Name: injection of porcine adipose tissue-derived stroma cells via waterjet technology
Uploaded: 2021-11-23T15:00:00
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Ringraziamo i nostri co-autori delle pubblicazioni originali per il loro aiuto e supporto.

I campioni di tessuto adiposo suino sono stati ottenuti dall'Istituto di Chirurgia Sperimentale dell'Università di Tubinga. Tutte le procedure sono state approvate dalle autorità locali per il benessere degli animali con il numero di esperimento animale CU1/16.
1. Isolamento delle cellule stromali derivate dal tessuto adiposo suino
<ol><li>Utilizzare tessuto adiposo suino consegnato dall'Istituto di Chirurgia Sperimentale in un tubo centrifugo da 50 ml al laboratorio.</li>...

Nel presente studio, abbiamo dimostrato e presentato un approccio graduale per la procedura di consegna delle cellule WJ e abbiamo impiegato una sequela di indagini quantitative per valutare l'effetto della consegna di WJ sulle caratteristiche cellulari: vitalità cellulare e caratteristiche biomeccaniche (cioè EM). Dopo l'iniezione di WJ, l'85,9% delle cellule raccolte era vitale. In termini di iniezione di WN, il 97,2% delle cellule ha mantenuto la propria vitalità dopo l'iniezione. Pertanto, l'approccio WJ soddisfa ...

