Name: preparation of bead-supported lipid bilayers to study the particulate output of t cell immune synapses
Uploaded: 2022-04-01T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses at JoVE.com

Laboratuvar üyelerimize ve Kennedy Romatoloji Enstitüsü topluluğuna, özellikle akış sitometri tesisi müdürümüz Jonathan Webber'e yapıcı bilimsel tartışmalar için minnettarız. Bu çalışma Wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z, ERC Advanced Grant (SYNECT AdG 670930) ve Kennedy Trust for Rheumatology Research (KTRR) (üçü de MLD'ye) tarafından finanse edildi. PFCD, Avrupa Komisyonu (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) ve Marie Sklodowska-Curie Actions) ve Oxford-Bristol Myers Squibb Bursu ile birlikte EMBO Uzun Vadeli Burs (ALTF 1420-2015) tarafından desteklendi.

1. Hücre yüzeyi protein yoğunluklarının nicel akış sitometrisi ile ölçülması
<ol><li>Steril fosfat tamponlu saline (PBS), pH 7.4'e EDTA (son 2 mM konsantrasyonuna) ve insan AB serumu (son %10'a) ekleyerek 0,22 μm filtreli insan akış sitometri tamponu (hFCB) hazırlayın (bkz. Tablo 1). Serum safsızlıklarını gidermek ve 4 °C'de saklamak için çözeltiyi 0,22 μm gözenek filtre ünitesi kullanarak filtreleyin.</li>
	<li>Hücreleri kurtarın ve oda sıcaklığında (R...

<ol>
	<li>Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+to+reconstitute+immune+cell+signaling.">Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling.</a> FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).</li><li>Choudhuri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+release+of+T-cell-receptor-enriched+microvesicles+at+the+immunological+synapse.">Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological synapse.</a> Nature. 507 (7490), 118-123 (2014).</li><li>Saliba, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+structure+of+synaptic+ectosomes+exporting+antigen+receptor+linked+to+functional+CD40+ligand+from+helper+T+cells.">Composition and structure of synaptic ectosomes exporting antigen receptor linked to functional CD40 ligand from helper T cells.</a> elife. 8, 47528 (2019).</li><li>Barcia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+polarization+of+IFN-gamma+at+Kupfer+and+non-Kupfer+immunological+synapses+during+the+clearance+of+virally+infected+brain+cells.">In vivo polarization of IFN-gamma at Kupfer and non-Kupfer immunological synapses during the clearance of virally infected brain cells.</a> Journal of Immunology. 180 (3), 1344-1352 (2008).</li><li>Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+use+two+directionally+distinct+pathways+for+cytokine+secretion.">T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion.</a> Nature Immunology. 7 (3), 247-255 (2006).</li><li>Kupfer, A., Mosmann, T. R., Kupfer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+expression+of+cytokines+in+cell+conjugates+of+helper+T+cells+and+splenic+B+cells.">Polarized expression of cytokines in cell conjugates of helper T cells and splenic B cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (3), 775-779 (1991).</li><li>Kupfer, H., Monks, C. R., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+splenic+B+cells+that+bind+to+antigen-specific+T+helper+(Th)+cells+and+face+the+site+of+cytokine+production+in+the+Th+cells+selectively+proliferate:+immunofluorescence+microscopic+studies+of+Th-B+antigen-presenting+cell+interactions.">Small splenic B cells that bind to antigen-specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate: immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen-presenting cell interactions.</a> Journal of Experimental Medicine. 179 (5), 1507-1515 (1994).</li><li>Reichert, P., Reinhardt, R. L., Ingulli, E., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+in+vivo+identification+of+TCR+redistribution+and+polarized+IL-2+production+by+naive+CD4+T+cells.">Cutting edge: in vivo identification of TCR redistribution and polarized IL-2 production by naive CD4 T cells.</a> Journal of Immunology. 166 (7), 4278-4281 (2001).</li><li>Gerard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+T+cell-T+cell+synaptic+interactions+drive+the+differentiation+of+protective+CD8++T+cells.">Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8+ T cells.</a> Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).</li><li>Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+planar+bilayers+for+study+of+the+immunological+synapse.">Supported planar bilayers for study of the immunological synapse.</a> Current Protocols in Immunology. , (2007).</li><li>Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2021)</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+compensation+for+flow+cytometry:+visualization+artifacts,+limitations,+and+caveats.">Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats.</a> Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).</li><li>Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+T+cells+is+induced+by+binding+to+nickel-chelating+lipids+in+supported+lipid+bilayers.">Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers.</a> Frontiers in Physiology. 11, 613367 (2020).</li><li>Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+spillover+spreading+for+comparing+instrument+performance+and+aiding+in+multicolor+panel+design.">Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design.</a> Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).</li><li>C&#233;spedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+antigen-presenting+cells+reveal+the+diversity+and+functional+specialisation+of+extracellular+vesicles+composing+the+fourth+signal+of+T+cell+immunological+synapses.">Synthetic antigen-presenting cells reveal the diversity and functional specialisation of extracellular vesicles composing the fourth signal of T cell immunological synapses.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Yoon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+non-activated+lymphocytes+using+three-dimensional+refractive+index+tomography+and+machine+learning.">Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distributions+of+autofluorescence+after+compensation:+Be+panglossian,+fret+not.">Distributions of autofluorescence after compensation: Be panglossian, fret not.</a> Cytometry A. 89 (4), 398-402 (2016).</li><li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+controls,+instrument+setup,+and+the+determination+of+positivity.">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li><li>Balint, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+attack+particles+are+autonomous+killing+entities+released+from+cytotoxic+T+cells.">Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells.</a> Science. 368 (6493), 897-901 (2020).</li><li>Cespedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+expression+of+the+hRSV+nucleoprotein+impairs+immunological+synapse+formation+with+T+cells.">Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).</li></ol>

