Name: injection of porcine adipose tissue-derived stroma cells via waterjet technology
Uploaded: 2021-11-23T15:00:00
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Nous remercions nos co-auteurs des publications originales pour leur aide et leur soutien.

Les échantillons de tissu adipeux porcin ont été obtenus à l’Institut de chirurgie expérimentale de l’Université de Tuebingen. Toutes les procédures ont été approuvées par les autorités locales de protection des animaux sous le numéro d’expérimentation animale CU1/16.
1. Isolement des cellules stromales dérivées du tissu adipeux porcin
<ol><li>Utiliser du tissu adipeux porcin livré par l’Institut de chirurgie expérimentale dans un tube centrifuge de ...

Dans la présente étude, nous avons démontré et présenté une approche étape par étape pour la procédure d’administration de cellules WJ et utilisé une séquelle d’investigations quantitatives pour évaluer l’effet de l’administration WJ sur les caractéristiques cellulaires: viabilité cellulaire et caractéristiques biomécaniques (c.-à-d. EM). Après l’injection de WJ, 85,9% des cellules récoltées étaient viables. En termes d’injection de WN, 97,2% des cellules ont conservé leur viabilité apr...

L’incontinence urinaire (IU) est un trouble répandu avec une prévalence de 1,8 à 30,5% dans les populations européennes1 et se caractérise principalement par un dysfonctionnement du sphincter urétral. D’un point de vue clinique, un traitement chirurgical est souvent offert aux patients lorsque les thérapies conservatrices ou la physiothérapie ne parviennent pas à traiter et à soulager les symptômes émergents.
La thérapie cellulaire pour la réparation régénérative potentielle du dysfonctionnement du complexe du sphincter est devenue une approche d’avant-garde pour le traitement de la pathologie de l’UI 2,3. Ses principaux objectifs sont de remplacer, réparer et restaurer la fonctionnalité biologique du tissu endommagé. Dans les modèles animaux pour l’IU, la greffe de cellules souches a montré des résultats prometteurs dans les résultats urodynamiques 2,4,5. Les cellules souches apparaissent comme des candidates cellulaires optimales car elles ont la capacité de subir un auto-renouvellement et une différenciation multipotente, aidant ainsi la régénération des tissus affectés6. Malgré le potentiel régénératif à venir, l’utilisation pratique de la thérapie cellulaire reste entravée car l’administration mini-invasive de cellules est toujours confrontée à plusieurs défis concernant la précision de l’injection et la couverture de la cible. Même si l’approche actuelle utilisée pour l’administration des cellules est l’injection par un système aiguille-seringue7, il en résulte généralement un déficit global de cellules viables, avec des viabilités rapportées aussi faibles que 1% à 31% après la transplantation8. En outre, il a également été démontré que l’administration de cellules par injection d’aiguille affecte le placement, le taux de rétention, ainsi que la distribution des cellules transplantées dans le tissu ciblé 9,10,11. Une approche novatrice réalisable qui surmonte la limitation susmentionnée est l’administration de cellules sans aiguille via la technologie du jet d’eau.
La technologie du jet d’eau (WJ) émerge comme une nouvelle approche qui permet l’administration à haut débit de cellules par cystoscope sous contrôle visuel dans le sphincter urétral12,13. Le WJ permet la livraison de cellules à différentes pressions (E = effets en bar) allant de E5 à E8013. Dans la première phase, une solution isotonique (phase de pénétration tissulaire) est appliquée à haute pression (c.-à-d. E60 ou E80) afin de desserrer la matrice extracellulaire entourant le tissu ciblé et d’ouvrir de petites micro-lacunes interconnectées. Dans la deuxième phase (la phase d’injection), la pression est abaissée en quelques millisecondes (c’est-à-dire jusqu’à E10) afin de délivrer doucement les cellules dans le tissu ciblé. Suite à cette application en deux phases, les cellules ne sont pas soumises à une pression supplémentaire contre le tissu lorsqu’elles sont éjectées, mais flottent dans un flux à basse pression dans une zone caverneuse remplie de liquide13. Dans un contexte de modèle ex vivo où des cellules souches ont été injectées via WJ dans le tissu urétral cadavérique, les cellules viables pourraient ensuite être aspirées et extraites du tissu et élargies in vitro13. Bien qu’une étude réalisée en 2020 par Weber et al. ait démontré la faisabilité et l’applicabilité de WJ pour délivrer des cardiomyocytes sans empreinte dans le myocarde14, il faut garder à l’esprit que la technologie WJ est encore au stade de prototype.
