Name: preparation of bead-supported lipid bilayers to study the particulate output of t cell immune synapses
Uploaded: 2022-04-01T13:30:00
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Estamos agradecidos con los miembros de nuestro laboratorio y la comunidad del Instituto Kennedy de Reumatología por las discusiones científicas constructivas, especialmente con nuestro gerente de instalaciones de citometría de flujo Jonathan Webber. Este trabajo fue financiado por Wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z, la ERC Advanced Grant (SYNECT AdG 670930) y el Kennedy Trust for Rheumatology Research (KTRR) (los tres a MLD). PFCD fue apoyado por EMBO Long-Term Fellowship (ALTF 1420-2015, en conjunto con la Comisión Europea (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) y Marie Sklodowska-Curie Actions) y una beca Oxford-Bristol Myers Squibb.

1. Medición de densidades de proteínas de la superficie celular con citometría de flujo cuantitativa
<ol><li>Preparar un tampón de citometría de flujo humano (hFCB) filtrado con 0,22 μm añadiendo EDTA (a una concentración final de 2 mM) y suero AB humano (hasta un 10% final) a solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4 (ver Tabla 1). Filtre la solución con una unidad de filtro de poros de 0,22 μm para eliminar las impurezas séricas y almacenarla a 4 °C.</...

<ol>
	<li>Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+to+reconstitute+immune+cell+signaling.">Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling.</a> FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).</li><li>Choudhuri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+release+of+T-cell-receptor-enriched+microvesicles+at+the+immunological+synapse.">Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological synapse.</a> Nature. 507 (7490), 118-123 (2014).</li><li>Saliba, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+structure+of+synaptic+ectosomes+exporting+antigen+receptor+linked+to+functional+CD40+ligand+from+helper+T+cells.">Composition and structure of synaptic ectosomes exporting antigen receptor linked to functional CD40 ligand from helper T cells.</a> elife. 8, 47528 (2019).</li><li>Barcia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+polarization+of+IFN-gamma+at+Kupfer+and+non-Kupfer+immunological+synapses+during+the+clearance+of+virally+infected+brain+cells.">In vivo polarization of IFN-gamma at Kupfer and non-Kupfer immunological synapses during the clearance of virally infected brain cells.</a> Journal of Immunology. 180 (3), 1344-1352 (2008).</li><li>Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+use+two+directionally+distinct+pathways+for+cytokine+secretion.">T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion.</a> Nature Immunology. 7 (3), 247-255 (2006).</li><li>Kupfer, A., Mosmann, T. R., Kupfer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+expression+of+cytokines+in+cell+conjugates+of+helper+T+cells+and+splenic+B+cells.">Polarized expression of cytokines in cell conjugates of helper T cells and splenic B cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (3), 775-779 (1991).</li><li>Kupfer, H., Monks, C. R., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+splenic+B+cells+that+bind+to+antigen-specific+T+helper+(Th)+cells+and+face+the+site+of+cytokine+production+in+the+Th+cells+selectively+proliferate:+immunofluorescence+microscopic+studies+of+Th-B+antigen-presenting+cell+interactions.">Small splenic B cells that bind to antigen-specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate: immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen-presenting cell interactions.</a> Journal of Experimental Medicine. 179 (5), 1507-1515 (1994).</li><li>Reichert, P., Reinhardt, R. L., Ingulli, E., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+in+vivo+identification+of+TCR+redistribution+and+polarized+IL-2+production+by+naive+CD4+T+cells.">Cutting edge: in vivo identification of TCR redistribution and polarized IL-2 production by naive CD4 T cells.</a> Journal of Immunology. 166 (7), 4278-4281 (2001).</li><li>Gerard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+T+cell-T+cell+synaptic+interactions+drive+the+differentiation+of+protective+CD8++T+cells.">Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8+ T cells.</a> Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).</li><li>Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+planar+bilayers+for+study+of+the+immunological+synapse.">Supported planar bilayers for study of the immunological synapse.</a> Current Protocols in Immunology. , (2007).</li><li>Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2021)</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+compensation+for+flow+cytometry:+visualization+artifacts,+limitations,+and+caveats.">Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats.</a> Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).</li><li>Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+T+cells+is+induced+by+binding+to+nickel-chelating+lipids+in+supported+lipid+bilayers.">Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers.</a> Frontiers in Physiology. 11, 613367 (2020).</li><li>Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+spillover+spreading+for+comparing+instrument+performance+and+aiding+in+multicolor+panel+design.">Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design.</a> Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).</li><li>C&#233;spedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+antigen-presenting+cells+reveal+the+diversity+and+functional+specialisation+of+extracellular+vesicles+composing+the+fourth+signal+of+T+cell+immunological+synapses.">Synthetic antigen-presenting cells reveal the diversity and functional specialisation of extracellular vesicles composing the fourth signal of T cell immunological synapses.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Yoon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+non-activated+lymphocytes+using+three-dimensional+refractive+index+tomography+and+machine+learning.">Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distributions+of+autofluorescence+after+compensation:+Be+panglossian,+fret+not.">Distributions of autofluorescence after compensation: Be panglossian, fret not.</a> Cytometry A. 89 (4), 398-402 (2016).</li><li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+controls,+instrument+setup,+and+the+determination+of+positivity.">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li><li>Balint, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+attack+particles+are+autonomous+killing+entities+released+from+cytotoxic+T+cells.">Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells.</a> Science. 368 (6493), 897-901 (2020).</li><li>Cespedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+expression+of+the+hRSV+nucleoprotein+impairs+immunological+synapse+formation+with+T+cells.">Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).</li></ol>

