Name: preparation of bead-supported lipid bilayers to study the particulate output of t cell immune synapses
Uploaded: 2022-04-01T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses at JoVE.com

Мы благодарны членам нашей лаборатории и сообществу Института ревматологии Кеннеди за конструктивные научные дискуссии, особенно нашему менеджеру центра проточной цитометрии Джонатану Уэбберу. Эта работа финансировалась Wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z, ERC Advanced Grant (SYNECT AdG 670930) и Kennedy Trust for Rheumatology Research (KTRR) (все три для MLD). PFCD был поддержан долгосрочной стипендией EMBO (ALTF 1420-2015, совместно с Европейской комиссией (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) и Marie Sklodowska-Curie Actions) и стипендией Оксфорд-Бристоль Майерс Сквибб.

1. Измерение плотности белков поверхности клеток с помощью количественной проточной цитометрии
<ol><li>Получают 0,22 мкм-фильтрованный буфер проточной цитометрии человека (hFCB), добавляя ЭДТА (к конечной концентрации 2 мМ) и сыворотку AB человека (до последних 10%) к стерильному фосфат...

<ol>
	<li>Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+to+reconstitute+immune+cell+signaling.">Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling.</a> FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).</li><li>Choudhuri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+release+of+T-cell-receptor-enriched+microvesicles+at+the+immunological+synapse.">Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological synapse.</a> Nature. 507 (7490), 118-123 (2014).</li><li>Saliba, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+structure+of+synaptic+ectosomes+exporting+antigen+receptor+linked+to+functional+CD40+ligand+from+helper+T+cells.">Composition and structure of synaptic ectosomes exporting antigen receptor linked to functional CD40 ligand from helper T cells.</a> elife. 8, 47528 (2019).</li><li>Barcia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+polarization+of+IFN-gamma+at+Kupfer+and+non-Kupfer+immunological+synapses+during+the+clearance+of+virally+infected+brain+cells.">In vivo polarization of IFN-gamma at Kupfer and non-Kupfer immunological synapses during the clearance of virally infected brain cells.</a> Journal of Immunology. 180 (3), 1344-1352 (2008).</li><li>Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+use+two+directionally+distinct+pathways+for+cytokine+secretion.">T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion.</a> Nature Immunology. 7 (3), 247-255 (2006).</li><li>Kupfer, A., Mosmann, T. R., Kupfer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+expression+of+cytokines+in+cell+conjugates+of+helper+T+cells+and+splenic+B+cells.">Polarized expression of cytokines in cell conjugates of helper T cells and splenic B cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (3), 775-779 (1991).</li><li>Kupfer, H., Monks, C. R., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+splenic+B+cells+that+bind+to+antigen-specific+T+helper+(Th)+cells+and+face+the+site+of+cytokine+production+in+the+Th+cells+selectively+proliferate:+immunofluorescence+microscopic+studies+of+Th-B+antigen-presenting+cell+interactions.">Small splenic B cells that bind to antigen-specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate: immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen-presenting cell interactions.</a> Journal of Experimental Medicine. 179 (5), 1507-1515 (1994).</li><li>Reichert, P., Reinhardt, R. L., Ingulli, E., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+in+vivo+identification+of+TCR+redistribution+and+polarized+IL-2+production+by+naive+CD4+T+cells.">Cutting edge: in vivo identification of TCR redistribution and polarized IL-2 production by naive CD4 T cells.</a> Journal of Immunology. 166 (7), 4278-4281 (2001).</li><li>Gerard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+T+cell-T+cell+synaptic+interactions+drive+the+differentiation+of+protective+CD8++T+cells.">Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8+ T cells.</a> Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).</li><li>Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+planar+bilayers+for+study+of+the+immunological+synapse.">Supported planar bilayers for study of the immunological synapse.</a> Current Protocols in Immunology. , (2007).</li><li>Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2021)</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+compensation+for+flow+cytometry:+visualization+artifacts,+limitations,+and+caveats.">Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats.</a> Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).</li><li>Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+T+cells+is+induced+by+binding+to+nickel-chelating+lipids+in+supported+lipid+bilayers.">Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers.</a> Frontiers in Physiology. 11, 613367 (2020).</li><li>Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+spillover+spreading+for+comparing+instrument+performance+and+aiding+in+multicolor+panel+design.">Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design.</a> Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).</li><li>C&#233;spedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+antigen-presenting+cells+reveal+the+diversity+and+functional+specialisation+of+extracellular+vesicles+composing+the+fourth+signal+of+T+cell+immunological+synapses.">Synthetic antigen-presenting cells reveal the diversity and functional specialisation of extracellular vesicles composing the fourth signal of T cell immunological synapses.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Yoon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+non-activated+lymphocytes+using+three-dimensional+refractive+index+tomography+and+machine+learning.">Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distributions+of+autofluorescence+after+compensation:+Be+panglossian,+fret+not.">Distributions of autofluorescence after compensation: Be panglossian, fret not.</a> Cytometry A. 89 (4), 398-402 (2016).</li><li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+controls,+instrument+setup,+and+the+determination+of+positivity.">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li><li>Balint, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+attack+particles+are+autonomous+killing+entities+released+from+cytotoxic+T+cells.">Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells.</a> Science. 368 (6493), 897-901 (2020).</li><li>Cespedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+expression+of+the+hRSV+nucleoprotein+impairs+immunological+synapse+formation+with+T+cells.">Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).</li></ol>

