Name: preparation of bead-supported lipid bilayers to study the particulate output of t cell immune synapses
Uploaded: 2022-04-01T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses at JoVE.com

Vi är tacksamma mot våra laboratoriemedlemmar och Kennedy Institute of Rheumatology community för konstruktiva vetenskapliga diskussioner, särskilt vår flödescytometrianläggningschef Jonathan Webber. Detta arbete finansierades av Wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z, ERC Advanced Grant (SYNECT AdG 670930) och Kennedy Trust for Rheumatology Research (KTRR) (alla tre till MLD). PFCD stöddes av EMBO Long-Term Fellowship (ALTF 1420-2015, i samarbete med Europeiska kommissionen (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) och Marie Sklodowska-Curie Actions) och ett Oxford-Bristol Myers Squibb Fellowship.

1. Mätning av proteintätheter i cellytan med kvantitativ flödescytometri
<ol><li>Förbered 0,22 μm-filtrerad humanflödescytometribuffert (hFCB) genom att tillsätta EDTA (till en slutlig 2 mM-koncentration) och humant AB-serum (till en slutlig 10%) till steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7.4 (se tabell 1). Filtrera lösningen med hjälp av en porfilterenhet på 0,22 μm för att avlägsna serumföroreningar och lagra vid 4 °C.</li>
	<li>Återvinn cellerna och sedimentera...

<ol>
	<li>Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+to+reconstitute+immune+cell+signaling.">Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling.</a> FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).</li><li>Choudhuri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+release+of+T-cell-receptor-enriched+microvesicles+at+the+immunological+synapse.">Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological synapse.</a> Nature. 507 (7490), 118-123 (2014).</li><li>Saliba, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+structure+of+synaptic+ectosomes+exporting+antigen+receptor+linked+to+functional+CD40+ligand+from+helper+T+cells.">Composition and structure of synaptic ectosomes exporting antigen receptor linked to functional CD40 ligand from helper T cells.</a> elife. 8, 47528 (2019).</li><li>Barcia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+polarization+of+IFN-gamma+at+Kupfer+and+non-Kupfer+immunological+synapses+during+the+clearance+of+virally+infected+brain+cells.">In vivo polarization of IFN-gamma at Kupfer and non-Kupfer immunological synapses during the clearance of virally infected brain cells.</a> Journal of Immunology. 180 (3), 1344-1352 (2008).</li><li>Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+use+two+directionally+distinct+pathways+for+cytokine+secretion.">T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion.</a> Nature Immunology. 7 (3), 247-255 (2006).</li><li>Kupfer, A., Mosmann, T. R., Kupfer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+expression+of+cytokines+in+cell+conjugates+of+helper+T+cells+and+splenic+B+cells.">Polarized expression of cytokines in cell conjugates of helper T cells and splenic B cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (3), 775-779 (1991).</li><li>Kupfer, H., Monks, C. R., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+splenic+B+cells+that+bind+to+antigen-specific+T+helper+(Th)+cells+and+face+the+site+of+cytokine+production+in+the+Th+cells+selectively+proliferate:+immunofluorescence+microscopic+studies+of+Th-B+antigen-presenting+cell+interactions.">Small splenic B cells that bind to antigen-specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate: immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen-presenting cell interactions.</a> Journal of Experimental Medicine. 179 (5), 1507-1515 (1994).</li><li>Reichert, P., Reinhardt, R. L., Ingulli, E., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+in+vivo+identification+of+TCR+redistribution+and+polarized+IL-2+production+by+naive+CD4+T+cells.">Cutting edge: in vivo identification of TCR redistribution and polarized IL-2 production by naive CD4 T cells.</a> Journal of Immunology. 166 (7), 4278-4281 (2001).</li><li>Gerard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+T+cell-T+cell+synaptic+interactions+drive+the+differentiation+of+protective+CD8++T+cells.">Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8+ T cells.</a> Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).</li><li>Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+planar+bilayers+for+study+of+the+immunological+synapse.">Supported planar bilayers for study of the immunological synapse.</a> Current Protocols in Immunology. , (2007).</li><li>Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2021)</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+compensation+for+flow+cytometry:+visualization+artifacts,+limitations,+and+caveats.">Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats.</a> Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).</li><li>Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+T+cells+is+induced+by+binding+to+nickel-chelating+lipids+in+supported+lipid+bilayers.">Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers.</a> Frontiers in Physiology. 11, 613367 (2020).</li><li>Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+spillover+spreading+for+comparing+instrument+performance+and+aiding+in+multicolor+panel+design.">Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design.</a> Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).</li><li>C&#233;spedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+antigen-presenting+cells+reveal+the+diversity+and+functional+specialisation+of+extracellular+vesicles+composing+the+fourth+signal+of+T+cell+immunological+synapses.">Synthetic antigen-presenting cells reveal the diversity and functional specialisation of extracellular vesicles composing the fourth signal of T cell immunological synapses.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Yoon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+non-activated+lymphocytes+using+three-dimensional+refractive+index+tomography+and+machine+learning.">Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distributions+of+autofluorescence+after+compensation:+Be+panglossian,+fret+not.">Distributions of autofluorescence after compensation: Be panglossian, fret not.</a> Cytometry A. 89 (4), 398-402 (2016).</li><li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+controls,+instrument+setup,+and+the+determination+of+positivity.">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li><li>Balint, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+attack+particles+are+autonomous+killing+entities+released+from+cytotoxic+T+cells.">Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells.</a> Science. 368 (6493), 897-901 (2020).</li><li>Cespedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+expression+of+the+hRSV+nucleoprotein+impairs+immunological+synapse+formation+with+T+cells.">Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).</li></ol>