Le protocole suivant décrit comment préparer et étiqueter les cellules stromales dérivées du tissu adipeux porcin (pADSC) et comment les administrer dans le liquide de capture et le tissu cadavérique via la technologie WJ et les aiguilles de cystoscopie Williams (WN). Après injection cellulaire, la vitalité et l’élasticité cellulaires par microscopie à force atomique (AFM) sont évaluées. Via des instructions étape par étape, le protocole donne une approche claire et concise pour acquérir des données fiables. La section de discussion présente et décrit les principaux avantages, limites et perspectives d’avenir de la technique. L’administration de cellules par WJ ainsi que les analyses post-traduction de séquelles rapportées ici remplacent l’injection d’aiguille standard et fournissent un cadre d’administration de cellules solides pour la guérison régénérative du tissu cible. Dans nos études récentes, nous avons fourni des preuves que WJ a délivré des cellules plus précisément et au moins à une viabilité comparable par rapport aux injections d’aiguilles 15,16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL BD Luer-LokTM Syringe</td>
			<td>BD Plastik Inc</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell sieve</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>542000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 tissue culture flask</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM head</td>
			<td>(CellHesion 200) JPK</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM processing software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM system Cell Hesion 200</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-In-One-Al cantilever</td>
			<td>Budget Sensors</td>
			<td>AIO-10</td>
			<td>tip A, Conatct Mode, Shape: Beam 
			Force Constant: 0.2 N/m (0.04 - 0.7 N/m) 
			Resonance Frequency: 15 kHz (10 - 20 kHz) 
			Length: 500 &#181;m (490 - 510 &#181;m) 
			Width: 30 &#181;m (35 - 45 &#181;m) 
			Thickness: 2.7 &#181;m (1.7 - 3.7 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2942</td>
			<td>250 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscope (AFM)</td>
			<td>CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microlance 3 18G</td>
			<td>BD</td>
			<td>304622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10008-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilever</td>
			<td>&#160;All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria</td>
			<td>AIO-TL-10</td>
			<td>tip A, k &#188; 0.2 N/m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-chip disposable hemocytometer</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>631-1098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge: Rotina 420R</td>
			<td>Hettich Zentrifugen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17100-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - low glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather disposable scalpel (No. 10)</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.30.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES sodium salt solution (1 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM)</td>
			<td>AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany</td>
			<td>L201306_03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laboratory bags</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium without l-glutamine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F1315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium without L-glutamine</td>
			<td>(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)</td>
			<td>F1315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE 17-605C1</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td>Calcein AM and EthD-1 are used from this kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope software: Zen 2.6</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope: AxioVertA.1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nelaton-Catheter female</td>
			<td>Bicakcilar</td>
			<td>19512051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10000 U/ml Penicillin 
			10000 &#181;g/ml Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater associated with AFM</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>T-05-0117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater associated with AFM</td>
			<td>JPK Instruments AG, Berlin, Germany</td>
			<td>T-05-0117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical Software: SPSS Statistics 22</td>
			<td>IBM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri dish - CellStar</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>TPP AG</td>
			<td>TPP93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland</td>
			<td>TPP93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4% 
			0.85% NaCl</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterjet: ERBEJET2 device</td>
			<td>Erbe Elektromedizin GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams Cystoscopic Injection Needle</td>
			<td>Cook Medical</td>
			<td>G14220</td>
			<td>23G, 5.0 Fr, 35 cm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injection of porcine adipose tissue-derived stroma cells via waterjet technology

