Name: injection of porcine adipose tissue-derived stroma cells via waterjet technology
Uploaded: 2021-11-23T15:00:00
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元の出版物の共著者の助けとサポートに感謝します。

ブタ脂肪組織サンプルは、チュービンゲン大学の実験外科研究所から入手した。すべての手順は、動物実験番号CU1/16の下で地元の動物福祉当局によって承認された。
1. ブタ脂肪組織由来間質細胞の単離
<ol><li>実験外科学研究所から50mLの遠沈管に入れて実験室に届けたブタ脂肪組織を使用してください。</li>
	<li>組織を滅菌ベンチの下の滅菌ペトリ皿に移し?...

本研究では、WJ細胞送達手順の段階的なアプローチを実証および提示し、WJ送達が細胞特性に及ぼす影響を評価するために定量的調査の後遺症を採用した:細胞生存率および生体力学的特徴(すなわち、EM)。WJ注射後、回収された細胞の85.9%が生存可能であった。WN注射に関しては、細胞の97.2%が注射後に生存率を保持していた。したがって、WJアプローチは、臨床実施のための絶対的な要件を満た...

尿失禁(UI)は、ヨーロッパ集団1 における有病率が1.8〜30.5%の広範な疾患であり、主に尿道括約筋の機能不全によって特徴付けられる。臨床的観点からは、外科的治療は、保守的な治療法または理学療法が新たな症状に対処し、緩和できない場合に患者に提供されることが多い。
括約筋複合体の潜在的な再生修復のための細胞療法は、UI病理2、3の治療のための前衛的なアプローチとして浮上している。その主な目標は、損傷した組織の生物学的機能を置換、修復および回復させることである。UIのための動物モデルにおいて、幹細胞移植は、尿力学的転帰において有望な結果を示している2,4,5。幹細胞は、自己複製および多能性分化を受ける能力を有するため、最適な細胞候補として生じ、したがって、罹患組織再生6を補助する。来るべき再生の可能性にもかかわらず、細胞の低侵襲送達は依然として標的の注入精度およびカバレッジに関するいくつかの課題に直面しているため、細胞療法の実用化は依然として妨げられている。細胞送達に使用される現在のアプローチは、針注射器システム7を介した注射であるにもかかわらず、それは通常、生細胞の全体的な欠損をもたらし、移植後の生存率は1%〜31%と低いと報告されている8。加えて、針注射を介した細胞送達は、標的組織への移植細胞の配置、保持率、ならびに分布に影響を与えることも示されている9、10、11。上記の制限を克服する実現可能で斬新なアプローチは、ウォータージェット技術を介した無針細胞送達である。
ウォータージェット(WJ)技術は、尿道括約筋12、13における視覚的制御下での膀胱鏡による細胞のハイスループット送達を可能にする新しいアプローチとして浮上しつつある。WJは、E5からE8013までの異なる圧力(E = バーの効果)での細胞送達を可能にします。第1相では、等張溶液(組織浸透相)は、組織標的および開放された小さな相互連結マイクロラクナを囲む細胞外マトリックスを緩めるために高圧(すなわち、E60またはE80)で適用される。第2段階(注入段階)では、細胞を標的組織に穏やかに送達するために、圧力をミリ秒以内に(すなわち、E10まで)低下させる。この2つの段階的適用に続いて、細胞は、放出されるときに組織に対して追加の圧力を受けるのではなく、液体充填海綿状領域13に低圧流中に浮遊する。幹細胞をWJを介して死体尿道組織に注入したエキソビボモデル設定では、生存細胞をその後吸引して組織から取り出し、インビトロでさらに拡大することができた13。Weberらによる2020年の研究では、フットプリントのない心筋細胞を心筋14に送達するためのWJの実現可能性と適用可能性が実証されましたが、WJ技術はまだプロトタイプ段階にあることに留意する必要があります。
以下のプロトコルは、ブタ脂肪組織由来間質細胞(pADSC)を調製および標識する方法、およびWJ技術およびウィリアムズ膀胱鏡検査針(WN)を介してそれらを捕捉液および死体組織に送達する方法を説明する。細胞注射後、原子間力顕微鏡(AFM)を介して細胞の活力および弾性が評価される。ステップバイステップの手順により、プロトコルは信頼性の高いデータを取得するための明確で簡潔なアプローチを提供します。ディスカッションセクションでは、この技術の主な利点、制限、および将来の見通しを提示し、説明します。ここで報告されたWJ細胞送達および後遺症翻訳後分析は、標準的な針注射に取って代わり、標的組織の再生治癒のための固体細胞送達フレームワークを提供する。我々の最近の研究では、針注射と比較して、WJがより正確かつ少なくとも同等の生存率で細胞を送達したという証拠を提供しました15,16。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL BD Luer-LokTM Syringe</td>
			<td>BD Plastik Inc</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell sieve</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>542000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 tissue culture flask</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM head</td>
			<td>(CellHesion 200) JPK</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM processing software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM system Cell Hesion 200</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-In-One-Al cantilever</td>
			<td>Budget Sensors</td>
			<td>AIO-10</td>
			<td>tip A, Conatct Mode, Shape: Beam 
			Force Constant: 0.2 N/m (0.04 - 0.7 N/m) 
			Resonance Frequency: 15 kHz (10 - 20 kHz) 
			Length: 500 &#181;m (490 - 510 &#181;m) 
			Width: 30 &#181;m (35 - 45 &#181;m) 
			Thickness: 2.7 &#181;m (1.7 - 3.7 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2942</td>
			<td>250 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscope (AFM)</td>
			<td>CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microlance 3 18G</td>
			<td>BD</td>