BSLBs är mångsidiga verktyg för att studera partikelproduktionen hos T-celler stimulerade med modell APC-membran. Metodens flexibilitet gör det möjligt att rekondrera komplexa och reduktionistiska membrankompositioner för att studera effekterna av ligands och deras signaler på utsöndringen av tSV och supramolekylära attackpartiklar och deras komponenter. Vi har testat denna teknik på olika T-celler, inklusive föraktiverad TH, CTL, Tregs och CART15. Detta protokoll fungerar också för m...

Den immunologiska synapsen (IS) är en pivotal molekylär struktur som bildas vid gränssnittet mellan celler som är engagerade i fysisk kontakt och som underlättar ett reglerat utbyte av juxtrarininformation. Olika ISs har beskrivits i litteraturen, och en växande mängd bevis tyder på att dessa molekylära nav är en bevarad egenskap hos cellulära nätverk. Olika immunceller, inklusive B-celler, naturliga mördarceller, dendritiska celler, makrofager och T-celler, utbyter information via montering av kortlivade kontakter1. Multiomiska studier ökar förståelsen av nya undergrupper av leukocyter och stromala celler som driver patogena cellulära nätverk och uttrycker ytproteiner med okända funktioner. Som syntetiska APC: er tillåter BSLBs en direkt undersökning av enskilda proteiners funktionella roll i integrationen av aktiverande signaler, nämligen antigener och kostimulering/corepression, av T-celler och den resulterande frisättningen av effektorpartiklar som kallas signal fyra.
Detta dokument beskriver protokoll och kritiska tekniska punkter att tänka på när du använder BSLBs för att efterlikna ytan sammansättningen av modell APCs. Protokollen för kvantitativ mätning av immunreceptorer och andra ytproteiner på APC presenteras tillsammans med protokollet för rekonstitution av syntetiska APC: er som innehåller dessa uppmätta mängder. Därefter presenteras de steg som krävs för kokulturering av T-celler och BSLB tillsammans med protokollet för kvantitativ mätning av transsynaptisk partikelöverföring med hjälp av flödescytometri. Mest anmärkningsvärt, BSLBs underlätta studier av en plasmamembran-härledda population av TSV kallas synaptiska extosomer (SEs). T-cells antigen receptor-berikade (TCR+) SEs kastas som svar på TCR utlösande2 och effektivt fångas av BSLBs3, vilket representerar en utmärkt avläsning för att bedöma de agonistiska egenskaperna hos antigener och den modellerade membransammansättningen. CD63 + exosomer och supramolekylära attackpartiklar (SMAPs) frigörs också av stimulerade T-celler och fångas av BSLBs. De kan användas som ytterligare avläsningar av aktivering och den resulterande exocytiska och lytiska granulatutsöndringen av T-celler. Mobilisering av exocytiska blåsor till den interagerande polen i T-cellen underlättar också riktningsfrisättning av cytokiner, såsom IL-2, IFN-γ och IL-10 som svar på aktivering4,5,6,7,8. Även om T-cellsutgivna cytokiner också kan detekteras på BSLBs, är en mer dedikerad studie för närvarande under utveckling för att validera den kvantitativa analysen av cytokinfrisättning vid den immunologiska synapsen.
För att ifrågasätta hur specifika membrankompositioner påverkar T-cellernas synaptiska utdata krävs att man definierar målmembrankomponentens fysiologiska densitet. Flödescytometribaserade kvantifieringar av cellytans proteiner är ett viktigt steg i detta protokoll och kräver: 1) användning av antikroppar med känt antal fluorokromer per antikropp (F/P) och 2) benchmarkpärlor som ger en standardreferens för interpolering av fluorokrommolekyler från uppmätta genomsnittliga fluorescensintensiteter (MFI).