L’incontinence urinaire (IU) est une affection très répandue caractérisée par une déficience du muscle du sphincter urétral. Les branches de la médecine régénérative, en particulier la thérapie cellulaire, sont de nouvelles approches pour améliorer et restaurer la fonction du sphincter urétral. Même si l’injection de cellules fonctionnelles actives est systématiquement effectuée en milieu clinique à l’aiguille et à la seringue, ces approches présentent des inconvénients et des limites importants. Dans ce contexte, la technologie du jet d’eau sans aiguille (WJ) est une méthode réalisable et innovante qui permet d’injecter des cellules viables par cystoscopie guidée visuellement dans le sphincter urétral. Dans la présente étude, nous avons utilisé WJ pour administrer des cellules stromales dérivées du tissu adipeux porcin (pADSC) dans le tissu urétral cadavérique et avons ensuite étudié l’effet de l’administration de WJ sur le rendement cellulaire et la viabilité. Nous avons également évalué les caractéristiques biomécaniques (c.-à-d. l’élasticité) par des mesures de microscopie à force atomique (AFM). Nous avons montré que les pADSC délivrés par WJ étaient significativement réduits dans leur élasticité cellulaire. La viabilité était significativement plus faible par rapport aux témoins, mais elle est toujours supérieure à 80%.

Après l’administration de cellules par les deux approches, la viabilité des cellules délivrées par le WN (97,2 ± 2 %, n = 10, p<0,002) était plus élevée que celle des injections par WJ utilisant les paramètres E60-10 (85,9 ± 0,16 %, n = 12) (Figure 2). Les résultats de l’évaluation biomécanique ont montré que : les injections de cellules dans le liquide de capture n’ont montré aucune différence significative par rapport aux modules élastiques (EM; 0,992 kPa) par rappor...

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Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stroma Cells via Waterjet Technology

Nous présentons une méthode d’injection cellulaire via la technologie de jet d’eau sans aiguille couplée à une séquelle d’investigations post-accouchement en termes de viabilité cellulaire, de prolifération et de mesures d’élasticité.

Injection de cellules stroma dérivées du tissu adipeux porcin via la technologie waterjet

Urinary incontinence (UI) is a highly prevalent condition characterized by the deficiency of the urethral sphincter muscle. Regenerative medicine ...