BSLB являются универсальными инструментами для изучения выхода твердых частиц Т-клеток, стимулируемых модельными мембранами APC. Гибкость метода позволяет воссоздать сложные и редукционистские мембранные композиции для изучения влияния лигандов и их сигналов на секрецию tSV и частиц суп...

Иммунологический синапс (ИС) представляет собой ключевую молекулярную структуру, образованную на границе раздела клеток, участвующих в физическом контакте, которая облегчает регулируемый обмен юкстракриновой информацией. Различные ИС были описаны в литературе, и растущее количество доказательств предполагает, что эти молекулярные центры являются сохраненной особенностью клеточных сетей. Различные иммунные клетки, включая В-клетки, естественные клетки-киллеры, дендритные клетки, макрофаги и Т-клетки, обмениваются информацией посредством сборки короткоживущих контактов1. Мультиомные исследования продвигают понимание новых подмножеств лейкоцитов и стромальных клеток, управляющих патогенными клеточными сетями и экспрессирующих поверхностные белки с неизвестными функциями. Как синтетические ПТР, BSLB позволяют непосредственно исследовать функциональную роль отдельных белков в интеграции активирующих сигналов, а именно антигенов и костимуляции/корепрессии, Т-клетками и результирующего высвобождения эффекторных частиц, называемых сигнальной четверкой.
В этом документе описываются протоколы и критические технические моменты, которые следует учитывать при использовании BSLB для имитации состава поверхности модельных БТР. Протоколы количественного измерения иммунных рецепторов и других поверхностных белков на АПК представлены вместе с протоколом восстановления синтетических АТР, содержащих эти измеренные количества. Затем этапы, необходимые для кокультурирования Т-клеток и BSLB, представлены вместе с протоколом количественного измерения транссинаптического переноса частиц с помощью проточной цитометрии. Наиболее примечательно, что BSLB облегчают изучение популяции tSV, полученных из плазматической мембраны, называемых синаптическими эктосомами (SE). Т-клеточные антигенные рецепторы (TCR+) SE выделяются в ответ на триггер TCR2 и эффективно захватываются BSLBs3, представляя собой отличное считывание для оценки агонистических свойств антигенов и смоделированного состава мембраны. CD63+ экзосомы и частицы супрамолекулярной атаки (SMAP) также высвобождаются стимулированными Т-клетками и захватываются BSLB. Они могут быть использованы в качестве дополнительных показаний активации и результирующей экзоцитарной и литической секреции гранул Т-клетками. Мобилизация экзоцитарных везикул к взаимодействующему полюсу Т-клетки также облегчает направленное высвобождение цитокинов, таких как IL-2, IFN-γ и IL-10 в ответ на активацию4,5,6,7,8. Хотя Т-клеточные высвобождаемые цитокины также могут быть обнаружены на BSLB, в настоящее время разрабатывается более специализированное исследование для подтверждения количественного анализа высвобождения цитокинов в иммунологическом синапсе.
Чтобы выяснить, как специфические мембранные композиции влияют на синаптический выход Т-клеток, необходимо определить физиологическую плотность компонента мембраны-мишени. Количественные оценки белков клеточной поверхности на основе проточной цитометрии являются важным шагом в этом протоколе и требуют: 1) использования антител с известным количеством фторхромов на антитело (F / P) и 2) эталонных шариков, обеспечивающих стандартную ссылку для интерполяции молекул фторхрома из измеренных средних интенсивностей флуоресценции (MFI).