Los BSLB son herramientas versátiles para estudiar la producción de partículas de células T estimuladas con membranas modelo APC. La flexibilidad del método permite la reconstitución de composiciones de membrana complejas y reduccionistas para estudiar los efectos de los ligandos y sus señales sobre la secreción de tSVs y partículas de ataque supramolecular y sus componentes. Hemos probado esta tecnología en varias células T, incluyendo TH, CTL, Tregs y CART15 preactivadas. Este protoco...

La sinapsis inmunológica (IS) es una estructura molecular fundamental formada en la interfaz de las células que participan en contacto físico que facilita el intercambio regulado de información de yuxtracrina. Se han descrito diferentes IS en la literatura, y un creciente cuerpo de evidencia sugiere que estos centros moleculares son una característica conservada de las redes celulares. Varias células inmunes, incluidas las células B, las células asesinas naturales, las células dendríticas, los macrófagos y las células T, intercambian información a través del ensamblaje de contactos de corta duración1. Los estudios multiómicos están avanzando en la comprensión de nuevos subconjuntos de leucocitos y células estromales que impulsan las redes celulares patógenas y expresan proteínas de superficie con funciones desconocidas. Como APC sintéticos, los BSLB permiten la investigación directa del papel funcional de las proteínas individuales en la integración de señales activadoras, a saber, antígenos y coestimulación/ corepresión, por parte de las células T y la liberación resultante de partículas efectoras denominadas señal cuatro.
Este documento describe los protocolos y los puntos técnicos críticos a considerar al usar BSLB para imitar la composición superficial de los APC modelo. Los protocolos para la medición cuantitativa de los receptores inmunes y otras proteínas de superficie en los APC se presentan junto con el protocolo para la reconstitución de apces sintéticos que contienen estas cantidades medidas. Luego, se presentan los pasos necesarios para coculturizar células T y BSLB junto con el protocolo para la medición cuantitativa de la transferencia transsináptica de partículas mediante citometría de flujo. Lo más notable es que los BSLB facilitan el estudio de una población de tSV derivada de la membrana plasmática denominada ectosomas sinápticos (SE). Los SE enriquecidos con receptores de antígenos de células T (TCR+) se eliminan en respuesta a la activación de TCR2 y son capturados eficientemente por BSLBs3, lo que representa una excelente lectura para evaluar las propiedades agonísticas de los antígenos y la composición de la membrana modelada. Los exosomas CD63+ y las partículas de ataque supramolecular (SMAP) también son liberados por las células T estimuladas y capturados por los BSLB. Se pueden utilizar como lecturas adicionales de la activación y la secreción de gránulos exocíticos y líticos resultante por las células T. La movilización de vesículas exocitíticas al polo que interactúa de la célula T también facilita la liberación direccional de citoquinas, como IL-2, IFN-γ e IL-10 en respuesta a la activación4,5,6,7,8. Aunque las citoquinas liberadas por células T también se pueden detectar en BSLB, actualmente se está desarrollando un estudio más dedicado para validar el análisis cuantitativo de la liberación de citoquinas en la sinapsis inmunológica.
Para interrogar cómo las composiciones específicas de la membrana influyen en la producción sináptica de las células T se requiere definir la densidad fisiológica del componente de membrana objetivo. Las cuantificaciones basadas en citometría de flujo de proteínas de superficie celular son un paso esencial en este protocolo y requieren: 1) el uso de anticuerpos con números conocidos de fluorocromos por anticuerpo (F / P), y 2) perlas de referencia que proporcionen una referencia estándar para interpolar moléculas de fluorocromo a partir de intensidades de fluorescencia medias (IMF) medidas.