BSLB'ler, model APC membranları ile uyarılan T hücrelerinin partikül çıkışını incelemek için çok yönlü araçlardır. Yöntemin esnekliği, ligandların ve sinyallerinin TSV'lerin ve supramoleküler saldırı parçacıklarının ve bileşenlerinin salgılanması üzerindeki etkilerini incelemek için karmaşık ve indirgemeci membran bileşimlerinin yeniden inşasını sağlar. Bu teknolojiyi önceden devreye konmuş TH, CTL, Tregs ve CART15 dahil olmak üzere çeşitli T hücreleri ?...

İmmünolojik sinaps (IS), jukstracrine bilgilerinin düzenlenmiş alışverişini kolaylaştıran fiziksel temasla uğraşan hücrelerin arayüzünde oluşan önemli bir moleküler yapıdır. Literatürde farklı IS'ler tanımlanmıştır ve giderek büyüyen bir kanıt kütlesi, bu moleküler merkezlerin hücresel ağların korunmuş bir özelliği olduğunu göstermektedir. B hücreleri, doğal öldürücü hücreler, dendritik hücreler, makrofajlar ve T hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli bağışıklık hücreleri, kısa ömürlü kontakların montajı yoluyla bilgi alışverişinde bulunur1. Multimomik çalışmalar, patojenik hücresel ağları yönlendiren lökositlerin ve stromal hücrelerin yeni alt kümelerinin anlaşılmasını ve bilinmeyen işlevlere sahip yüzey proteinlerini ifade etmeyi ilerletmektedir. Sentetik APC'ler olarak BSLB'ler, tek tek proteinlerin aktif sinyallerin, yani antijenlerin ve costimülasyon/corepression'un T hücreleri tarafından entegrasyonundaki fonksiyonel rolünün doğrudan araştırılmasına ve sonuç olarak sinyal dört olarak adlandırılan efektör parçacıkların salınmasına izin verir.
Bu makalede, model APC'lerin yüzey bileşimini taklit etmek için BSLB'leri kullanırken dikkate alınması gereken protokoller ve kritik teknik noktalar açıklanmaktadır. APC'ler üzerindeki bağışıklık reseptörlerinin ve diğer yüzey proteinlerinin nicel ölçümüne ilişkin protokoller, bu ölçülen miktarları içeren sentetik APC'lerin yeniden uzlaştırılması protokolü ile birlikte sunulmaktadır. Daha sonra, T hücrelerinin ve BSLB'nin birlikte kullanılması için gereken adımlar, akış sitometrisi kullanılarak trans-sinaptik parçacık transferinin nicel ölçümü için protokol ile birlikte sunulur. En dikkat çekici şekilde, BSLB'ler sinaptik ektozomlar (SE) olarak adlandırdığı plazma membran türevi bir tSV popülasyonunu incelemeyi kolaylaştırır. T hücre antijen reseptörü ile zenginleştirilmiş (TCR+) SE'ler TCR tetiklemesine yanıt olarak dökülür2 ve BSLBs3 tarafından verimli bir şekilde yakalanır, antijenlerin ve modellenmiş membran bileşiminin agonistik özelliklerini değerlendirmek için mükemmel bir okuma temsil eder. CD63+ eksozomlar ve supramoleküler atak parçacıkları (SMAP' ler) da uyarılmış T hücreleri tarafından salınır ve BSLB'ler tarafından yakalanır. Aktivasyonun ek okumaları ve T hücreleri tarafından elde edilen ekzosit ve litik granül salgılanması olarak kullanılabilirler. Ekzosit veziküllerinin T hücresinin etkileşim kutbuna harekete geçirilmesi, aktivasyona yanıt olarak IL-2, IFN-γ ve IL-10 gibi sitokinlerin yönlü salınımını da kolaylaştırır4,5,6,7,8. T hücreli salınan sitokinler BSLB'lerde de tespit edilebilse de, immünolojik sinapsta sitokin salınımının nicel analizini doğrulamak için şu anda daha özel bir çalışma geliştirilmektedir.
