Name: injection of porcine adipose tissue-derived stroma cells via waterjet technology
Uploaded: 2021-11-23T15:00:00
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Agradecemos aos nossos coautores das publicações originais pela ajuda e apoio.

As amostras de tecido adiposo porcina foram obtidas do Instituto de Cirurgia Experimental da Universidade de Tuebingen. Todos os procedimentos foram aprovados pelas autoridades locais de bem-estar animal sob o número de experimento animal CU1/16.
1. Isolamento de células estromais derivadas do tecido adiposo suíno
<ol><li>Use tecido adiposo porcino entregue do Instituto de Cirurgia Experimental em um tubo de centrífuga de 50 mL para o laboratório.</li>
	<li>Transfira o ...

No presente estudo, demonstramos e apresentamos uma abordagem passo a passo para o procedimento de entrega de células WJ e empregamos uma sequência de investigações quantitativas para avaliar o efeito da entrega de WJ em características celulares: viabilidade celular e características biomecânicas (ou seja, EM). Após a injeção de WJ, 85,9% das células colhidas eram viáveis. Em termos de injeção de WN, 97,2% das células mantiveram sua viabilidade após a injeção. Assim, a abordagem do WJ preenche um requi...

A incontinência urinária (UI) é uma doença generalizada com prevalência de 1,8 - 30,5% nas populações europeias1 e caracteriza-se principalmente pelo mau funcionamento do esfíncter uretral. Do ponto de vista clínico, o tratamento cirúrgico é frequentemente oferecido aos pacientes quando terapias conservadoras ou fisioterapia não conseguem abordar e aliviar os sintomas emergentes.
A terapia celular para o potencial reparo regenerativo do mau funcionamento do complexo esfíncter vem surgindo como uma abordagem vanguardista para o tratamento da patologia da interfacedo usuário 2,3. Seus principais objetivos são substituir, reparar e restaurar a funcionalidade biológica do tecido danificado. Em modelos animais para interface do usuário, o transplante de células-tronco tem mostrado resultados promissores em desfechos uroddinâmicos 2,4,5. As células-tronco surgem como candidatos celulares ideais, pois têm a capacidade de se submeter à autoconexão e diferenciação multipotente, auxiliando assim a regeneração tecidual afetada6. Apesar do próximo potencial regenerativo, o uso prático da terapia celular permanece dificultado, pois o parto minimamente invasivo das células ainda enfrenta vários desafios em relação à precisão da injeção e à cobertura do alvo. Embora a abordagem atual usada para o parto celular seja a injeção através de um sistema de seringaagulha 7, geralmente resulta em um déficit geral de células viáveis, com viabilidades relatadas tão baixas quanto 1%- 31% pós-transplante8. Além disso, a entrega de células por injeção de agulha também tem sido demonstrada para afetar a colocação, a taxa de retenção, bem como a distribuição de células transplantadas no tecido alvo 9,10,11. Uma abordagem viável e nova que supera a limitação acima mencionada é a entrega de células livres de agulhas através da tecnologia de jatos d'água.
A tecnologia waterjet (WJ) está emergindo como uma nova abordagem que permite a entrega de alta throughput de células por cistoscópio sob controle visual no esfíncter uretral12,13. O WJ permite a entrega de células em diferentes pressões (E = efeitos na barra) que variam de E5 a E8013. Na primeira fase, a solução isotônica (fase de penetração tecidual) é aplicada com alta pressão (ou seja, E60 ou E80) a fim de afrouxar a matriz extracelular em torno do tecido direcionado e abrir pequenas micro-lacunas interligadas. Na segunda fase (fase de injeção), a pressão é reduzida dentro de milissegundos (ou seja, até E10) a fim de entregar suavemente as células no tecido alvo. Após esta aplicação em fase de duas etapas, as células não são submetidas a pressão adicional contra o tecido quando ejetadas, mas estão flutuando em um fluxo de baixa pressão em uma área cavernosa cheia de líquido13. Em uma configuração modelo ex vivo onde as células-tronco foram injetadas via WJ em tecido uretra cadavérico, as células viáveis poderiam ser posteriormente aspiradas e recuperadas do tecido e expandidas in vitro13. Embora um estudo de 2020 da Weber et al. tenha demonstrado a viabilidade e aplicabilidade do WJ para fornecer cardiomiócitos sem pegada no miocárdio14, é preciso ter em mente que a tecnologia WJ ainda está em fase de protótipo.
