x G por dois minutos em temperatura ambiente.Descarte o supernatante e, em seguida, resuspenque os BSLBs usando 100 microliters de suspensão celular T. Misture suavemente para evitar a formação de bolhas. Incubar as coculturas por 90 minutos a 37 graus Celsius.Proteja as células da luz e esfrie as co-culturas, primeiro incubando-as à temperatura ambiente por um mínimo de 15 minutos. Centrifugar as co-culturas à temperatura ambiente por cinco minutos a 500x G.Descarte o sobrenasciente e resuspenque as co-culturas em cálcio e magnésio livre de íons 2%BSA PBS à temperatura ambiente para bloqueio. Coloque as células no gelo por 45 minutos e proteja-as da luz.Prepare a mistura mestre de anticorpos usando 0,22 micrômetros filtrados 2% BSA e PBS como tampão de coloração. Esta mistura mestre fornecerá um bloqueio extra. Gire as co-culturas a 500x G por cinco minutos e quatro graus Celsius.Descarte os supernantes e use uma pipeta multicanal para resuspensar as células na mistura mestre de coloração contendo concentrações otimizadas de anticorpos. Inclua células com rótulo de isótipo e BSLBs, BSLBs fluorescentes e não fluorescentes, e células e BSLBs manchadas sozinhas. Misture suavemente por pipetting para cima e para baixo metade do volume.Incubar por 30 minutos no gelo e protegê-los da luz. Lave as células e os BSLBs duas vezes usando PBS 2%BSA com frio gelado. Gire-os a 500x G por cinco minutos a quatro graus Celsius.Após a centrifugação, verifique a cocultura sedimentada na parte inferior dos poços. Em seguida, resuspenja as co-culturas lavadas em 100 microliters de PBS e adquira imediatamente. Ative a escala de log para luz dispersa lateral e o parâmetro de tempo de voo para luzes de lado e para a frente.Adquira os padrões MESF, garantindo que tanto as populações dim-set quanto as mais brilhantes caiam na faixa linear do instrumento. Em seguida, adquira amostras de compensação, calcule a compensação e aplique a matriz de compensação ao experimento. Adquira e economize um mínimo de 20.000 padrões totais de MESF para cada canal de quantificação.Evite o uso de fluido de bainha FACS ou similar a contas MESF resuspend, pois estas contêm sais e álcoois que destruirão os fluorochromes, levando a picos de fluorescência mais amplos e alto erro. Para aquisição utilizando samplers de alto rendimento, defina a aquisição de instrumentos à Standard, defina a aquisição de amostras para 80 microlitros. Taxa de Fluxo amostral entre dois e três microliters por segundo, amostra de Volume de Mistura em 50 microliters, mistura amostral de 150 microliters por segundo e mistura por poço entre três e cinco.Adquira um mínimo de 10.000 BSLBs únicos por amostra. Finalmente, exporte os arquivos FCS. Um exemplo de medidas quantitativas de citometria de fluxo de ICAM-1 na superfície de células Amigillar e células T auxiliares é mostrado aqui.As imagens representativas descrevem a estratégia de gating para analisar células únicas CXCR5 B e células T foliculares isoladas de amígdalas palatinas humanas. Esta estratégia de gating sequencial identifica eventos ao vivo únicos dentro da janela de aquisição contínua. Os doublets, a expressão da superfície celular do ICAM-1 em comparação com os controles FMO e os controles de FMO rotulados com isótipos relevantes das populações, são mostrados aqui.Gating e medição de MFIs de diferentes populações padrão de MESF nos histogramas sobrepostos das populações do MESF são mostrados aqui. Os valores representam os MFIs para cada uma das cinco populações do MESF. A regressão linear do MESF sobre a CMFI para as populações do MESF é apresentada aqui.A inclinação extrai MESF vinculado às células dos dados fcm do ICAM-1 na superfície de células B tonsilárgas em TFH. A conversão para densidades moleculares absolutas segue essas simples operações matemáticas. As imagens representativas mostram a análise de citometria de fluxo de BSLBs reconstituídas com densidades aumentadas de histidinas monoméricas recombinantes ICAM-1 12.Análises de regressão da concentração de referência ICAM-1 sobre densidade medida são mostradas aqui. A inclinação é usada para calcular concentrações-alvo de proteína para atingir a densidade das células. Os diagramas de fluxo mostram os passos críticos para co-culminar células T com BSLBs, reconstituindo membranas modelo na medição subsequente da transferência de partículas com citometria de fluxo.A estratégia de gating para identificar BSLBs e células únicas dentro da janela de aquisição contínua é mostrada aqui. Um dos aspectos mais importantes deste protocolo é que, para manter a reprodutibilidade dos resultados, cada vez que você muda os estoques de proteínas ou lipídios, você precisa realizar uma nova análise de calibração. Para descobrir novas moléculas eficazes secretadas por diferentes subconjuntos de células T, os BSLBs podem ser ainda mais isolados pela classificação celular ativada pela fluorescência, como submetidos à análise transcriômica e proteômica.Nossos colegas da Universidade de Oxford têm usado essa tecnologia para estudar e demonstrar novas interações receptor-ligantes, e também para estudar os efeitos das ablações genéticas na saída da sinapse imunológica das células T.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Competitiva Ensaios Homing para Estudar Gut trópico-Migração de Células T

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Imunologia e Infecção

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Uma Introdução à Vespas parasitas de<em&gt; Drosophila</em&gt; E Resposta Imune a antiparasitários

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Imagem do HIV-1 Synapse Envelope induzida virológica e Sinalização em bicamadas lipídicas sintéticas

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

Isolamento e Th17 Diferenciação de Linfócitos T CD4 Naïve

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

O transplante de pele da cauda para estudar as respostas das células T CD4 alogênico em camundongos

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Rato Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento de células T e<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciação em subpopulações de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Métodos de estudo de lipídios Alterações nos neutrófilos ea subsequente formação de neutrófilos Extracelular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Transdução retroviral de células T helper como uma abordagem genética para estudar mecanismos que controlam a sua diferenciação e função

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Um protocolo de aspiração da bolha para estudar células T humanas Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...