Spesifik membran bileşimlerinin T hücrelerinin sinaptik çıkışını nasıl etkilediğini sorgulamak için hedef membran bileşeninin fizyolojik yoğunluğunun tanımlanması gerekir. Hücre yüzeyi proteinlerinin akış sitometrisi bazlı nicelikleri bu protokolde önemli bir adımdır ve şunları gerektirir: 1) antikor başına bilinen florokrom sayısına sahip antikorların kullanımı (F/P) ve 2) ölçülen ortalama floresan yoğunluklarından (MFI' ler) florokrom moleküllerinin enterpolasyonunun standart bir referansı olan kıyaslama boncuklarının kullanılması.
Bu kıyaslama standartları, her biri keyfi floresan algılamanın dinamik aralığını kapsayan, giderek artan sayıda eşdeğer çözünür florokrom (MESF) içeren beş boncuk popülasyonudur. Bu standart popülasyonlar ayrı floresan zirveleri verir ve basit doğrusal regresyon ile keyfi floresan birimlerinin MESF'lere dönüştürülmesini kolaylaştırır. Elde eden MOF'lar daha sonra hücre başına ortalama bağlı molekül sayısını (veya sonraki adımlarda BSLB'yi) hesaplamak için antikor F/P değerleriyle birlikte kullanılır. Tahmini hücre yüzey alanlarının tespit edilen moleküllerin ortalama sayısına uygulanması, fizyolojik yoğunlukların molekül/μm2 olarak hesaplanmasını sağlar. Bu niceleme protokolü ayrıca T hücreleri üzerindeki protein yoğunluklarının ölçümüne ve homotipik T hücre sinapslarının oluşumuna aracılık eden membran bileşimlerinin biyokimyasal olarak yeniden oluşturulmasına (yani T-T sinapsları9) uyarlanabilir. Gerekirse, molekül başına bilinen florokrom sayısı ile etiketlenmiş rekombinant hedefler kullanılarak antikor bağlamanın valency'si daha da tahmin edilebilir. Daha sonra, antikor bağlayıcı valency, bağlı floresan proteinlerin ve nicelik antikorlarının sayısı (iki farklı nicelik florokromu ve MESF standardı kullanılarak) aynı anda karşılaştırılarak aynı BSLB popülasyonu için hesaplanabilir.
APC membranlarının yeniden uzlaştırılması, desteklenen lipid bilayerlerinin (SLB' ler) silika boncuklar üzerinde birleşmesini gerektirir1. Farklı fosfolipid türleri içeren lipozom stokları, çok yönlü bir lipid-bilayer matrisi oluşturmak için kullanılabilir ve rekombinant proteinlerin farklı bağlayıcı kimya ile tutturulmasını sağlar (lipozomların hazırlanması 10'da ayrıntılıdır). İlgili ligandın fizyolojik yoğunluğu (veya yoğunlukları" "hücreler üzerinde" tanımlandıktan sonra, aynı akış sitometri protokolü, BSLB'leri hedef fizyolojik yoğunlukla kaplamak için gereken rekombinant protein konsantrasyonu tahmin etmek için uyarlanır. İki farklı ankraj sistemi kombinasyon halinde veya ayrı ayrı kullanılabilir.
İlk olarak, Ni2+içeren fosfolipidlerin son 12,5 mol'unu içeren SLB, kare mikron10 başına yaklaşık 10.000 His-tag bağlama bölgesi sağlamak için yeterlidir ve BSLB'leri fizyolojik yoğunlukları bu maksimum yükleme kapasitesini aşmayan ticari olarak mevcut proteinlerin çoğuyla süslemek için iyi çalışır. İkinci yükleme sistemi, biyotinilasyonlu anti-CD3e Fab'ı (veya HLA/MHC monomerlerini) streptavidin köprüleri üzerinden yüklemek için biyotin içeren fosfolipidlerden (mol% olarak) yararlanır. Bu iki BSLB dekorasyon yönteminin kombinasyonu daha sonra BSLB'lerin sentetik APC'ler olarak esnek bir şekilde uyarlandırını sağlar. Son derece karmaşık APC yüzey bileşimleri için, fosfolipidlerin ve proteinlerin mol% 'i, eldeki sorunun gerektirdiği kadar protein yüklemek için artırılabilir. Proteinlerin çalışma konsantrasyonları ve biyotinillenmiş fosfolipidlerin mol% 'i tanımlandıktan sonra, BSLB'ler çokparametrik akış sitometrisi ile T hücrelerinin sinaptik çıkışını sorgulamak için monte edilebilir.