Dessa referensstandarder består av fem pärlpopulationer, var och en innehållande ett ökande antal likvärdiga lösliga fluorokromer (MESF), som spänner över det dynamiska intervallet av godtycklig fluorescensdetektering. Dessa standardpopulationer ger diskreta fluorescenstoppar, vilket underlättar omvandlingen av godtyckliga fluorescensenheter till MESF genom enkel linjär regression. De resulterande MESF:erna används sedan tillsammans med antikropps F/P-värden för att beräkna det genomsnittliga antalet bundna molekyler per cell (eller BSLB i senare steg). Tillämpningen av uppskattade cellytor på det genomsnittliga antalet detekterade molekyler möjliggör sedan beräkning av fysiologiska densiteter som molekyler/μm2. Detta kvantifieringsprotokoll kan också anpassas till mätning av proteintäthet på T-celler och biokemisk rekonstitution av membrankompositioner som förmedlar bildandet av homotypiska T-cellssynapser (dvs. T-T synapses9). Vid behov kan antikroppsbindningens valency ytterligare uppskattas med hjälp av rekombinanta mål märkta med kända antal fluorokromer per molekyl. Därefter kan den antikroppsbindande valensen beräknas för samma BSLB-population genom att samtidigt jämföra antalet bundna fluorescerande proteiner och kvantifieringsantikroppar (med två olika kvantifieringsfluorokromer och MESF-standarder).
Rekonstitution av APC-membran kräver montering av stödda lipidbilayers (SLBs) på kiseldioxidpärlor1. Liposombestånd som innehåller olika fosfolipidarter kan utnyttjas för att bilda en mångsidig lipid-bilayermatris, vilket möjliggör förankring av rekombinanta proteiner med olika bindningskemi (beredningen av liposomer beskrivs i 10). När den fysiologiska densiteten (eller densiteten) hos den relevanta liganden "på celler" har definierats anpassas samma flödescytometriprotokoll för att uppskatta koncentrationen av rekombinant protein som behövs för att belägga BSLBs med målets fysiologiska densitet. Två olika förankringssystem kan användas antingen i kombination eller separat.
För det första är SLB som innehåller en slutlig 12,5 mol% av Ni2+-innehållande fosfolipider tillräcklig för att tillhandahålla cirka 10 000 his-tag-bindningsställen per kvadrat micron10 och fungerar bra för att dekorera BSLBs med mest kommersiellt tillgängliga proteiner vars fysiologiska densitet inte överstiger denna maximala lastkapacitet. Det andra lastsystemet utnyttjar biotinhaltiga fosfolipider (som mol%) för att ladda biotinylerade anti-CD3e Fab (eller HLA/MHC-monomerer) via streptavidinbroar. Kombinationen av dessa två BSLB dekorationsmetoder möjliggör sedan flexibel skrädderi av BSLBs som syntetiska APC: er. För mycket komplexa APC-ytkompositioner kan mol% av fosfolipider och proteiner ökas för att ladda så många proteiner som frågan kräver. När arbetskoncentrationerna av proteiner och mol% av biotinylerade fosfolipider har definierats kan BSLB monteras för att förhöra den synaptiska produktionen av T-celler med multiparametrisk flödescytometri.

preparation of bead-supported lipid bilayers to study the particulate output of t cell immune synapses