O protocolo a seguir descreve como preparar e rotular células estromais derivadas de tecido suíno (pADSC) e como entregá-las em tecido fluido de captura e cadavérico através da tecnologia WJ e agulhas de cistoscopia williams (WN). A injeção pós-celular, a vitalidade celular e a elasticidade via microscopia de força atômica (AFM) são avaliadas. Por meio de instruções passo a passo, o protocolo oferece uma abordagem clara e concisa para adquirir dados confiáveis. A seção de discussão apresenta e descreve as principais vantagens, limitações e perspectivas futuras da técnica. A entrega de células wj, bem como as análises de pós-tradução sequela relatadas aqui estão substituindo a injeção padrão da agulha e fornecem uma estrutura de entrega de células sólidas para cicatrização regenerativa do tecido alvo. Em nossos estudos recentes, fornecemos evidências de que o WJ forneceu células com mais precisão e pelo menos viabilidade comparável quando comparadas às injeções de agulha15,16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL BD Luer-LokTM Syringe</td>
			<td>BD Plastik Inc</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell sieve</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>542000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 tissue culture flask</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM head</td>
			<td>(CellHesion 200) JPK</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM processing software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM system Cell Hesion 200</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-In-One-Al cantilever</td>
			<td>Budget Sensors</td>
			<td>AIO-10</td>
			<td>tip A, Conatct Mode, Shape: Beam 
			Force Constant: 0.2 N/m (0.04 - 0.7 N/m) 
			Resonance Frequency: 15 kHz (10 - 20 kHz) 
			Length: 500 &#181;m (490 - 510 &#181;m) 
			Width: 30 &#181;m (35 - 45 &#181;m) 
			Thickness: 2.7 &#181;m (1.7 - 3.7 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2942</td>
			<td>250 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscope (AFM)</td>
			<td>CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microlance 3 18G</td>
			<td>BD</td>
			<td>304622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10008-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilever</td>
			<td>&#160;All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria</td>
			<td>AIO-TL-10</td>
			<td>tip A, k &#188; 0.2 N/m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-chip disposable hemocytometer</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>631-1098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge: Rotina 420R</td>
			<td>Hettich Zentrifugen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17100-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - low glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather disposable scalpel (No. 10)</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.30.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES sodium salt solution (1 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM)</td>
			<td>AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany</td>
			<td>L201306_03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laboratory bags</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium without l-glutamine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F1315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium without L-glutamine</td>
			<td>(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)</td>
			<td>F1315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE 17-605C1</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td>Calcein AM and EthD-1 are used from this kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope software: Zen 2.6</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope: AxioVertA.1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nelaton-Catheter female</td>
			<td>Bicakcilar</td>
			<td>19512051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10000 U/ml Penicillin 
			10000 &#181;g/ml Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater associated with AFM</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>T-05-0117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater associated with AFM</td>
			<td>JPK Instruments AG, Berlin, Germany</td>
			<td>T-05-0117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical Software: SPSS Statistics 22</td>
			<td>IBM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri dish - CellStar</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>TPP AG</td>
			<td>TPP93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland</td>
			<td>TPP93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4% 
			0.85% NaCl</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterjet: ERBEJET2 device</td>
			<td>Erbe Elektromedizin GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams Cystoscopic Injection Needle</td>
			<td>Cook Medical</td>
			<td>G14220</td>
			<td>23G, 5.0 Fr, 35 cm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injection of porcine adipose tissue-derived stroma cells via waterjet technology