preparation of bead-supported lipid bilayers to study the particulate output of t cell immune synapses

Antijen sunan hücreler (APC'ler) fiziksel temas halinde olan T hücrelerine üç aktive edici sinyal sunar: 1) antijen, 2) costimülasyon / corepression ve 3) çözünür sitokinler. T hücreleri aktivasyona yanıt olarak iki tür efektör parçacık salgılar: hücrelerarası habercileri aktaran ve sitotoksikliğe aracılık eden trans-sinaptik veziküller (tSV' ler) ve supramoleküler saldırı parçacıkları. Bu varlıklar, T hücreleriyle fiziksel temas halinde olan APC'ler tarafından hızla içselleştirilir ve karakterizasyonlarını korkutucu hale getirir. Bu makale, bu trans-sinaptik parçacıkları yakalamak ve analiz etmek için boncuk destekli Lipid Bilayer'leri (BSLB' ler) antijen sunan hücre (APC) mimetikleri olarak imal etmek ve kullanmak için protokol sunmaktadır. Ayrıca, hücre yüzeylerindeki protein yoğunluklarının mutlak ölçümleri, BSLB'lerin bu fizyolojik düzeylerle yeniden uzlaştırılması ve T hücreleri tarafından sinaptik parçacık salınımını izlemek için akış sitometri prosedürü için protokoller açıklanmıştır. Bu protokol, yardımcı T hücreleri, sitotoksik T lenfositleri, düzenleyici T hücreleri ve kimerik antijen reseptör ifade eden T hücreleri (CART) dahil olmak üzere, bireysel proteinlerin, karmaşık ligand karışımlarının, patojen virülans belirleyicilerinin ve ilaçların T hücrelerinin efektör çıkışı üzerindeki etkilerini incelemek için uyarlanabilir.

Hücre yüzeyinde mutlak protein nicelemesi için FCM Ligandların fizyolojik yoğunluklarını sunan BSLB'lerin yeniden uzlaştırılması, modellenen hücre alt kümesindeki toplam protein yoğunluklarının tahminini gerektirir. BSLB'leri yeniden inşa etmek için, BSLB ile hücreler arasındaki yapışmayı ve fonksiyonel etkileşimi destekleyen proteinlerin yanı sıra, örneğin CD40, CD58 ve B7 reseptörleri (CD80 ve CD86) gibi ilgili ligandları da ekleyin. ICOSL3, PD-L1 ve PD-L215 gibi costim...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses at JoVE.com

Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses

Burada Boncuk Destekli Lipid Bilayers kullanılarak sentetik antijen sunan hücrelerin adım adım yeniden uzlaştırılması ve aktif T hücrelerinden sinaptik çıkışı sorgulamak için kullanımları için protokolü sunuyoruz.