			<td>304622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10008-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilever</td>
			<td>&#160;All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria</td>
			<td>AIO-TL-10</td>
			<td>tip A, k &#188; 0.2 N/m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-chip disposable hemocytometer</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>631-1098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge: Rotina 420R</td>
			<td>Hettich Zentrifugen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17100-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - low glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather disposable scalpel (No. 10)</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.30.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES sodium salt solution (1 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM)</td>
			<td>AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany</td>
			<td>L201306_03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laboratory bags</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium without l-glutamine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F1315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium without L-glutamine</td>
			<td>(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)</td>
			<td>F1315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE 17-605C1</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td>Calcein AM and EthD-1 are used from this kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope software: Zen 2.6</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope: AxioVertA.1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nelaton-Catheter female</td>
			<td>Bicakcilar</td>
			<td>19512051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10000 U/ml Penicillin 
			10000 &#181;g/ml Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater associated with AFM</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>T-05-0117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater associated with AFM</td>
			<td>JPK Instruments AG, Berlin, Germany</td>
			<td>T-05-0117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical Software: SPSS Statistics 22</td>
			<td>IBM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri dish - CellStar</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>TPP AG</td>
			<td>TPP93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland</td>
			<td>TPP93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4% 
			0.85% NaCl</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterjet: ERBEJET2 device</td>
			<td>Erbe Elektromedizin GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams Cystoscopic Injection Needle</td>
			<td>Cook Medical</td>
			<td>G14220</td>
			<td>23G, 5.0 Fr, 35 cm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injection of porcine adipose tissue-derived stroma cells via waterjet technology

尿失禁(UI)は、尿道括約筋の欠乏を特徴とする非常に一般的な状態である。再生医療の枝、特に細胞療法は、尿道括約筋機能を改善および回復させるための新しいアプローチです。活性機能細胞の注射は、臨床現場で針および注射器によって日常的に行われているが、これらのアプローチには重大な欠点および限界がある。この文脈において、無針ウォータージェット(WJ)技術は、尿道括約筋に視覚的誘導膀胱鏡検査によって生細胞を注入することができる実現可能で革新的な方法である。本研究では、WJを用いてブタ脂肪組織由来間質細胞(pADSC)を死体尿道組織に送達し、その後、WJ送達が細胞収量および生存率に及ぼす影響を調査した。我々はまた、原子間力顕微鏡(AFM)測定によって生体力学的特徴(すなわち、弾性)を評価した。我々は、WJ送達されたpADSCsが細胞弾性において有意に低下することを示した。生存率は対照と比較して有意に低かったが、依然として80%を超えている。