A incontinência urinária (UI) é uma condição altamente prevalente caracterizada pela deficiência do músculo esfíncter uretral. Os ramos da medicina regenerativa, particularmente a terapia celular, são novas abordagens para melhorar e restaurar a função de esfíncter uretral. Embora a injeção de células funcionais ativas seja realizada rotineiramente em ambientes clínicos por agulha e seringa, essas abordagens têm desvantagens e limitações significativas. Neste contexto, a tecnologia de jato d'água livre de agulhas (WJ) é um método viável e inovador que pode injetar células viáveis por cistoscopia guiada visual no esfíncter uretrais. No presente estudo, utilizamos o WJ para fornecer células estromais derivadas do tecido adiposo porcina (pADSCs) em tecido uretral cadavérico e, posteriormente, investigamos o efeito da entrega de WJ no rendimento e viabilidade celular. Também avaliamos as características biomecânicas (ou seja, elasticidade) por medições de microscopia de força atômica (AFM). Mostramos que o WJ entregou pADSCs foram significativamente reduzidos em sua elasticidade celular. A viabilidade foi significativamente menor em relação aos controles, mas ainda está acima de 80%.

Após a entrega de células através das duas abordagens, a viabilidade das células entregues através da WN (97,2 ± 2%, n=10, p<0,002) foi maior quando comparada às injeções por WJ utilizando as configurações E60-10 (85,9 ± 0,16%, n=12) (Figura 2). Os resultados da avaliação biomecânica mostraram que: as injeções de WN de células em fluido de captura não apresentaram diferença significativa em relação ao moduli elástico (EM; 0,992 kPa) quando comparado com os controles (1...

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Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stroma Cells via Waterjet Technology

Apresentamos um método de injeção celular através da tecnologia de jato de água livre de agulhas, juntamente com uma sequência de investigações pós-entrega em termos de viabilidade celular, proliferação e medidas de elasticidade.

Injeção de células de stroma derivadas de tecido adiposo porcina através da tecnologia waterjet

Urinary incontinence (UI) is a highly prevalent condition characterized by the deficiency of the urethral sphincter muscle. Regenerative medicine ...