Estos estándares de referencia consisten en cinco poblaciones de perlas, cada una de las cuales contiene un número creciente de fluorocromos solubles equivalentes (MESF), que abarcan el rango dinámico de detección de fluorescencia arbitraria. Estas poblaciones estándar producen picos de fluorescencia discretos, lo que facilita la conversión de unidades de fluorescencia arbitrarias en MESF mediante regresión lineal simple. Los MESF resultantes se utilizan junto con los valores de anticuerpos F / P para calcular el número promedio de moléculas unidas por célula (o BSLB en pasos posteriores). La aplicación de las áreas de superficie celular estimadas al número promedio de moléculas detectadas permite el cálculo de densidades fisiológicas como moléculas/μm2. Este protocolo de cuantificación también se puede adaptar a la medición de densidades de proteínas en células T y a la reconstitución bioquímica de composiciones de membrana que median la formación de sinapsis homotípicas de células T (es decir, sinapsis T-T9). Si es necesario, la valencia de la unión a anticuerpos se puede estimar aún más mediante el uso de objetivos recombinantes marcados con números conocidos de fluorocromos por molécula. Luego, la valencia de unión a anticuerpos se puede calcular para la misma población de BSLB comparando simultáneamente el número de proteínas fluorescentes unidas y anticuerpos de cuantificación (utilizando dos fluorocromos de cuantificación diferentes y estándares MESF).
La reconstitución de membranas APC requiere el ensamblaje de bicapas lipídicas soportadas (SLB) sobre perlas de sílice1. Las existencias de liposomas que contienen diferentes especies de fosfolípidos se pueden aprovechar para formar una matriz lipídica-bicapa versátil, lo que permite el anclaje de proteínas recombinantes con diferente química de unión (la preparación de los liposomas se detalla en 10). Una vez que se define la densidad fisiológica (o densidades) del ligando relevante "en las células", se adapta el mismo protocolo de citometría de flujo para estimar la concentración de proteína recombinante necesaria para recubrir los BSLB con la densidad fisiológica objetivo. Se pueden utilizar dos sistemas de anclaje diferentes en combinación o por separado.
En primer lugar, el SLB que contiene un 12,5 mol% final de fosfolípidos que contienen Ni2+ es suficiente para proporcionar aproximadamente 10.000 sitios de unión a la etiqueta His por micra cuadrada10 y funciona bien para decorar los BSLB con la mayoría de las proteínas disponibles comercialmente cuyas densidades fisiológicas no exceden esta capacidad de carga máxima. El segundo sistema de carga aprovecha los fosfolípidos que contienen biotina (como mol%) para cargar anti-CD3e Fab biotinilado (o monómeros HLA / MHC) a través de puentes de estreptavidina. La combinación de estos dos métodos de decoración BSLB permite la adaptación flexible de BSLB como APC sintéticos. Para composiciones superficiales de APC altamente complejas, el mol% de fosfolípidos y proteínas se puede aumentar para cargar tantas proteínas como la pregunta en cuestión requiera. Una vez que se definen las concentraciones de trabajo de proteínas y mol% de fosfolípidos biotinilados, los BSLB se pueden ensamblar para interrogar la salida sináptica de las células T con citometría de flujo multiparamétrica.

preparation of bead-supported lipid bilayers to study the particulate output of t cell immune synapses