2つのアプローチによる細胞送達に続いて、WN(97.2 ± 2%、n=10、p<0.002)を介して送達された細胞の生存率は、E60-10設定(85.9 ± 0.16%、n=12)を用いたWJによる注射と比較して高かった(図2)。生体力学的評価結果は、以下のことを示した:捕捉液中の細胞のWN注射は、対照(1.176kPa; 図3A)、WJ注射は細胞EMの有意な減少を誘発したが(0.440kPa、p<0.001、 図...

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Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stroma Cells via Waterjet Technology

我々は、無針ウォータージェット技術による細胞注射の方法と、細胞生存率、増殖、および弾性測定の観点からの送達後調査の後遺症と組み合わせた方法を提示する。

ウォータージェット技術によるブタ脂肪組織由来間質細胞の注入

Urinary incontinence (UI) is a highly prevalent condition characterized by the deficiency of the urethral sphincter muscle. Regenerative medicine ...

液体、ナノ粒子、微粒子、封入薬物、さらには生細胞などの活性成分のウォータージェット注射は、標的とする異なる組織における針状注射と比較して、はるかに正確に適用することができる。低侵襲アプローチでは、注射圧力を事前に選択することによって、標的組織の所定の層における薬物の正確な局在化が必要である。私たちの現在の焦点は、尿失禁のための細胞療法です。しかし、この技術は、重度の心臓発作後の感染した筋肉組織の再生にすでに拡張されている。現在、この技術は、前臨床試験において経験豊富な研究者または認可された医師のみが適用することができる。将来の臨床目的のために開発されているため、日常的な実験室手順で使用することを意図したものではありません。まず、成体の雌のランドレースブタから解剖した接続膀胱で尿道を、骨盤底下部の弾力性を模倣したスポンジの上に置きます。次に、膀胱を使用して、尿道の向きを決定する。これは、腹腔および骨盤腔内の膀胱を固定する尿管および3つの靭帯の局在化のために可能である。尿道を正しく向けた後、カテーテルの助けを借りて背側で縦方向に切り開きます。ブタ脂肪組織由来間質細胞の細胞密度を1ミリリットル当たり10~6個目の細胞の2.4倍に調整した後、緑色蛍光膜透過性生細胞染色剤で細胞を標識し、次いで細胞懸濁液をシリンジで吸引し、ウィリアムズ細胞鏡注射針を塗布する。次に、15ミリリットルの遠心チューブ内の2ミリリットルの成長培地のすぐ上に針を保持するか、開いた尿道組織に針を挿入します。どちらの場合も、250マイクロリットルの細胞懸濁液を手動で注入する。注射ドームから死体尿道に注入された細胞。培地に注入した細胞を遠心分離により直接集める。死体尿道に注入された細胞の場合、注射器に塗布された18ゲージの針で注射ドームからそれらを吸引する。吸引した細胞を遠心チューブに移し、遠心分離によりペレット化する。両方の細胞ペレットを4ミリリットルの成長培地に再懸濁する。細胞収量および生存率を決定するために、20個の細胞懸濁液を20マイクロリットルのトリパンブルーと十分に混合する。次いで、この混合物の10マイクロリットルを血球計器の各チャンバーに充填する。顕微鏡下で、四隅の四角すべての細胞を数えます。染色されていない白色細胞を生細胞として、青色染色された細胞を死細胞としてカウントし、ミリリットル当たりの細胞数を計算する。ウォータージェットを介した注射の場合、ブタ脂肪組織由来間質細胞の密度を1ミリリットル当たり10~6細胞の6倍に調整する。先に示したようにそれらをラベル付けし、無針ウォータージェット装置の投与ユニットに細胞懸濁液を充填する。次いで、噴射ノズルを15ミリリットルの遠心チューブ内の2ミリリットルの成長培地のすぐ上または開いた尿道組織の少し上に保持する。どちらの場合も、100マイクロリットルの細胞懸濁液を注入する。組織浸透には高圧を使用し、続いて細胞注射には低圧フェーズを使用します。死体尿道に注入された細胞は、注射ドームを形成する。培地に注入した細胞を遠心分離により直接採取する。死体尿道に注入された細胞については、注射ドームから吸引する。吸引した細胞を遠心チューブに移し、先に示したように遠心分離を用いてペレット化する。遠心分離後、両方のペレットを4ミリリットルの成長培地に再懸濁する。