Antigen-presenterar celler (APCs) presenterar tre aktiverande signaler till T-celler som deltar i fysisk kontakt: 1) antigen, 2) costimulation/corepression och 3) lösliga cytokiner. T-celler frigör två typer av effektorpartiklar som svar på aktivering: transsynaptiska blåsor (tSV) och supramolekylära attackpartiklar, som överför intercellulära budbärare respektive medlar cytotoxicitet. Dessa entiteter internaliseras snabbt av API: er som är engagerade i fysisk kontakt med T-celler, vilket gör deras karakterisering skrämmande. Detta dokument presenterar protokollet att tillverka och använda pärla-stödda lipid bilayers (BSLBs) som antigen-presenterar cell (APC) mimetik för att fånga och analysera dessa transsynaptiska partiklar. Också beskrivna är protokollen för absoluta mätningar av proteintätheter på cellytor, rekonstitution av BSLBs med sådana fysiologiska nivåer och flöde cytometri förfarande för att spåra synaptiska partikel utsläpp av T-celler. Detta protokoll kan anpassas för att studera effekterna av enskilda proteiner, komplexa ligand blandningar, patogen virulens determinanter, och läkemedel på effektor produktionen av T-celler, inklusive hjälpare T-celler, cytotoxiska T lymfocyter, reglerande T-celler, och chimeric antigen receptor-uttrycka T celler (CART).

FCM för absolut proteinkvantifiering på cellytan Rekonstitution av BSLBs presenterar fysiologiska densiteter av ligands kräver uppskattning av totala proteintätheter på den modellerade cell delmängd. För att rekonstituera BSLBs, inkludera alla relevanta ligand förväntas spela en roll i signalaxeln av intresse tillsammans med proteiner som stöder vidhäftning och funktionell interaktion mellan BSLB och celler, såsom ICAM-1 och costimulatoriska molekyler, t.ex. CD40, CD58 och B7-receptorer (C...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses at JoVE.com

Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses

Här presenterar vi protokollet för stegvis rekonstitution av syntetiska antigen-presentera celler med hjälp av pärla-stödda Lipid Bilayers och deras användning för att förhöra den synaptiska produktionen från aktiverade T-celler.

Beredning av pärlstödda lipidbilayers för att studera partikelproduktionen av T-cells immunsynapser

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) ...