Las células presentadoras de antígenos (APC) presentan tres señales activadoras a las células T que participan en contacto físico: 1) antígeno, 2) coestimulación/corepresión y 3) citoquinas solubles. Las células T liberan dos tipos de partículas efectoras en respuesta a la activación: vesículas transsinápticas (tSV) y partículas de ataque supramolecular, que transfieren mensajeros intercelulares y median la citotoxicidad, respectivamente. Estas entidades son rápidamente internalizadas por apces que participan en contacto físico con células T, lo que hace que su caracterización sea desalentadora. Este artículo presenta el protocolo para fabricar y utilizar bicapas lipídicas soportadas por perlas (BSLB) como miméticas de células presentadoras de antígenos (APC) para capturar y analizar estas partículas transsinápticas. También se describen los protocolos para las mediciones absolutas de densidades de proteínas en las superficies celulares, la reconstitución de BSLB con tales niveles fisiológicos y el procedimiento de citometría de flujo para rastrear la liberación de partículas sinápticas por las células T. Este protocolo se puede adaptar para estudiar los efectos de proteínas individuales, mezclas de ligandos complejos, determinantes de virulencia de patógenos y fármacos en la producción efectora de las células T, incluidas las células T auxiliares, los linfocitos T citotóxicos, las células T reguladoras y las células T que expresan el receptor de antígenos quiméricos (CART).

FCM para la cuantificación absoluta de proteínas en la superficie celular La reconstitución de BSLB que presentan densidades fisiológicas de ligandos requiere la estimación de densidades totales de proteínas en el subconjunto celular modelado. Para reconstituir los BSLB, incluya cualquier ligando relevante que se espera que desempeñe un papel en el eje de señalización de interés junto con las proteínas que apoyan la adhesión y la interacción funcional entre BSLB y las células, como ICAM-...

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Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses

Aquí presentamos el protocolo para la reconstitución escalonada de células presentadoras de antígenos sintéticos utilizando bicapas lipídicas soportadas por perlas y su uso para interrogar la salida sináptica de las células T activadas.

Preparación de bicapas lipídicas soportadas por perlas para estudiar la producción de partículas de las sinapsis inmunes de células T

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) ...