L'incontinenza urinaria (UI) è una malattia diffusa con una prevalenza dell'1,8 - 30,5% nelle popolazioni europee1 ed è caratterizzata principalmente da malfunzionamenti dello sfintere uretrale. Da un punto di vista clinico, il trattamento chirurgico viene spesso offerto ai pazienti quando le terapie conservative o la fisioterapia non riescono ad affrontare e alleviare i sintomi emergenti.
La terapia cellulare per la potenziale riparazione rigenerativa del malfunzionamento del complesso sfinterico sta emergendo come approccio all'avanguardia per il trattamento della patologia UI 2,3. I suoi obiettivi principali sono sostituire, riparare e ripristinare la funzionalità biologica del tessuto danneggiato. Nei modelli animali per l'UI, il trapianto di cellule staminali ha mostrato risultati promettenti in esiti urodinamici 2,4,5. Le cellule staminali si presentano come candidati cellulari ottimali in quanto hanno la capacità di subire l'auto-rinnovamento e la differenziazione multipotente, aiutando così la rigenerazione del tessuto interessato6. Nonostante l'imminente potenziale rigenerativo, l'uso pratico della terapia cellulare rimane ostacolato poiché la somministrazione minimamente invasiva di cellule deve ancora affrontare diverse sfide riguardanti la precisione dell'iniezione e la copertura del bersaglio. Anche se l'attuale approccio utilizzato per la consegna cellulare è l'iniezione attraverso un sistema di siringa ad ago7, di solito si traduce in un deficit complessivo di cellule vitali, con viabilità segnalate a partire dall'1% al 31% dopo il trapianto8. Inoltre, la somministrazione di cellule tramite iniezione con ago ha anche dimostrato di influenzare il posizionamento, il tasso di ritenzione e la distribuzione delle cellule trapiantate nel tessuto bersaglio 9,10,11. Un approccio fattibile e nuovo che supera la limitazione di cui sopra è la consegna di cellule senza ago tramite la tecnologia a getto d'acqua.
La tecnologia Waterjet (WJ) sta emergendo come un nuovo approccio che consente la consegna ad alto rendimento delle cellule tramite cistoscopio sotto controllo visivo nello sfintere uretrale12,13. Il WJ consente l'erogazione di celle a diverse pressioni (E = effetti in bar) che vanno da E5 a E8013. Nella prima fase, (fase di penetrazione tissutale) la soluzione isotonica viene applicata ad alta pressione (cioè E60 o E80) al fine di allentare la matrice extracellulare che circonda il tessuto bersaglio e aprire piccole micro-lacune interconnesse. Nella seconda fase (la fase di iniezione), la pressione viene abbassata entro millisecondi (cioè fino a E10) per consegnare delicatamente le cellule nel tessuto bersaglio. A seguito di questa applicazione in due fasi, le cellule non sono sottoposte a pressione aggiuntiva contro il tessuto quando vengono espulse, ma galleggiano in un flusso a bassa pressione in un'area cavernosa piena di liquido13. In un ambiente modello ex vivo in cui le cellule staminali sono state iniettate tramite WJ nel tessuto cadaverico dell'uretra, le cellule vitali potrebbero essere successivamente aspirate e recuperate dal tessuto e ulteriormente espanse in vitro13. Sebbene uno studio del 2020 di Weber et al. abbia dimostrato la fattibilità e l'applicabilità di WJ per fornire cardiomiociti privi di impronta nel miocardio14, va tenuto presente che la tecnologia WJ è ancora in fase di prototipo.
Il seguente protocollo descrive come preparare ed etichettare le cellule stromali derivate dal tessuto adiposo suino (pADSC) e come consegnarle nel fluido di cattura e nel tessuto cadaverico tramite la tecnologia WJ e gli aghi per cistoscopia Williams (WN). Dopo l'iniezione cellulare, viene valutata la vitalità e l'elasticità cellulare tramite microscopia a forza atomica (AFM). Tramite istruzioni dettagliate, il protocollo fornisce un approccio chiaro e conciso per acquisire dati affidabili. La sezione di discussione presenta e descrive i principali vantaggi, limiti e prospettive future della tecnica. La consegna delle cellule WJ e le analisi post traduzione della sequela riportate qui stanno sostituendo l'iniezione standard dell'ago e forniscono un quadro di consegna delle cellule solide per la guarigione rigenerativa del tessuto bersaglio. Nei nostri recenti studi abbiamo fornito prove che WJ ha consegnato le cellule in modo più preciso e almeno con una vitalità comparabile rispetto alle iniezioni di ago15,16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL BD Luer-LokTM Syringe</td>
			<td>BD Plastik Inc</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell sieve</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>542000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 tissue culture flask</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM head</td>
			<td>(CellHesion 200) JPK</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM processing software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM system Cell Hesion 200</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-In-One-Al cantilever</td>
			<td>Budget Sensors</td>
			<td>AIO-10</td>
			<td>tip A, Conatct Mode, Shape: Beam 
			Force Constant: 0.2 N/m (0.04 - 0.7 N/m) 
			Resonance Frequency: 15 kHz (10 - 20 kHz) 
			Length: 500 &#181;m (490 - 510 &#181;m) 
			Width: 30 &#181;m (35 - 45 &#181;m) 
			Thickness: 2.7 &#181;m (1.7 - 3.7 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2942</td>
			<td>250 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscope (AFM)</td>
			<td>CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microlance 3 18G</td>
			<td>BD</td>
			<td>304622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10008-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilever</td>
			<td>&#160;All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria</td>
			<td>AIO-TL-10</td>
			<td>tip A, k &#188; 0.2 N/m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-chip disposable hemocytometer</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>631-1098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge: Rotina 420R</td>
			<td>Hettich Zentrifugen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17100-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - low glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather disposable scalpel (No. 10)</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.30.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES sodium salt solution (1 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM)</td>
			<td>AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany</td>
			<td>L201306_03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laboratory bags</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium without l-glutamine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F1315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium without L-glutamine</td>
			<td>(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)</td>
			<td>F1315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE 17-605C1</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td>Calcein AM and EthD-1 are used from this kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope software: Zen 2.6</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope: AxioVertA.1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nelaton-Catheter female</td>
			<td>Bicakcilar</td>
			<td>19512051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10000 U/ml Penicillin 
			10000 &#181;g/ml Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater associated with AFM</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>T-05-0117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater associated with AFM</td>
			<td>JPK Instruments AG, Berlin, Germany</td>
			<td>T-05-0117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical Software: SPSS Statistics 22</td>
			<td>IBM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri dish - CellStar</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>TPP AG</td>
			<td>TPP93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland</td>
			<td>TPP93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4% 
			0.85% NaCl</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterjet: ERBEJET2 device</td>
			<td>Erbe Elektromedizin GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams Cystoscopic Injection Needle</td>
			<td>Cook Medical</td>
			<td>G14220</td>
			<td>23G, 5.0 Fr, 35 cm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injection of porcine adipose tissue-derived stroma cells via waterjet technology