Эти эталонные стандарты состоят из пяти популяций шариков, каждая из которых содержит все большее число эквивалентных растворимых флуорохромов (MESF), которые охватывают динамический диапазон произвольного обнаружения флуоресценции. Эти стандартные популяции дают дискретные пики флуоресценции, облегчая преобразование произвольных флуоресцентных единиц в MESF путем простой линейной регрессии. Полученные MESF затем используются вместе со значениями F/P антител для расчета среднего числа связанных молекул на клетку (или BSLB на более поздних этапах). Применение оценочных площадей поверхности клеток к среднему числу обнаруженных молекул позволяет рассчитать физиологические плотности в виде молекул/мкм2. Этот протокол количественной оценки также может быть адаптирован для измерения плотности белка на Т-клетках и биохимического восстановления мембранных композиций, опосредующих образование гомотипических синапсов Т-клеток (т.е. Т-Т-синапсов9). При необходимости валентность связывания антител может быть дополнительно оценена с помощью рекомбинантных мишеней, меченных известным количеством фторхромов на молекулу. Затем валентность, связывающая антитела, может быть рассчитана для одной и той же популяции BSLB путем одновременного сравнения количества связанных флуоресцентных белков и количественных антител (с использованием двух различных стандартов количественной оценки фторхромов и MESF).
Восстановление мембран APC требует сборки поддерживаемых липидных бислоев (SLB) на бисерах кремнезема1. Запасы липосом, содержащие различные виды фосфолипидов, могут быть использованы для формирования универсальной липидно-двухслойной матрицы, позволяющей закреплять рекомбинантные белки с различной химией связывания (получение липосом подробно описано в 10). Как только физиологическая плотность (или плотности) соответствующего лиганда «на клетках» определена, тот же протокол проточной цитометрии адаптируется для оценки концентрации рекомбинантного белка, необходимой для покрытия BSLB целевой физиологической плотностью. Две различные анкерные системы могут использоваться как в комбинации, так и по отдельности.
Во-первых, SLB, содержащий конечные 12,5 моль% Ni2+-содержащих фосфолипидов, достаточен для обеспечения примерно 10 000 сайтов связывания His-tag на квадратный микрон10 и хорошо работает для украшения BSLB большинством коммерчески доступных белков, физиологическая плотность которых не превышает эту максимальную нагрузочную способность. Вторая система загрузки использует биотинсодержащие фосфолипиды (в виде моля%) для загрузки биотинилированных анти-CD3e Fab (или мономеров HLA / MHC) через мосты стрептавидина. Комбинация этих двух методов декорирования BSLB позволяет гибко адаптировать BSLB как синтетические БТР. Для очень сложных поверхностных композиций APC моль% фосфолипидов и белков может быть увеличен для загрузки столько белков, сколько требуется для рассматриваемого вопроса. После определения рабочих концентраций белков и моль% биотинилированных фосфолипидов BSLB могут быть собраны для опроса синаптического выхода Т-клеток с помощью многопараметрической проточной цитометрии.

preparation of bead-supported lipid bilayers to study the particulate output of t cell immune synapses