El estudio de la producción de la sinapsis inmune se ha restringido principalmente a métodos microscópicos. Los BSLB han ampliado nuestro repertorio de herramientas que se pueden utilizar para estudiar la producción de sinapsis inmunes de células T, incluida la citometría de flujo, la microscopía, la proteómica y las tecnologías de secuenciación de ARN. Como tal, los BSLB se pueden utilizar en una amplia variedad de preguntas de inmunología y en la identificación de la composición y la regulación bioquímica de la producción de células T.Esto incluye, por ejemplo, el estudio de receptores de antígenos quiméricos, medicamentos que inhiben vías de señalización específicas o la ablación genética de genes de interés. Uno de los aspectos más críticos de este protocolo es optimizar las calibraciones de proteínas y el panel de citometría de flujo multicolor necesario para el seguimiento de la partícula transsináptica de interés. Esto requiere la iteración sistemática de las concentraciones de proteínas, las concentraciones de anticuerpos y la configuración del instrumento.Comience diluyendo un microlitro de solución de perlas con 1, 000 microlitros de PBS. Cuente las cuentas usando una cámara hemocitómetro y calcule su concentración por mililitro. Luego, calcule el volumen de cuentas de sílice necesarias para 500, 000 BSLB finales por punto de titulación.Transfiera el volumen requerido de perlas de sílice a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros. Lave las cuentas de sílice tres veces con un mililitro de PBS estéril y centrifugue las perlas. Prepare tres volúmenes de mezcla maestra de liposomas que contengan un porcentaje final de 12.5 moles de fosfolípidos que contienen níquel.Use la mezcla maestra de liposomas para resuspendir las cuentas de sílice lavadas. Luego, mézclelo suavemente canalizando hacia arriba y hacia abajo la mitad del volumen total. Usando una técnica estéril, agregue argón o gas nitrógeno al tubo para desplazar el aire y proteger los lípidos de la oxidación durante la mezcla.Agregue argón a las reservas de lípidos 0.4 milimolares. Almacenar el stock y manipular mediante una técnica estéril. Mueva los BSLB al mezclador vertical y mezcle durante 30 minutos a temperatura ambiente utilizando la mezcla orbital a 10 RPM.Luego, gire las cuentas centrifugando durante 15 segundos a temperatura ambiente en una minicentrífuga de sobremesa. Bloquee los BSLB formados agregando un mililitro de BSA al 5% que contenga 100 micromolares de sulfato de níquel para saturar los sitios de NTA en los BSLB. Lave tres veces con tampón HBS-HSA para eliminar el exceso de solución de bloqueo.Tome una nueva placa de 96 pocillos con fondo en U o con fondo en V y prepare diluciones en serie dobles de las proteínas. Resuspender los BSLB preparados en un volumen tal que 100 microlitros de tampón HBS-HSA contengan 500, 000 BSLB. Luego, tome otra placa de 96 pocillos con fondo en U o V y transfiera 100 microlitros de la suspensión BSLB a los pozos de tal manera que cada pozo reciba 500, 000 BSBL.Gire la segunda placa a temperatura ambiente durante dos minutos a 300x G.Deseche el sobrenadante y transfiera volúmenes de 100 microlitros de la placa de titulación de proteínas a la placa que contiene los BSLB sedimentados. Mezcle suavemente, evitando el exceso de generación de burbujas mientras pipetea. Use papel de aluminio para protegerlo de la luz e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos a 1, 000 RPM.Luego, lave la placa tres veces agregando tampón HBS-HSA a la placa y gírela hacia abajo a temperatura ambiente durante dos minutos a 300x G.Cuente las células después del lavado. Luego, diluirlos a una concentración final de 2.5 millones por mililitro usando un medio de ensayo de transferencia sináptica. Una vez que los BSLB estén cargados con la mezcla de proteínas, lave los BSLB dos veces con tampón HBS-HSA para eliminar el exceso de proteínas no unidas.Resuspend 500, 000 BSLB por pozo en 200 microlitros de tampón HBS-HSA. Transfiera 100 microlitros de BSLB por pozo a una nueva placa de 96 pocillos con fondo en U para hacer un duplicado, de modo que la cantidad final de BSLB por pozo sea de 250, 000. Gire los BSLB a 300x G durante dos minutos a temperatura ambiente.Deseche el sobrenadante y luego vuelva a suspender los BSLB utilizando 100 microlitros de suspensión de células T. Mezclar suavemente para evitar la formación de burbujas. Incubar los cocultivos durante 90 minutos a 37 grados centígrados.Proteja las células de la luz y enfríe los cocultivos incubándolos primero a temperatura ambiente durante un mínimo de 15 minutos. Centrifugar los cocultivos a temperatura ambiente durante cinco minutos a 500x G.Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los cocultivos en PBS BSA libre de iones de calcio y magnesio al 2% a temperatura ambiente para su bloqueo. Coloque las células en hielo durante 45 minutos y protéjalas de la luz.Prepare la mezcla maestra de anticuerpos utilizando BSA y PBS 2% filtrados con 0,22 micrómetros como tampón de tinción. Esta mezcla maestra proporcionará un bloqueo adicional. Gira hacia abajo los cocultivos a 500x G durante cinco minutos y cuatro grados centígrados.Deseche los sobrenadantes y luego use una pipeta multicanal para resuspendir las células en la mezcla maestra de tinción que contiene concentraciones optimizadas de anticuerpos. Incluye células marcadas con isotipo y BSLB, BSLB fluorescentes y no fluorescentes, y células y BSLB teñidas solas. Mezclar suavemente canalizando hacia arriba y hacia abajo la mitad del volumen.Incubar durante 30 minutos sobre hielo y protegerlos de la luz. Lave las células y los BSLB dos veces con PBS BSA 2% frío y helado. Hágalos girar a 500x G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Después de la centrifugación, verifique el