L'incontinenza urinaria (UI) è una condizione altamente prevalente caratterizzata dalla carenza del muscolo sfintere uretrale. I rami della medicina rigenerativa, in particolare la terapia cellulare, sono nuovi approcci per migliorare e ripristinare la funzione dello sfintere uretrale. Anche se l'iniezione di cellule funzionali attive viene eseguita di routine in contesti clinici con ago e siringa, questi approcci presentano svantaggi e limitazioni significativi. In questo contesto, la tecnologia waterjet (WJ) senza ago è un metodo fattibile e innovativo in grado di iniettare cellule vitali mediante cistoscopia guidata visivamente nello sfintere uretrale. Nel presente studio, abbiamo utilizzato WJ per fornire cellule stromali derivate dal tessuto adiposo suino (pADSC) nel tessuto uretrale cadaverico e successivamente abbiamo studiato l'effetto della consegna di WJ sulla resa cellulare e sulla vitalità. Abbiamo anche valutato le caratteristiche biomeccaniche (cioè l'elasticità) mediante misurazioni al microscopio a forza atomica (AFM). Abbiamo dimostrato che le pADSC consegnate da WJ erano significativamente ridotte nella loro elasticità cellulare. La redditività è stata significativamente inferiore rispetto ai controlli, ma è ancora superiore all'80%.

Dopo la somministrazione cellulare attraverso i due approcci, la vitalità delle cellule erogate attraverso il WN (97,2 ± 2%, n = 10, p <0,002) era più elevata rispetto alle iniezioni di WJ utilizzando le impostazioni E60-10 (85,9 ± 0,16%, n = 12) (Figura 2). I risultati della valutazione biomeccanica hanno mostrato che: le iniezioni di WN di cellule nel fluido di cattura non mostravano differenze significative rispetto ai moduli elastici (EM; 0,992 kPa) rispetto ai controlli (1,176 kPa; ...

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Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stroma Cells via Waterjet Technology

Presentiamo un metodo di iniezione cellulare tramite tecnologia waterjet senza ago accoppiato con una sequela di indagini post-parto in termini di vitalità cellulare, proliferazione ed misure di elasticità.

Iniezione di cellule stroma derivate dal tessuto adiposo suino tramite tecnologia Waterjet

Urinary incontinence (UI) is a highly prevalent condition characterized by the deficiency of the urethral sphincter muscle. Regenerative medicine ...