Антигенпрезентирующие клетки (АПК) представляют три активирующих сигнала для Т-клеток, участвующих в физическом контакте: 1) антиген, 2) костимуляция / корепрессия и 3) растворимые цитокины. Т-клетки высвобождают два вида эффекторных частиц в ответ на активацию: транссинаптические везикулы (tSV) и частицы супрамолекулярной атаки, которые переносят межклеточные мессенджеры и опосредуют цитотоксичность соответственно. Эти сущности быстро усваиваются БТП, участвующими в физическом контакте с Т-клетками, что делает их характеристику сложной. В этой статье представлен протокол для изготовления и использования липидных бислоев с поддержкой бисера (BSLB) в качестве антигенпрезентирующих клеточных (APC) миметиков для захвата и анализа этих транссинаптических частиц. Также описаны протоколы абсолютных измерений плотности белка на клеточных поверхностях, восстановления BSLB с такими физиологическими уровнями и процедуры проточной цитометрии для отслеживания высвобождения синаптических частиц Т-клетками. Этот протокол может быть адаптирован для изучения влияния отдельных белков, сложных смесей лигандов, детерминант вирулентности патогенов и лекарств на эффекторный выход Т-клеток, включая хелперные Т-клетки, цитотоксические Т-лимфоциты, регуляторные Т-клетки и химерные антиген-рецептор-экспрессирующие Т-клетки (CART).

FCM для абсолютной количественной оценки белка на поверхности клетки Восстановление BSLB, представляющих физиологические плотности лигандов, требует оценки общей плотности белка на моделируемом подмножестве клеток. Для восстановления BSLB включите любой соответствующий лиган...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses at JoVE.com

Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses

Здесь мы представляем протокол поэтапного восстановления синтетических антигенпрезентирующих клеток с использованием липидных бислоев, поддерживаемых бисером, и их использование для опроса синаптического выхода из активированных Т-клеток.

Подготовка липидных бислоев, поддерживаемых бисером, для изучения выхода твердых частиц иммунных синапсов Т-клеток

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) ...