T Hücreli İmmün Sinapsların Partikül Çıkışını İncelemek için Boncuk Destekli Lipid Bilayerlerin Hazırlanması

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) ...

İmmün sinaps çıkışının incelenmesi çoğunlukla mikroskobik yöntemlerle sınırlandırıldı. BSLB'ler, akış sitometrisi, mikroskopi, proteomi ve RNA dizileme teknolojileri de dahil olmak üzere T hücreli bağışıklık sinapslarının çıkışını incelemek için kullanılabilecek araçlar repertuarımızı genişletti. Bu nedenle, BSLB'ler çok çeşitli immünoloji sorularında ve T hücre çıkışının bileşimini ve biyokimyasal düzenlemesini tanımlamak için kullanılabilir.Bu, örneğin, kimerik antijen reseptörlerinin, belirli sinyal yollarını inhibe eden ilaçların veya ilgi genlerinin genetik ablasyonunun incelenmesini içerir. Bu protokolün en kritik yönlerinden biri, protein kalibrasyonlarını ve trans-sinaptik ilgi parçacıklarını izlemek için gereken çok renkli akış sitometri panelini optimize etmektir. Bu, protein konsantrasyonlarının, antikor konsantrasyonlarının ve cihaz ayarlarının sistematik olarak yinelenmesini gerektirir.Bir mikrolitre boncuk çözeltisini 1.000 mikrolitre PBS ile seyrelterek başlayın. Boncukları bir hemositometre odası kullanarak sayın ve mililitre başına konsantrasyonlarını hesaplayın. Ardından, titrasyon noktası başına 500.000 nihai BSLB için gereken silika boncuklarının hacmini hesaplayın.Gerekli miktarda silika boncukları steril 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Silika boncuklarını bir mililitre steril PBS ile üç kez yıkayın ve boncukları santrifüj edin. Nikel içeren fosfolipidlerin son 12,5 köstebek yüzdesini içeren üç hacimli lipozom ana karışımı hazırlayın.Yıkanmış silika boncuklarını yeniden depolamak için lipozom ana karışımını kullanın. Ardından, toplam hacmin yarısını yukarı ve aşağı pipetleyarak hafifçe karıştırın. Steril bir teknik kullanarak, havayı yerinden etmek ve lipitleri karıştırma sırasında oksidasyondan korumak için tüpe argon veya azot gazı ekleyin.0.4 milimolar lipit stoklarına argon ekleyin. Stoku saklayın ve steril bir teknik kullanarak manipüle edin. BSLB'leri dikey karıştırıcıya taşıyın ve 10 RPM'de yörüngesel karıştırma kullanarak oda sıcaklığında 30 dakika karıştırın.Ardından, bir tezgah üstü minicentrifuge üzerinde oda sıcaklığında 15 saniye santrifüj yaparak boncukları aşağı çevirin. BSLB'lerdeki NTA sitelerini doyurmak için 100 mikromoler nikel sülfat içeren%5 BSA mililitre ekleyerek oluşan BSLB'leri engelleyin.Yeni bir U-bottom veya V-bottom 96-well plakası alın ve proteinlerin iki kat seri seyreltmelerini hazırlayın. Hazırlanan BSLB'leri 100 mikrolitre HBS-HSA tamponu 500.000 BSLB içerecek şekilde yeniden diriltin. Ardından, başka bir U-bottom veya V-bottom 96-well plakası alın ve BSLB süspansiyonunun 100 mikrolitresini her kuyu 500.000 BSBL alacak şekilde kuyulara aktarın.İkinci plakayı oda sıcaklığında 300x G'de iki dakika döndürün.Süpernatantı atın ve protein titrasyon plakasından 100 mikroliter hacmini çökelmiş BSLB'leri içeren tabağa aktarın. Işıktan korumak için alüminyum folyo kullanın ve oda sıcaklığında 1.000 RPM'de 30 dakika kuluçkaya yat.Daha sonra tabağa HBS-HSA tamponu ekleyerek plakayı üç kez yıkayın ve 300x G'de iki dakika oda sıcaklığında aşağı doğru döndürün.Yıkadıktan sonra hücreleri sayın. Daha sonra, sinaptik transfer tahlil ortamını kullanarak mililitre başına 2,5 milyonluk son konsantrasyona seyreltin. BSLB'ler protein karışımı ile yüklendikten sonra, fazla ilişkisiz