Le iniezioni a getto d'acqua di componenti attivi, come liquidi, nanoparticelle, microparticelle, farmaci incapsulati o persino cellule viventi possono essere applicate in modo molto più preciso rispetto alle iniezioni di ago in diversi tessuti presi di mira. Gli approcci minimamente invasivi richiedono una localizzazione precisa del farmaco in strati predeterminati del tessuto bersaglio preselezionando le pressioni di iniezione. Il nostro obiettivo attuale è la terapia cellulare per l'incontinenza urinaria.Tuttavia, questa tecnica è già stata estesa alla rigenerazione del tessuto muscolare infetto dopo gravi attacchi di cuore. Allo stato attuale, la tecnica può essere applicata solo da ricercatori esperti o medici autorizzati in studi pre-clinici. Non è destinato ad essere utilizzato nelle procedure di laboratorio di routine in quanto è sviluppato per scopi clinici futuri.Per iniziare, posizionare l'uretra con la vescica di collegamento sezionata da un maiale femmina adulto su una spugna che imita l'elasticità del pavimento pelvico inferiore. Quindi utilizzando la vescica, determinare l'orientamento dell'uretra. Ciò è possibile grazie alla localizzazione dell'uretere e dei tre legamenti, che fissano la vescica nella cavità addominale e pelvica.Dopo aver orientato correttamente l'uretra, tagliarla longitudinalmente sul lato dorsale con l'aiuto di un catetere. Dopo aver regolato la densità cellulare delle cellule stromali derivate dal tessuto adiposo suino a 2,4 volte 10-sesta cellula per millilitro, etichettare le cellule con una membrana fluorescente verde permeabile alla macchia di cellule vive, quindi aspirare la sospensione cellulare con la siringa e applicare l'ago per iniezione citoscopica Williams. Quindi, tenere l'ago poco sopra i due millilitri di terreno di crescita in un tubo di centrifugazione da 15 millilitri o inserire l'ago nel tessuto uretrale aperto.In entrambi i casi, iniettare manualmente 250 microlitri della sospensione cellulare. Cellule iniettate nell'uretra cadaverica da una cupola di iniezione. Raccogliere le cellule iniettate nel mezzo direttamente mediante centrifugazione.Per le cellule iniettate nell'uretra cadaverica, aspirarle fuori dalla cupola di iniezione con un ago calibro 18 applicato su una siringa. Trasferire le celle aspirate in un tubo di centrifugazione e pellettarle mediante centrifugazione. Sospendere entrambi i pellet di cella in quattro millilitri di terreno di crescita.Per determinare la resa e la vitalità delle cellule, mescolare accuratamente 20 della sospensione cellulare con 20 microlitri di tripano blu. Quindi riempire 10 microlitri di questa miscela in ogni camera dell'emocitometro. Al microscopio contate le cellule in tutti e quattro i quadrati d'angolo.Conta i globuli bianchi non macchiati come cellule vitali e le cellule macchiate di blu come cellule morte, quindi calcola il numero di cellule per millilitro. Per le iniezioni tramite il getto d'acqua, regolare la densità delle cellule stromali derivate dal tessuto adiposo suino a sei volte da 10 a sei cellule per millilitro. Etichettarli come dimostrato in precedenza e riempire la sospensione cellulare nell'unità di dosaggio del dispositivo a getto d'acqua senza ago.Quindi tenere l'ugello di iniezione poco sopra i due millilitri di terreno di crescita in un tubo di centrifugazione da 15 millilitri o poco sopra il tessuto uretrale aperto. In entrambi i casi, iniettare 100 microlitri della sospensione cellulare. Utilizzare alta pressione per la penetrazione dei tessuti seguita da una fase di bassa pressione per le iniezioni cellulari.Le cellule iniettate nell'uretra cadaverica formano una cupola di iniezione. Raccogliere le cellule iniettate nel mezzo direttamente mediante centrifugazione. Per le cellule iniettate nell'uretra cadaverica, aspirarle fuori dalla cupola di iniezione.Trasferire le celle aspirate in un tubo di centrifugazione e pellettarle utilizzando la centrifugazione come dimostrato in precedenza. Dopo la centrifugazione, risospesare entrambi i pellet in quattro millilitri di mezzi di crescita. Semina le cellule recuperate dopo le iniezioni in piatti di coltura tissutale ad una densità di cinque volte 10 alle quinte cellule per piatto.Dopo un'incubazione di tre ore a 37 gradi Celsius, e subito prima della misurazione AFM, sostituire il mezzo di crescita con tre millilitri di mezzi L-15 di Leibovitz senza L-glutammina. Per misurare l'elasticità delle singole cellule, identificare visivamente una cellula e concentrarsi su di essa. Quindi posizionare il mouse del computer al centro della cella e per migliorare la precisione delle misurazioni, posizionare la punta AFM direttamente sopra il nucleo della cella.Quindi, concentrati sul cantilever e spostalo sul mouse del computer. Quindi iniziare la misurazione con run e misurare almeno 50 celle. Viene utilizzato il parametro del set point ottenuto dalla calibrazione del cantilever e una cella viene misurata tre volte.La vitalità delle cellule erogate attraverso l'ago Williams era superiore alle iniezioni dal getto d'acqua utilizzando le impostazioni E60-10. La valutazione biomeccanica delle iniezioni nel fluido di cattura ha rivelato che le iniezioni con ago Williams non mostravano differenze significative nei moduli elastici rispetto ai controlli, mentre le iniezioni a getto d'acqua riducevano significativamente i moduli elastici cellulari dal 40 al 50% Allo stesso modo, nei campioni di tessuto uretrale cadaverico, le iniezioni di ago Williams non producevano differenze significative nei moduli elastici cellulari rispetto ai controlli. Tuttavia, una riduzione significativa del 51% è stata osservata dopo iniezioni a getto d'acqua.Bisogna solo assicurarsi che le iniezioni dell'ago non penetrino completamente nel tessuto che sta infliggendo lesioni. Con il getto d'acqua, si deve solo posizionare il dispositivo nella posizione corretta nell'area di iniezione mentre il resto viene eseguito automaticamente dal dispositivo stesso. Poiché il dispositivo a getto d'acqua è stato sviluppato per abbinarsi e adattarsi ai dispositivi endoscopici, è possibile utilizzare le applicazioni a getto d'acqua per qualsiasi sito del corpo che può essere raggiunto da queste tecnologie cistoscopiche o endoscopiche per rigenerare i tessuti e fare il lavoro di riparazione.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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