Studien av produktionen av immunsynapsen har begränsats mestadels till mikroskopiska metoder. BSLBs har utökat vår repertoar av verktyg som kan användas för att studera produktionen av T-cells immunsynapser, inklusive flödescytometri, mikroskopi, proteomik och RNA-sekvenseringsteknik. Som sådan kan BSLBs användas i en mängd olika immunologi frågor och för att identifiera sammansättning och biokemisk reglering av T-cellsproduktionen.Detta inkluderar till exempel studier av chimeriska antigenreceptorer, läkemedel som hämmar specifika signalvägar eller genetisk ablation av gener av intresse. En av de mest kritiska aspekterna av detta protokoll är att optimera proteinkalibreringarna och den flerfärgade flödescytometripanelen som krävs för att spåra den transsynaptiska partikeln av intresse. Detta kräver systematisk iteration av proteinkoncentrationer, antikroppskoncentrationer och instrumentinställningar.Börja med att späda ut en mikroliter pärlalösning med 1 000 mikroliter PBS. Räkna pärlorna med hjälp av en hemocytometerkammare och beräkna deras koncentration per milliliter. Beräkna sedan volymen av kiselpärlor som behövs för 500 000 slutliga BSLBs per titreringspunkt.Överför den erforderliga volymen kiseldioxidpärlor till ett sterilt 1,5-milliliter mikrocentrifugerör. Tvätta kiselpärlor tre gånger med en milliliter steril PBS och centrifugera pärlorna. Förbered tre volymer liposom master mix som innehåller en slutlig 12,5-mullvad procent av nickelhaltiga fosfolipider.Använd den liposommästarblandningen för att återanvända de tvättade kiseldioxidpärlorna. Blanda sedan försiktigt det genom att pipettera upp och ner hälften av den totala volymen. Använd en steril teknik, tillsätt argon eller kvävegas till röret för att förskjuta luft och skydda lipiderna från oxidation under blandning.Tillsätt argon till 0,4-millimolar lipidlagren. Förvara lagret och manipulera med en steril teknik. Flytta BSLB:erna till den vertikala blandaren och blanda i 30 minuter vid rumstemperatur med hjälp av orbitalblandning vid 10 VARV/min.Snurra sedan ner pärlorna genom att centrifugera i 15 sekunder vid rumstemperatur på en bänk-topp minicentrifuge. Blockera de bildade BSLB: erna genom att tillsätta en milliliter på 5%BSA innehållande 100 mikromolar nickelsulfat för att mätta NTA-ställen på BSLBs. Tvätta tre gånger med HBS-HSA-buffert för att avlägsna den överflödiga blockeringslösningen.Ta en ny U-botten eller V-botten 96-brunnsplatta och förbered tvåfaldiga seriella utspädningar av proteinerna. Återanslut de beredda BSLB:erna i en sådan volym att 100 mikroliter HBS-HSA-buffert innehåller 500 000 BSLB. Ta sedan en annan U-botten eller V-botten 96-brunnsplatta och överför 100 mikroliter av BSLB-suspensionen till brunnarna på ett sådant sätt att varje brunn får 500 000 BSBLs.Snurra ner den andra plattan vid rumstemperatur i två minuter vid 300x G.Kassera supernatanten och överför 100 mikrolitervolymer från proteintitreringsplattan till plattan som innehåller sedimenterade BSLBs. Blanda försiktigt och undvik överskott av bubbelgenerering under pipettering. Använd aluminiumfolie för att skydda den mot ljus och inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter vid 1 000 RPM.Tvätta sedan plattan tre gånger genom att tillsätta HBS-HSA-buffert på plattan och snurra ner den i rumstemperatur i två minuter vid 300x G.Räkna cellerna efter tvätt. Späd dem sedan till en slutlig koncentration av 2,5 miljoner per milliliter med hjälp av synaptiskt överföringsanalysmedium. När BSLBs har laddats med proteinblandningen, tvätta BSLBs två gånger med HBS-HSA-bufferten för att avlägsna överskottet av obundna proteiner.Återanvänd 500 000 BSLBs per brunn i 200 mikroliter HBS-HSA-buffert. Överför 100 mikroliter BSLB per brunn till en ny U-botten 96-brunnsplatta för att göra en dubblett, så att den slutliga mängden BSLB per brunn är 250 000. Snurra ner BSLBs vid 300x G i två minuter vid rumstemperatur.Kassera supernatanten och återanvänd sedan BSLB:erna med 100 mikroliter T-cellsuspension. Blanda försiktigt för att förhindra bildandet av bubblor. Inkubera samkulturerna i 90 minuter vid 37 grader Celsius.Skydda cellerna från ljus och kyla ner samkulturerna genom att först inkubera dem vid rumstemperatur i minst 15 minuter. Centrifugera samkulturerna i rumstemperatur i fem minuter vid 500x G.Kassera supernatanten och återanvänd samkulturerna i kalcium- och magnesiumjonfri 2%BSA PBS vid rumstemperatur för blockering. Placera cellerna på is i 45 minuter och skydda dem mot ljus.Förbered antikroppsblandningen med iskall 0,22 mikrometerfiltrerad 2%BSA och PBS som färgbuffert. Denna huvudmix ger extra blockering. Snurra ner co-cultures på 500x G i fem minuter och fyra grader Celsius.Kassera supernatanterna och använd sedan en flerkanalig pipett för att återanvända cellerna i färgningsmästareblandningen som innehåller optimerade antikroppskoncentrationer. Inkludera isotypmärkta celler och BSLBs, fluorescerande och icke-fluorescerande BSLBs och celler och BSLBs färgade ensamma. Blanda försiktigt genom pipettering upp och ner halva