Name: injection of porcine adipose tissue-derived stroma cells via waterjet technology
Uploaded: 2021-11-23T15:00:00
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我们感谢原始出版物的合著者的帮助和支持。

猪脂肪组织样本是从图宾根大学实验外科研究所获得的。所有程序均由当地动物福利机构批准，动物实验编号为CU1/16。
1. 猪脂肪组织源性基质细胞的分离
<ol><li>使用从实验外科研究所在50 mL离心管中输送到实验室的猪脂肪组织。</li>
	<li>将组织转移到无菌工作台下的无菌培养皿中，并用两把手术刀（10号）将其切碎成小碎片和糊状物。 注意：也可以使用剪刀来...

在本研究中，我们展示并提出了WJ细胞递送程序的分步方法，并采用定量研究的后遗症来评估WJ递送对细胞特征的影响：细胞活力和生物力学特征（即EM）。注射WJ后，85.9%的收获细胞是活的。在WN注射方面，97.2%的细胞在注射后保持其活力。因此，WJ方法满足了临床实施的绝对要求：超过80%的活细胞在递送后18。虽然使用WJ方法实现了标准化和可重复的方案，但针头注射的结果高度?...

尿失禁 （UI） 是一种广泛存在的疾病，在欧洲人群中患病率为 1.8 - 30.5%，主要表现为尿道括约肌功能障碍。从临床角度来看，当保守疗法或物理治疗无法解决和缓解新出现的症状时，通常会向患者提供手术治疗。
用于括约肌复合物故障的潜在再生修复的细胞疗法已成为治疗UI病理学的前卫方法2，3。其主要目标是替换，修复和恢复受损组织的生物功能。在UI的动物模型中，干细胞移植在尿动力学结果中显示出有希望的结果2，4，5。干细胞作为最佳细胞候选者出现，因为它们具有经历自我更新和多能分化的能力，从而有助于受影响的组织再生6。尽管即将到来的再生潜力，但细胞疗法的实际使用仍然受到阻碍，因为细胞的微创递送仍然面临有关注射精度和靶标覆盖率的几个挑战。尽管目前用于细胞递送的方法是通过针刺系统7注射，但它通常会导致活细胞的整体缺陷，据报道移植后的活力低至1%-31%8。此外，通过针头注射的细胞递送也被证明会影响放置，保留率，以及移植细胞向靶组织9，10，11的分布。克服上述限制的一种可行的新颖方法是通过水射流技术进行无针细胞递送。
水射流（WJ）技术正在成为一种新方法，它能够在尿道括约肌12，13的视觉控制下通过膀胱镜高通量递送细胞。WJ可在E5至E8013的不同压力（E = 以巴为单位的效应）下进行细胞递送。在第一阶段，（组织渗透阶段）用高压（即E60或E80）施加等渗溶液，以松动靶向组织周围的细胞外基质并打开小的互连微腔。在第二阶段（注射阶段），压力在几毫秒内降低（即，高达E10），以便将细胞轻轻地输送到靶组织中。在这种两步相施用之后，细胞在射出时不会受到针对组织的额外压力，而是以低压流漂浮到充满液体的海绵状区域13中。在通过WJ将干细胞注射到尸体尿道组织中的离体模型设置中，活细胞随后可以从组织中抽吸并取出并在体外进一步扩增13。尽管Weber等人2020年的一项研究证明了WJ将无足迹心肌细胞输送到心肌14中的可行性和适用性，但必须记住，WJ技术仍处于原型阶段。
以下方案描述了如何制备和标记猪脂肪组织来源的基质细胞（pADSC），以及如何通过WJ技术和威廉姆斯膀胱镜检查针（WN）将它们递送到捕获液和尸体组织中。细胞注射后，通过原子力显微镜（AFM）评估细胞活力和弹性。通过分步说明，该协议提供了一种清晰简洁的方法来获取可靠的数据。讨论部分介绍并描述了该技术的主要优点，局限性和未来前景。WJ细胞递送以及这里报道的翻译后遗症分析正在取代标准的针头注射，并为靶组织的再生愈合提供固体细胞递送框架。在我们最近的研究中，我们提供的证据显示，与针头注射相比，WJ更精确地递送细胞，并且至少具有相当的活力15，16。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL BD Luer-LokTM Syringe</td>
			<td>BD Plastik Inc</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell sieve</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>542000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 tissue culture flask</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM head</td>
			<td>(CellHesion 200) JPK</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM processing software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM system Cell Hesion 200</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-In-One-Al cantilever</td>
			<td>Budget Sensors</td>
			<td>AIO-10</td>
			<td>tip A, Conatct Mode, Shape: Beam 
			Force Constant: 0.2 N/m (0.04 - 0.7 N/m) 
			Resonance Frequency: 15 kHz (10 - 20 kHz) 
			Length: 500 &#181;m (490 - 510 &#181;m) 
			Width: 30 &#181;m (35 - 45 &#181;m) 
			Thickness: 2.7 &#181;m (1.7 - 3.7 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2942</td>
			<td>250 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscope (AFM)</td>
			<td>CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microlance 3 18G</td>
			<td>BD</td>
			<td>304622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10008-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilever</td>
			<td>&#160;All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria</td>
			<td>AIO-TL-10</td>
			<td>tip A, k &#188; 0.2 N/m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-chip disposable hemocytometer</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>631-1098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge: Rotina 420R</td>
			<td>Hettich Zentrifugen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17100-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - low glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather disposable scalpel (No. 10)</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.30.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES sodium salt solution (1 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM)</td>
			<td>AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany</td>
			<td>L201306_03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laboratory bags</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium without l-glutamine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F1315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium without L-glutamine</td>
			<td>(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)</td>
			<td>F1315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE 17-605C1</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td>Calcein AM and EthD-1 are used from this kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope software: Zen 2.6</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope: AxioVertA.1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nelaton-Catheter female</td>
			<td>Bicakcilar</td>
			<td>19512051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10000 U/ml Penicillin 
			10000 &#181;g/ml Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater associated with AFM</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>T-05-0117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater associated with AFM</td>
			<td>JPK Instruments AG, Berlin, Germany</td>
			<td>T-05-0117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical Software: SPSS Statistics 22</td>
			<td>IBM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri dish - CellStar</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>TPP AG</td>
			<td>TPP93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland</td>
			<td>TPP93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4% 
			0.85% NaCl</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterjet: ERBEJET2 device</td>
			<td>Erbe Elektromedizin GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams Cystoscopic Injection Needle</td>
			<td>Cook Medical</td>
			<td>G14220</td>
			<td>23G, 5.0 Fr, 35 cm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injection of porcine adipose tissue-derived stroma cells via waterjet technology