proteinleri çıkarmak için BSLB'leri HBS-HSA tamponu ile iki kez yıkayın.200 mikrolitre HBS-HSA tamponunda kuyu başına 500.000 BSLB'yi yeniden diriltir. Kuyu başına 100 mikrolitre BSLB'yi, bir kopya yapmak için yeni bir U-bottom 96 kuyu plakasına aktarın, böylece kuyu başına son BSLB miktarı 250.000'dir. BSLB'leri oda sıcaklığında iki dakika boyunca 300x G'de döndürün.Süpernatantı atın ve ardından 100 mikrolitre T hücre süspansiyonu kullanarak BSLB'leri yeniden diriltin. Kabarcık oluşumunu önlemek için hafifçe karıştırın. 37 santigrat derecede 90 dakika boyunca ortak kültürleri kuluçkaya yatırın.Hücreleri ışıktan koruyun ve önce oda sıcaklığında en az 15 dakika kuluçkaya yatırarak ortak kültürleri soğutun. Oda sıcaklığındaki ortak kültürleri 500x G'de beş dakika santrifüjleyin.Süpernatantı atın ve tıkanma için oda sıcaklığında kalsiyum ve magnezyum iyonsuz% 2 BSA PBS'deki ortak kültürleri yeniden biriktirin. Hücreleri 45 dakika boyunca buza yerleştirin ve ışıktan koruyun.Buz gibi 0,22 mikrometre filtreli %2 BSA ve PBS'yi boyama tamponu olarak kullanarak antikor ana karışımını hazırlayın. Bu ana karışım ekstra engelleme sağlayacaktır. 500x G'deki ortak kültürleri beş dakika ve dört santigrat derece döndürün.Süpernatantları atın ve ardından optimize edilmiş antikor konsantrasyonları içeren boyama ana karışımındaki hücreleri yeniden kullanmak için çok kanallı bir pipet kullanın. İzotip etiketli hücreler ve BSLB'ler, floresan ve floresan olmayan BSLB'ler ve tek başına lekelenmiş hücreler ve BSLB'leri içerir. Hacmin yarısını yukarı ve aşağı pipetleyarak hafifçe karıştırın.Buzda 30 dakika kuluçkaya yat ve onları ışıktan koru. Hücreleri ve BSLB'leri buz gibi %2 BSA PBS kullanarak iki kez yıkayın. Onları 500x G'de 4 santigrat derecede beş dakika döndürün.Santrifüjlemeden sonra, kuyuların dibindeki ortak kültür tortularını kontrol edin. Daha sonra, yıkanmış ortak kültürleri 100 mikrolitre PBS'de yeniden diriltin ve hemen elde edin. Yan dağınık ışık için günlük ölçeğini ve yan ve ileri dağınık ışıklar için uçuş zamanı parametresini etkinleştirin.Hem loş ayarlı hem de en parlak popülasyonların cihazın doğrusal aralığına düşmesini sağlayarak MESF standartlarını elde edin. Ardından, ücret örnekleri alın, telafiyi hesaplayın ve ücret matrisini denemeye uygulayın. Her nicelik kanalı için en az 20.000 toplam MESF standardı alın ve kaydedin.FACS kılıf sıvısı veya yeniden canlanan MESF boncuklarına benzer kullanmaktan kaçının, çünkü bunlar florokromları yok edecek tuzlar ve alkoller içerir, bu da daha geniş floresan zirvelerine ve yüksek hataya yol ırkar. Yüksek verimli örnekleyiciler kullanarak satın alma için, cihaz alımını Standart olarak ayarlayın, numune alımını 80 mikrolitreye ayarlayın. Saniyede iki ila üç mikrolitre arasında numune Akış Hızı, 50 mikrolitrede numune Karıştırma Hacmi, saniyede 150 mikrolitrelik numune Karıştırma ve üç ila beş arasında kuyu başına karıştırma.Örnek başına en az 10.000 tek BSLB elde edin. Son olarak, FCS dosyalarını dışa aktar. Bademcikler B hücreleri ve yardımcı T hücrelerinin yüzeyinde ICAM-1'in nicel akış sitometrisi ölçümlerine bir örnek burada gösterilmiştir.Temsili görüntüler, insan palatin bademciklerinden izole edilmiş tek CXCR5 B hücrelerini ve foliküler yardımcı T hücrelerini analiz etmek için gating stratejisini açıklar. Bu sıralı gating stratejisi, sürekli edinme penceresindeki tek canlı olayları tanımlar. ICAM-1'in FMO kontrolleri ve FMO kontrollerine kıyasla hücre yüzeyi ekspresyosu