volymen.Inkubera i 30 minuter på is och skydda dem från ljus. Tvätta cellerna och BSLBs två gånger med iskall 2%BSA PBS. Snurra ner dem vid 500x G i fem minuter vid fyra grader Celsius.Efter centrifugering, kontrollera samkulturen sedimenterad på botten av brunnarna. Återanvänd sedan de tvättade co-kulturerna i 100 mikroliter PBS och förvärva omedelbart. Aktivera loggskalan för sidostrött ljus och flygtidsparametern för sido- och framåtst utspritt ljus.Förvärva MESF-standarder, vilket säkerställer att både de dim-set och ljusaste populationerna faller i instrumentets linjära intervall. Skaffa sedan kompensationsprover, beräkna kompensation och tillämpa kompensationsmatrisen på experimentet. Skaffa och spara minst 20 000 MESF-standarder totalt för varje kvantifieringskanal.Undvik att använda FACS mantlar eller liknande resuspend MESF pärlor, eftersom dessa innehåller salter och alkoholer som kommer att förstöra fluorokromerna, vilket leder till bredare fluorescenstoppar och höga fel. För förvärv med hög genomströmningsprovtagare, ställ in instrumentförvärv till standard, ställ in provförvärv till 80 mikroliter. Provflödeshastighet mellan två och tre mikroliter per sekund, provblandningsvolym vid 50 mikroliter, provblandning av 150 mikroliter per sekund och blandning per brunn mellan tre och fem.Skaffa minst 10 000 BSLB per prov. Exportera slutligen FCS-filerna. Ett exempel på kvantitativa flöde cytometri mätningar av ICAM-1 på ytan av tonsillar B celler och hjälpare T-celler visas här.De representativa bilderna beskriver gating strategi för att analysera enstaka CXCR5 B celler och follicular-helper T celler isolerade från mänskliga palatine tonsiller. Den här sekventiella gating-strategin identifierar enskilda livehändelser i det kontinuerliga förvärvsfönstret. Doublets, cellytan uttryck av ICAM-1 jämfört med FMO kontroller och FMO kontroller märkta med relevanta isotyper av populationerna, visas här.Gating och mätning av MFI från olika standard MESF populationer i överlagrade histogram av MESF populationer visas här. Värdena representerar MFI för var och en av de fem MESF-populationerna. Linjär regression av MESF över cMFI för MESF populationer presenteras här.Lutningen extraherar MESF bunden till celler från FCM data av ICAM-1 på ytan av tonsiller B celler i TFH. Omvandlingen till absoluta molekylära densiteter följer dessa enkla matematiska operationer. De representativa bilderna visar flöde cytometry analys av BSLBs rekonstituerade med ökad densitet av rekombinant monomeric ICAM-1 12 histidiner.Regressionsanalyser av ICAM-1 referenskoncentration över uppmätt densitet visas här. Lutningen används för att beräkna målkoncentrationer av protein för att uppnå cellernas densitet. Flödesdiagrammen visar de kritiska stegen för samodling av T-celler med BSLB, rekonstituera modellmembran i efterföljande mätning av partikelöverföring med flödescytometri.Gating-strategin för att identifiera enskilda BSLB och celler i fönstret för kontinuerlig anskaffning visas här. En av de viktigaste aspekterna av detta protokoll är att för att upprätthålla reproducerbarheten av resultaten, varje gång du byter protein- eller lipidlager, måste du utföra ny kalibreringsanalys. För att upptäcka nya effektiva molekyler som utsöndras av olika T-cellsundergrupper kan BSLBs isoleras ytterligare genom fluorescensaktiverad cellsortering som utsätts för transkriptomisk och proteomisk analys.Våra kollegor vid University of Oxford har använt denna teknik för att studera och demonstrera nya receptor-ligand interaktioner, och även för att studera effekterna av genetiska ablationer på produktionen av T-cellen immunsynaps.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Konkurrenskraftiga Homing Analyser för att studien Gut-tropism T cell migration

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

En introduktion till parasitsteklar av<em&gt; Drosophila</em&gt; Och Antiparasite immunsvar

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Avbildning av HIV-1 kuvert-inducerad Virologiskt Synapse och signalering av syntetiska lipiddubbelskikt

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

Isolering och Th17 differentiering för naiv CD4 T-lymfocyter

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Transplantation av Tail Hud att Studera Allogen CD4 T-cellsvar hos möss

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mus Naiv CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolering och<em&gt; In vitro</em&gt; Differentiering i T cellundergrupper

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Metoder för att studera Lipidförändringarna i neutrofiler och efterföljande bildning av neutrofila Extracellulär Fällor

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Retroviral Transduction av Helper T-celler som en genetisk strategi för att studera mekanismer som styr deras differentiering och funktion

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Ett sug Blister protokoll att studera mänsklig T-cell Recall Svaren In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...