尿失禁（UI）是一种非常普遍的疾病，其特征在于尿道括约肌缺乏。再生医学分支，特别是细胞疗法，是改善和恢复尿道括约肌功能的新方法。尽管在临床环境中常规通过针头和注射器注射活性功能细胞，但这些方法具有显着的缺点和局限性。在这种情况下，无针水刀（WJ）技术是一种可行且创新的方法，可以通过视觉引导膀胱镜在尿道括约肌中注射活细胞。在本研究中，我们使用WJ将猪脂肪组织来源的基质细胞（pADSC）递送到尸体尿道组织中，并随后研究了WJ递送对细胞产量和活力的影响。我们还通过原子力显微镜（AFM）测量评估了生物力学特征（即弹性）。我们发现，WJ递送的pADSC的细胞弹性显着降低。与对照组相比，存活率明显较低，但仍高于80%。

通过两种方法递送细胞后，与使用E60-10设置的WJ注射相比，通过WN递送的细胞的活力（97.2 ±±2%，n = 10，p<0.002）更高（图2）。生物力学评估结果表明：捕获液中细胞的WN注射与对照组（1.176 kPa）相比，弹性模量（EM;0.992 kPa）无显着差异; 图3A），而WJ注射触发了细胞EM的显着降低（0.440 kPa，p<0.001， 图3B）。注意到WJ注射后EM降低40-50%?...

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Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stroma Cells via Waterjet Technology

我们提出了一种通过无针水射流技术进行细胞注射的方法，以及细胞活力，增殖和弹性测量方面的交付后研究的后遗症。

通过水射流技术注射猪脂肪组织衍生的基质细胞

Urinary incontinence (UI) is a highly prevalent condition characterized by the deficiency of the urethral sphincter muscle. Regenerative medicine ...