Изучение выхода иммунного синапса было ограничено в основном микроскопическими методами. BSLB расширили наш репертуар инструментов, которые могут быть использованы для изучения выхода иммунных синапсов Т-клеток, включая проточную цитометрию, микроскопию, протеомику и технологии секвенирования РНК. Таким образом, BSLB могут быть использованы в широком спектре вопросов иммунологии и в определении состава и биохимической регуляции выхода Т-клеток.Это включает, например, изучение химерных антигенных рецепторов, препаратов, которые ингибируют специфические сигнальные пути, или генетическую абляцию генов, представляющих интерес. Одним из наиболее важных аспектов этого протокола является оптимизация калибровки белка и многоцветной проточной цитометрической панели, необходимой для отслеживания транссинаптических частиц, представляющих интерес. Это требует систематической итерации концентраций белка, концентраций антител и настроек приборов.Начните с разбавления одного микролитра бисерного раствора 1000 микролитрами PBS. Подсчитайте бусины с помощью камеры гемоцитометра и рассчитайте их концентрацию на миллилитр. Затем рассчитайте объем кварцевых шариков, необходимый для 500 000 конечных BSLB на точку титрования.Перенесите необходимый объем шариков кремнезема в стерильную 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку. Трижды вымойте кварцевые шарики одним миллилитром стерильного PBS и центрифугируйте бусины. Приготовьте три тома липосомной мастер-смеси, содержащей конечные 12,5-моль процента никельсодержащих фосфолипидов.Используйте смесь липосом для повторного суспендирования промытых кварцевых шариков. Затем аккуратно перемешайте его, пипетируя вверх и вниз половину общего объема. Используя стерильный метод, добавьте газообразный аргон или азот в трубку, чтобы вытеснить воздух и защитить липиды от окисления во время смешивания.Добавьте аргон к 0,4-миллимолярным липидным запасам. Храните запасы и манипулируйте ими, используя стерильную технику. Переместите BSLB в вертикальный смеситель и перемешивайте в течение 30 минут при комнатной температуре, используя орбитальное перемешивание при 10 оборотах в минуту.Затем раскрутите шарики центрифугированием в течение 15 секунд при комнатной температуре на настольной мини-центрифуге. Блокируют образующиеся BSLB путем добавления одного миллилитра 5% BSA, содержащего 100-микромоляр сульфата никеля, для насыщения NTA-сайтов на BSLB. Промыть три раза с использованием буфера HBS-HSA для удаления избыточного блокирующего раствора.Возьмите новую U-образную или V-нижнюю 96-луночную пластину и приготовьте двукратное серийное разведение белков. Повторно суспендируют подготовленные BSLB в объеме таким образом, чтобы 100 микролитров буфера HBS-HSA содержали 500 000 BSLB. Затем возьмите еще одну U-образную или V-донную 96-луночную пластину и перенесите 100 микролитров подвески BSLB в скважины таким образом, чтобы каждая скважина получала 500 000 BSBL.Открутите вторую пластину при комнатной температуре в течение двух минут при 300x G. Отбросьте супернатант и перенесите 100-микролитровые объемы с пластины титрования белка на пластину, содержащую осажденные BSLB. Осторожно перемешайте, избегая образования избыточных пузырьков при пипетке. Используйте алюминиевую фольгу для защиты от света и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут при 1000 оборотах в минуту.Затем вымойте пластину три раза, добавив буфер HBS-HSA к пластине, и открутите ее при комнатной температуре в течение двух минут при 300x G. Подсчитайте ячейки после промывки. Затем разбавляют их до конечной концентрации 2,5 миллиона на миллилитр с помощью синаптической переносной пробирной среды. После того, как BSLB будут загружены белковой смесью, дважды промыть BSLB буфером HBS-HSA, чтобы удалить лишние несвязанные белки.Повторное суспендирование 500 000 BSLB на скважину в 200 микролитрах буфера HBS-HSA. Перенесите 100 микролитров BSLB на скважину на новую U-образную 96-луночную пластину, чтобы сделать дубликат, так что конечное количество BSLB на скважину составляет 250 000. Открутите BSLB при 300x G в течение двух минут при комнатной температуре.Отбросьте супернатант, а затем повторно суспендируйте BSLB, используя 100 микролитров суспензии Т-клеток. Осторожно перемешайте, чтобы предотвратить образование пузырьков. Инкубируйте кокультуры в течение 90 минут при температуре 37 градусов Цельсия.Защитите клетки от света и охладите сокультуры, предварительно инкубируя их при комнатной температуре в течение минимум 15 минут. Центрифугируйте кокультуры при комнатной температуре в течение пяти минут при 500x G.Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте кокультуры в 2% BSA PBS без ионов кальция и магния при комнатной температуре для блокировки. Поместите клетки на лед на 45 минут и защитите их от света.Приготовьте смесь антител с использованием ледяного 0,22-микрометрового фильтрованного 2% BSA и PBS в качестве буфера окрашивания. Этот мастер-микс обеспечит дополнительную блокировку. Вращайте со-культуры при 500x G в течение пяти минут и четырех градусов цельсия.Отбросьте супернатанты, а затем используйте многоканальную пипетку для повторного суспендирования клеток в мастер-смеси окрашивания, содержащей оптимизированные концентрации антител. Включают изотип-меченые клетки и BSLB, флуоресцентные и нефлуоресцентные BSLB, а также клетки и BSLB, окрашенные отдельно. Осторожно перемешайте, пипетируя вверх и вниз половину объема.