cocultivo sedimentado en el fondo de los pozos. Luego, vuelva a suspender los cocultivos lavados en 100 microlitros de PBS y adquiera inmediatamente. Active la escala de registro para la luz dispersada lateralmente y el parámetro de tiempo de vuelo para las luces dispersas laterales y delanteras.Adquiera los estándares MESF, asegurando que tanto las poblaciones tenues como las más brillantes caigan en el rango lineal del instrumento. Luego, adquiera muestras de compensación, calcule la compensación y aplique la matriz de compensación al experimento. Adquiera y guarde un mínimo de 20,000 estándares MESF totales para cada canal de cuantificación.Evite el uso de líquido de vaina FACS o similar a las perlas MESF resuspend, ya que contienen sales y alcoholes que destruirán los fluorocromos, lo que provocará picos de fluorescencia más amplios y un alto error. Para la adquisición utilizando muestreadores de alto rendimiento, establezca la adquisición de instrumentos en Estándar, establezca la adquisición de muestras en 80 microlitros. Caudal de muestreo entre dos y tres microlitros por segundo, volumen de mezcla de muestra a 50 microlitros, mezcla de muestra de 150 microlitros por segundo y mezcla por pozo entre tres y cinco.Adquirir un mínimo de 10.000 BSLB individuales por muestra. Finalmente, exporte los archivos FCS. Aquí se muestra un ejemplo de mediciones cuantitativas de citometría de flujo de ICAM-1 en la superficie de las células B amigdalares y las células T auxiliares.Las imágenes representativas describen la estrategia de gating para analizar células B CXCR5 individuales y células T foliculares auxiliares aisladas de amígdalas palatinas humanas. Esta estrategia de cierre secuencial identifica eventos en vivo individuales dentro de la ventana de adquisición continua. Los dobletes, la expresión de la superficie celular de ICAM-1 en comparación con los controles FMO y los controles FMO etiquetados con isotipos relevantes de las poblaciones, se muestran aquí.Aquí se muestran las indicaciones y la medición de las IMF de diferentes poblaciones estándar de MESF en los histogramas superpuestos de las poblaciones de MESF. Los valores representan las IMF para cada una de las cinco poblaciones de MESF. Aquí se presenta la regresión lineal de MESF sobre cMFI para las poblaciones de MESF.La pendiente extrae MESF unido a células de los datos FCM de ICAM-1 en la superficie de las células B amigdalares en TFH. La conversión a densidades moleculares absolutas sigue estas operaciones matemáticas simples. Las imágenes representativas muestran el análisis de citometría de flujo de BSLB reconstituidos con mayores densidades de ICAM-1 12 histidinas monoméricas recombinantes.Aquí se muestran los análisis de regresión de la concentración de referencia ICAM-1 sobre la densidad medida. La pendiente se utiliza para calcular las concentraciones objetivo de proteína para lograr la densidad de las células. Los diagramas de flujo muestran los pasos críticos para el co-cultivo de células T con BSLBs, reconstituyendo membranas modelo en la posterior medición de la transferencia de partículas con citometría de flujo.La estrategia de cierre para identificar BSLB y celdas individuales dentro de la ventana de adquisición continua se muestra aquí. Uno de los aspectos más importantes de este protocolo es que, para mantener la reproducibilidad de los resultados, cada vez que cambie las reservas de proteínas o lípidos, debe realizar un nuevo análisis de calibración. Para descubrir nuevas moléculas efectivas secretadas por diferentes subconjuntos de células T, los BSLB se pueden aislar aún más mediante la clasificación celular activada por fluorescencia como se someten a análisis transcriptómicos y proteómicos.Nuestros colegas de la Universidad de Oxford han utilizado esta tecnología para estudiar y demostrar nuevas interacciones receptor-ligando, y también para estudiar los efectos de las ablaciones genéticas en la producción de la sinapsis inmune de las células T.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Los análisis competitivos de Homing para el Estudio de la tripa-trópico migración de células T

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Investigación

Inmunología e Infección

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Una introducción a las avispas parasitarias de<em&gt; Drosophila</em&gt; Y la respuesta inmune antiparasitario

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Imagen del VIH-1 sobre inducida sinapsis virológica y señalización en la bicapa lipídica sintéticas

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

Aislamiento y diferenciación de Th17 Naïve linfocitos T CD4

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

Generación de nódulos linfáticos de grasa Pad quimeras para el Estudio del Ganglio Linfático estroma origen de célula

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

El trasplante de la cola de la piel para el Estudio alogénico de células T CD4 respuestas en ratones

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Ratón Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Aislamiento de células T y<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciación en subconjuntos de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Métodos para el estudio de lípidos Las alteraciones en neutrófilos y la posterior formación de los neutrófilos extracelular Trampas

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Retroviral transducción de células T colaboradoras como un enfoque genético para estudiar mecanismos que controlan su diferenciación y función

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Un protocolo de aspiración de la ampolla para estudiar células de T humanas recordar respuestas en Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...