与靶向不同组织中的针头注射相比，活性成分（如液体，纳米颗粒，微粒，包封药物甚至活细胞）的水射流注射可以更精确地应用。微创方法需要通过预先选择注射压力将药物精确定位在预定的目标组织层中。我们目前的重点是尿失禁的细胞治疗。然而，这种技术已经扩展到严重心脏病发作后受感染肌肉组织的再生。目前，该技术只能由经验丰富的研究人员或执业医师在临床前研究中应用。它不打算用于常规实验室程序，因为它是为未来的临床目的而开发的。首先，将尿道与从成年雌性地方品种猪身上解剖的连接膀胱放在模仿下骨盆底弹性的海绵上。然后使用膀胱，确定尿道的方向。这是可能的，因为输尿管和三条韧带的定位，它们将膀胱固定在腹部和盆腔中。正确定位尿道后，借助导管将其纵向切开，在背侧纵向切开。将猪脂肪组织来源的基质细胞的细胞密度调节至每毫升10至第六细胞的2.4倍后，用绿色荧光膜渗透性活细胞染色标记细胞，然后用注射器吸出细胞悬浮液并应用Williams细胞镜注射针。接下来，将针头保持在15毫升离心管中两毫升生长培养基的正上方，或将针头插入开放的尿道组织中。在这两种情况下，手动注射250微升的细胞悬浮液。从注射圆顶注射到尸体尿道中的细胞。通过离心收集直接注入培养基的细胞。对于注射到尸体尿道中的细胞，用注射器上施加的18号针头将它们从注射圆顶中抽出。将吸入的细胞转移到离心管中并通过离心沉淀它们。将两个细胞沉淀重悬于四毫升生长培养基中。为了确定细胞产量和活力，将20个细胞悬浮液与20微升台盼蓝彻底混合。然后在血细胞计数器的每个腔室中填充10微升该混合物。在显微镜下计算所有四个角方块中的细胞。将未染色的白细胞计为活细胞，将蓝色染色的细胞计为死细胞，然后计算每毫升的细胞数。对于通过水刀注射，将猪脂肪组织来源的基质细胞的密度调整为每毫升10至6个细胞的六倍。如前所述标记它们，并将细胞悬浮液填充到无针水射流装置的加样单元中。然后将注射喷嘴保持在 15 毫升离心管中两毫升生长培养基的正上方，或保持在开道组织上方。在这两种情况下，注入100微升的细胞悬浮液。使用高压进行组织渗透，然后使用低压相进行细胞注射。注射到尸体尿道中的细胞形成注射圆顶。通过离心收集直接注入培养基的细胞。对于注射到尸体尿道中的细胞，将它们从注射圆顶中抽出。将吸入的细胞转移到离心管中，并如前所述使用离心沉淀它们。离心后，将两个沉淀重悬于四毫升的生长培养基中。将注射后回收的细胞以每培养皿5倍的密度接种到每培养皿5倍至第5个细胞。在37摄氏度下孵育三小时后，在AFM测量之前，用三毫升Leibovitz的L-15培养基代替生长培养基，没有L-谷氨酰胺。为了测量单个细胞的弹性，视觉上识别一个细胞并专注于它。然后将计算机鼠标放在细胞的中间，为了提高测量精度，将AFM尖端直接放置在细胞核上方。接下来，将焦点放在悬臂上，并将其移动到计算机鼠标上。然后开始测量，运行并测量至少50个细胞。使用通过悬臂校准获得的设定点参数，并测量一个单元三次。通过威廉姆斯针头递送的细胞的活力高于使用E60-10设置的水射流注射。捕获液中注射的生物力学评估显示，与对照组相比，威廉姆斯针注射液在弹性模量方面没有显着差异，而水射流注射使细胞弹性模量显着降低40%至50%同样，在尸体尿道组织样品中，威廉姆斯针注射与对照组相比在细胞弹性模量方面没有显着差异。然而，在水射流注射后观察到51%的显着降低。人们只需要确保针头注射不会完全穿透造成伤害的组织。使用水刀，只需将设备放置在注射区域的正确位置，而其余部分则由设备本身自动完成。由于水射流设备是为匹配和安装内窥镜设备而开发的，因此您可以将这些膀胱镜或内窥镜技术可以到达的身体任何部位使用水刀应用来再生组织并进行修复工作。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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科研

生物工程

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用于打印 3D 细胞-拉丹胰腺组织构造的胰腺组织衍生细胞外基质生物墨水

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