Насиживайте в течение 30 минут на льду и защищайте их от света. Промывайте ячейки и BSLB дважды, используя ледяной 2% BSA PBS. Вращайте их вниз при 500x G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.После центрифугирования проверьте кокультуру, отложенную на дне скважин. Затем повторно суспендируют промытые кокультуры в 100 микролитрах PBS и сразу же приобретают. Активируйте шкалу журнала для бокового рассеянного света и параметр времени пролета для боковых и передних рассеянных огней.Приобретите стандарты MESF, гарантируя, что как тусклые, так и самые яркие популяции попадают в линейный диапазон прибора. Затем приобретите компенсационные образцы, рассчитайте компенсацию и примените матрицу компенсации к эксперименту. Приобретите и сохраните не менее 20 000 стандартов MESF для каждого канала количественной оценки.Избегайте использования жидкости FACS или аналогичных бусинам MESF, так как они содержат соли и спирты, которые разрушают флуорохромы, что приводит к более широким пикам флуоресценции и высокой погрешности. Для сбора с использованием высокопроизводительных пробоотборников установите для сбора приборов значение Standard, установите отбор проб на 80 микролитров. Расход пробы от двух до трех микролитров в секунду, объем смешивания образца при 50 микролитрах, смешивание образцов 150 микролитров в секунду и смешивание на скважину от трех до пяти.Приобретите не менее 10 000 одиночных BSLB на образец. Наконец, экспортируйте файлы FCS. Приведен пример количественных измерений проточной цитометрии ICAM-1 на поверхности тонзиллярных В-клеток и хелперных Т-клеток.Репрезентативные изображения описывают стратегию гатинга для анализа одиночных В-клеток CXCR5 и фолликулярно-хелперных Т-клеток, выделенных из небных миндалин человека. Эта стратегия последовательного измерения определяет отдельные живые события в окне непрерывного сбора. Здесь показаны дублеты, экспрессия icam-1 на клеточной поверхности по сравнению с контролем FMO и контролем FMO, помеченными соответствующими изотипами популяций.Здесь показаны измерение МФО из различных стандартных популяций MESF в наложенных гистограммах популяций MESF. Значения представляют собой МФО для каждой из пяти популяций MESF. Здесь представлена линейная регрессия MESF по cMFI для популяций MESF.Наклон извлекает MESF, связанный с клетками из данных FCM ICAM-1 на поверхности тонзиллярных В-клеток в TFH. Преобразование в абсолютные молекулярные плотности следует этим простым математическим операциям. Репрезентативные изображения показывают анализ проточной цитометрии BSLB, восстановленных с повышенной плотностью рекомбинантных мономерных гистидинов ICAM-1 12.Здесь показаны регрессионные анализы эталонной концентрации ICAM-1 по измеренной плотности. Наклон используется для расчета целевых концентраций белка для достижения плотности клеток. Блок-схемы показывают критические этапы совместного культивирования Т-клеток с BSLB, воссоздания модельных мембран при последующем измерении переноса частиц с помощью проточной цитометрии.Стратегия определения отдельных BSLB и ячеек в окне непрерывного сбора показана здесь. Одним из наиболее важных аспектов этого протокола является то, что для поддержания воспроизводимости результатов каждый раз, когда вы изменяете запасы белка или липидов, вам необходимо выполнять новый калибровочный анализ. Чтобы обнаружить новые эффективные молекулы, секретируемые различными подмножествами Т-клеток, BSLB могут быть дополнительно выделены путем флуоресцентно-активированной сортировки клеток, подвергающейся транскриптомному и протеомному анализу.Наши коллеги из Оксфордского университета использовали эту технологию для изучения и демонстрации новых взаимодействий рецептор-лиганд, а также для изучения влияния генетических абляций на выход иммунного синапса Т-клеток.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Конкурентные Homing Анализы по изучению тропических Гут-Т-клеток миграции

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Введение в паразитических наездников<em&gt; Drosophila</em&gt; И противопаразитарной иммунного ответа

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Изображений ВИЧ-1 Envelope-индуцированной Вирусологические Synapse и сигнализации на синтетической Бислои липидов

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

Выделение и Th17 дифференцировки наивных CD4 Т-лимфоцитов

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Трансплантация кожи хвоста изучать Аллогенная лимфоцитов CD4 ответов у мышей

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Мышь наивного CD4<sup&gt; +</sup&gt; Т-клеток Выделение и<em&gt; В пробирке</em&gt; Дифференциация в Т-клеточных подмножеств

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Методы для изучения липидных изменений в нейтрофилах и последующее образование нейтрофильных внеклеточных ловушек

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Ретровирусное трансдукция Т-хелперы как генетический подход к изучению механизмов, контролирующих их дифференцировку и функции

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Всасывания блистер протокол для изучения человеческий Т-клеточный вспомнить ответы в естественных условиях

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...