注射後に取り出した細胞を組織培養皿に5倍の密度で10~5個の細胞を1皿あたり5個に播種する。摂氏37度で3時間インキュベーションした後、AFM測定の直前に、成長培地をL-グルタミンを含まない3ミリリットルのLeibovitzのL-15培地と交換する。個々の細胞の弾力性を測定するには、1つの細胞を視覚的に識別し、それに焦点を合わせます。次に、コンピュータマウスをセルの中央に配置し、測定精度を向上させるために、AFMチップをセル核の真上に配置します。次に、片持ち梁に焦点を合わせ、コンピュータのマウスで動かします。その後、runで測定を開始し、少なくとも50個のセルを測定します。片持ち梁の校正により得られた設定点パラメータを用い、1つのセルを3回測定する。ウィリアムズ針を介して送達された細胞の生存率は、E60-10設定を用いたウォータージェットによる注射よりも高かった。捕捉液中の注射の生体力学的評価は、ウィリアムズ針注射は対照と比較して弾性率に有意差を示さなかったことを明らかにしたが、ウォータージェット注射は細胞弾性率を40〜50%有意に低下させた同様に、死体尿道組織サンプルにおいて、ウィリアムズ針注射は対照と比較して細胞弾性率に有意差をもたらさなかった。しかし、ウォータージェット注射後に51%の有意な減少が観察された。針注射が怪我をしている組織に完全に浸透していないことを確認するだけです。ウォータージェットでは、デバイスを注入領域の正しい位置に配置するだけでよく、残りはデバイス自体によって自動的に行われます。ウォータージェット装置は、内視鏡装置に適合し、適合するように開発されたので、組織を再生し、修復作業を行うために、これらの膀胱鏡または内視鏡技術によって到達することができる体内の任意の部位のためのウォータージェットアプリケーションを使用することができます。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

筋肉再生のマウスモデルにおける誘導多能性幹細胞由来メソアンジオ芽細胞様筋原性前駆細胞の移植

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

三次元インクジェット印刷技術を用いて、ヒト軟骨組織の作製

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

豚の心臓にローカルカテーテルを注入するための注射や薬物を装填した超分子ヒドロゲル

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

組織工学のための血管新生単位としてマウスの脂肪組織由来の微小血管フラグメントの単離

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

自動 Microbioreactor 技術を用いた異種タンパク質生産の最適化のための汎用プロトコル

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

腎組織のプライマリ セグメントと新規スキャフォールド フリー構造技術と定款の

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

分離と全体ブタ膵臓の Decellularization

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

一軸引張ひずみ下での生細胞における核動態の高分解能イメージング

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

Encapsulated Cell Technology for the Delivery of Biologics to the Mouse Eye

マウスアイへの生物学的製剤の送達のためのカプセル化された細胞技術

Many current therapeutics under development for diseases of the posterior pole of the eye are biologics. These drugs need to be administered frequently, ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

3D細胞-細胞-膵組織コンストラクトを印刷するための膵組織由来細胞外マトリックスバイオインク

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...