olan ve popülasyonların ilgili izotipleriyle etiketlenmiş çiftler burada gösterilmiştir.MESF popülasyonlarının çakışmış histogramlarında farklı standart MESF popülasyonlarından MPI'ların gating ve ölçümü burada gösterilmiştir. Değerler, beş MESF popülasyonunun her biri için MFI'leri temsil eder. MESF popülasyonları için mesf'in cMFI üzerinden doğrusal regresyonu burada sunulmuştur.Eğim, TFH'deki bademcikler B hücrelerinin yüzeyindeki ICAM-1'in FCM verilerinden hücrelere bağlı MESF'yi çıkarır. Mutlak moleküler yoğunluklara dönüşüm bu basit matematiksel işlemleri takip eder. Temsili görüntüler, rekombinant monomerik ICAM-1 12 histidinlerinin artan yoğunlukları ile yeniden inşa edilen BSLB'lerin akış sitometri analizini göstermektedir.ICAM-1 referans konsantrasyonunun ölçülen yoğunluk üzerindeki regresyon analizleri burada gösterilmiştir. Eğim, hücrelerin yoğunluğunu elde etmek için hedef protein konsantrasyonlarını hesaplamak için kullanılır. Akış diyagramları, T hücrelerini BSLB'lerle birlikte kültleştirmek, akış sitometrisi ile parçacık transferinin sonraki ölçümünde model membranlarını yeniden inşa etmek için kritik adımları gösterir.Sürekli edinme penceresindeki tek BSLB'leri ve hücreleri tanımlamak için gating stratejisi burada gösterilmiştir. Bu protokolün en önemli yönlerinden biri, sonuçların tekrarlanabilirliğini korumak için, protein veya lipit stoklarını her değiştirdiğinizde, yeni kalibrasyon analizi yapmanız gerektiğidir. Farklı T hücre alt kümeleri tarafından salgılanan yeni etkili molekülleri keşfetmek için BSLB'ler, transkriptomik ve proteomik analize tabi tutulduğu için floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama ile daha da izole edilebilir.Oxford Üniversitesi'ndeki meslektaşlarımız bu teknolojiyi yeni reseptör-ligand etkileşimlerini incelemek ve göstermek ve ayrıca genetik ablasyonların T hücre bağışıklık sinapsının çıktısı üzerindeki etkilerini incelemek için kullandılar.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Gut-tropik T Hücre Göç Eğitim Rekabetçi Homing Tahliller

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Paraziter Eşek Arıları Bir Giriş<em&gt; Drosophila</em&gt; Ve antiparaziter İmmün Yanıt

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Görüntülemede HIV-1 Zarf bağlı Virolojik Synapse ve Sentetik Lipid Bilayers üzerine Sinyal

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

İzolasyon ve naif CD4 T Lenfositler Th17 Farklılaşma

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

Lenf düğümü Stromal Hücre Menşe Çalışmaları Lenf-yağ Pad Kimeralar Üretimi

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Farelerde allojenik CD4 + T hücre Cevapları Eğitim için Kuyruk Cilt Nakli

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Fare Naif CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Hücre İzolasyonu ve<em&gt; In vitro</em&gt; T hücre alt içine Farklılaşma

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Yöntemler lipid Nötrofiller değişiklikler ve Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar sonraki oluşumunu incelemek

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Eğitim için bir genetik Yaklaşım olarak yardımcı T hücrelerinin retroviral İletimi Mekanizmaları kendi Farklılaşma ve Kontrol Fonksiyonunun

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

İnsan T-hücre hatırlama yanıt Vivo içinde çalışmaya emme Blister iletişim kuralı

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...