Les injections au jet d’eau de composants actifs, tels que des liquides, des nanoparticules, des microparticules, des médicaments encapsulés ou même des cellules vivantes, peuvent être appliquées beaucoup plus précisément que les injections d’aiguilles dans différents tissus ciblés. Les approches mini-invasives nécessitent une localisation précise du médicament dans des couches prédéterminées du tissu ciblé en présélectionnant les pressions d’injection. Nous nous concentrons actuellement sur la thérapie cellulaire pour l’incontinence urinaire.Cependant, cette technique a déjà été étendue à la régénération du tissu musculaire infecté après une crise cardiaque sévère. À l’heure actuelle, la technique ne peut être appliquée que par des chercheurs expérimentés ou des médecins agréés dans le cadre d’études précliniques. Il n’est pas destiné à être utilisé dans les procédures de laboratoire de routine car il est développé à des fins cliniques futures.Pour commencer, placez l’urètre avec la vessie de connexion disséquée d’un porc landrace femelle adulte sur une éponge qui imite l’élasticité du plancher pelvien inférieur. Ensuite, en utilisant la vessie, déterminez l’orientation de l’urètre. Cela est possible grâce à la localisation de l’uretère et des trois ligaments, qui fixent la vessie dans la cavité abdominale et pelvienne.Après avoir correctement orienté l’urètre, coupez-le longitudinalement sur la face dorsale à l’aide d’un cathéter. Après avoir ajusté la densité cellulaire des cellules stromales dérivées du tissu adipeux porcin à 2,4 fois 10 à la sixième cellule par millilitre, étiqueter les cellules avec une coloration de cellules vivantes perméable à la membrane fluorescente verte, puis aspirer la suspension cellulaire avec la seringue et appliquer l’aiguille d’injection cytoscopique Williams. Ensuite, maintenez l’aiguille peu au-dessus des deux millilitres de milieu de croissance dans un tube de centrifugation de 15 millilitres ou insérez l’aiguille dans le tissu de l’urètre ouvert.Dans les deux cas, injectez manuellement 250 microlitres de la suspension cellulaire. Cellules injectées dans l’urètre cadavérique à partir d’un dôme d’injection. Prélever les cellules injectées dans le milieu directement par centrifugation.Pour les cellules injectées dans l’urètre cadavérique, aspirez-les hors du dôme d’injection avec une aiguille de calibre 18 appliquée sur une seringue. Transférer les cellules aspirées dans un tube de centrifugation et les granuler par centrifugation. Remettre en suspension les deux pastilles cellulaires dans quatre millilitres de milieu de croissance.Pour déterminer le rendement cellulaire et la viabilité, mélangez soigneusement 20 de la suspension cellulaire avec 20 microlitres de bleu trypan. Remplissez ensuite 10 microlitres de ce mélange dans chaque chambre de l’hémocytomètre. Sous un microscope, comptez les cellules dans les quatre carrés d’angle.Comptez les globules blancs non colorés comme des cellules viables et les cellules colorées bleues comme des cellules mortes, puis calculez le nombre de cellules par millilitre. Pour les injections via le jet d’eau, ajuster la densité des cellules stromales dérivées du tissu adipeux porcin à six fois 10 à six cellules par millilitre. Étiquetez-les comme démontré précédemment et remplissez la suspension cellulaire dans l’unité de dosage du dispositif à jet d’eau sans aiguille.Ensuite, maintenez la buse d’injection peu au-dessus des deux millilitres de milieu de croissance dans un tube de centrifugation de 15 millilitres ou peu au-dessus du tissu urètre ouvert. Dans les deux cas, injectez 100 microlitres de la suspension cellulaire. Utilisez une pression élevée pour la pénétration des tissus, suivie d’une phase à basse pression pour les injections cellulaires.Les cellules injectées dans l’urètre cadavérique forment un dôme d’injection. Prélever des cellules injectées dans le milieu directement par centrifugation. Pour les cellules injectées dans l’urètre cadavérique, aspirez-les hors du dôme d’injection.Transférez les cellules aspirées dans un tube de centrifugation et abreuvez-les à l’aide de la centrifugation, comme démontré précédemment. Après centrifugation, remettre en suspension les deux granulés dans quatre millilitres de milieu de croissance. Ensemencez les cellules prélevées après injections dans des boîtes de culture tissulaire à une densité de cinq fois 10 à la cinquième cellule par plat.Après une incubation de trois heures à 37 degrés Celsius, et juste avant la mesure AFM, remplacez le milieu de croissance par trois millilitres de milieu L-15 de Leibovitz sans L-glutamine. Pour mesurer l’élasticité des cellules individuelles, identifiez visuellement une cellule et concentrez-vous dessus. Ensuite, placez la souris de l’ordinateur au milieu de la cellule et pour améliorer la précision des mesures, positionnez la pointe AFM directement au-dessus du noyau de la cellule.Ensuite, concentrez-vous sur le porte-à-faux et déplacez-le sur la souris de l’ordinateur. Ensuite, commencez la mesure avec run et mesurez au moins 50 cellules. Le paramètre de consigne obtenu par étalonnage du porte-à-faux est utilisé et une cellule est mesurée trois fois.La viabilité des cellules délivrées par l’aiguille Williams était supérieure à celle des injections par le jet d’eau utilisant les réglages E60-10. L’évaluation biomécanique des injections dans le liquide de capture a révélé que les injections à l’aiguille de Williams ne présentaient aucune différence significative dans les modules élastiques par rapport aux témoins, tandis que les injections au jet d’eau réduisaient significativement les modules élastiques cellulaires de 40 à 50% De même, dans les échantillons de tissu d’urètre cadavérique, les injections d’aiguilles de Williams n’ont donné aucune différence significative dans les modules élastiques cellulaires par rapport aux témoins. Cependant, une réduction significative de 51% a été observée après les injections de jet d’eau.Il suffit de s’assurer que les injections d’aiguilles ne pénètrent pas complètement dans le tissu qui inflige des blessures. Avec le jet d’eau, il suffit de placer l’appareil dans la bonne position dans la zone d’injection tandis que le reste est automatiquement effectué par l’appareil lui-même. Comme le dispositif à jet d’eau a été développé pour correspondre et s’adapter aux dispositifs endoscopiques, vous pouvez utiliser les applications de jet d’eau pour n’importe quel site du corps qui peut être atteint par ces technologies cystoscopiques ou endoscopiques pour régénérer les tissus et faire le travail de réparation.

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