Injeções de jato d'água de componentes ativos, como líquidos, nanopartículas, micropartículas, drogas encapsuladas ou mesmo células vivas podem ser aplicadas muito mais precisas quando comparadas às injeções de agulha em diferentes tecidos visados. Abordagens minimamente invasivas requerem localização precisa da medicação em camadas predeterminadas do tecido alvo, pré-seleção de pressões de injeção. Nosso foco atual é a terapia celular para incontinência urinária.No entanto, essa técnica já foi estendida à regeneração do tecido muscular infectado após ataques cardíacos graves. Atualmente, a técnica só pode ser aplicada por pesquisadores experientes ou médicos licenciados em estudos pré-clínicos. Não se destina a ser utilizado em procedimentos laboratoriais de rotina, pois é desenvolvido para fins clínicos futuros.Para começar, coloque a uretra com a bexiga de conexão dissecada de um porco fêmea adulta em uma esponja que imita a elasticidade do assoalho pélvico inferior. Em seguida, usando a bexiga, determine a orientação da uretra. Isso é possível devido à localização do ureter e dos três ligamentos, que fixam a bexiga na cavidade abdominal e pélvica.Depois de orientar corretamente a uretra, corte-a longitudinalmente no lado dorsal com o auxílio de um cateter. Depois de ajustar a densidade celular das células estromais derivadas do tecido porcino para 2,4 vezes 10 para a sexta célula por mililitro, rotule as células com uma mancha celular viva permeável da membrana fluorescente verde, em seguida, aspire a suspensão celular com a seringa e aplique a agulha de injeção citoscópica Williams. Em seguida, segure a agulha logo acima dos dois mililitros da mídia de crescimento em um tubo de centrifugação de 15 mililitros ou insira a agulha no tecido uretra aberto.Em ambos os casos, injete manualmente 250 microliters da suspensão celular. Células injetadas na uretra cadavêmica de uma cúpula de injeção. Colete as células injetadas na mídia diretamente por centrifugação.Para células injetadas na uretra cadavírica, aspire-as para fora da cúpula de injeção com uma agulha de calibre 18 aplicada em uma seringa. Transfira as células aspiradas para um tubo de centrifugação e pelota-as por centrifugação. Resuspende as duas cápsulas de célula em quatro mililitros de mídia de crescimento.Para determinar o rendimento e a viabilidade celular, misture 20 da suspensão celular cuidadosamente com 20 microliters de azul tripano. Em seguida, encha 10 microliters desta mistura em cada câmara do hemótmetro. Sob um microscópio, conte as células nos quatro quadrados de canto.Conte as células brancas não manchadas como células viáveis e as células manchadas azuis como células mortas, então calcule o número celular por mililitro. Para injeções através do jato d'água, ajuste a densidade das células estromais derivadas do tecido porcino para seis vezes 10 a sexta células por mililitro. Rotule-os como demonstrado anteriormente e encha a suspensão da célula na unidade de dosagem do dispositivo jato de água sem agulhas.Em seguida, segure o bocal de injeção logo acima dos dois mililitros da mídia de crescimento em um tubo de centrifugação de 15 mililitros ou logo acima do tecido uretra aberto. Em ambos os casos, injete 100 microliters da suspensão celular. Use alta pressão para penetração tecidual seguida de uma fase de baixa pressão para injeções celulares.Células injetadas na uretra cadavêmica formam uma cúpula de injeção. Coletar células injetadas na mídia diretamente por centrifugação. Para células injetadas na uretra cadavírica, aspire-as para fora da cúpula de injeção.Transfira as células aspiradas para um tubo de centrifugação, e pelota-as usando centrifugação como demonstrado anteriormente. Após centrifugação, resuspend ambas as pelotas em quatro mililitros de mídia de crescimento. Sementes as células recuperadas após injeções em pratos de cultura tecidual a uma densidade de cinco vezes 10 para as quintas células por prato.Após uma incubação de três horas a 37 graus Celsius, e logo antes da medição da AFM, substitua a mídia de crescimento por três mililitros da mídia L-15 de Leibovitz sem L-glutamina. Para medir a elasticidade das células individuais, identifique visualmente uma célula e foque nela. Em seguida, coloque o mouse do computador no meio da célula e para melhorar a precisão das medidas, posicione a ponta AFM diretamente acima do núcleo celular.Em seguida, concentre-se no cantilever e mova-o no mouse do computador. Em seguida, inicie a medição com execução e meça pelo menos 50 células. O parâmetro de ponto de conjunto obtido pela calibração do cantilever é usado e uma célula é medida três vezes.A viabilidade das células entregues através da agulha Williams foi maior do que as injeções do jato de água usando as configurações E60-10. A avaliação biomecânica das injeções no fluido de captura revelou que as injeções de agulha williams não apresentaram diferença significativa no moduli elástico quando comparadas aos controles, enquanto as injeções do jato de água reduziram significativamente o moduli elástico celular em 40 a 50%Da mesma forma, em amostras de tecido uretra cadavérico, as injeções de agulha williams não produziram diferença significativa no moduli elástico celular em comparação com os controles. No entanto, observou-se uma redução significativa de 51%, após injeções de jato d'água.É preciso apenas ter certeza de que as injeções da agulha não penetram totalmente no tecido que está infligindo lesão. Com o jato d'água, é preciso colocar apenas o dispositivo na posição correta na área de injeção, enquanto o resto é feito automaticamente pelo próprio dispositivo. Como o dispositivo jato d'água foi desenvolvido para combinar e se encaixar em dispositivos endoscópicos, você pode usar as aplicações do jato de água para qualquer local do corpo que possa ser alcançado por essas tecnologias cistoscópicas ou endoscópicas para regenerar tecidos e fazer o trabalho de reparo.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplante de Progenitores Miogênicos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos em modelos de regeneração muscular

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Bioengenharia

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Cartilagem Human Tissue Fabricação Usando tridimensional Inkjet Tecnologia de Impressão

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

Um Supramolecular hidrogel injetável e carregado com a droga para a injeção local por cateter no coração de porco

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

Isolamento de Murino adiposo derivada de tecido microvascular Fragmentos como Vascularização Unidades para engenharia de tecidos

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

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Protocolo genérico para otimização da produção de proteína heteróloga usando tecnologia automatizada de Microbioreactor

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Microdissection de segmentos de tecido Renal primária e incorporação com tecnologia de construção romance livre de andaime

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

Isolamento e Decellularization de um pâncreas todo porcino

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Imagem latente de alta resolução da dinâmica nuclear em pilhas vivos a tensão elástica uniaxial

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

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Tecnologia celular encapsulada para a entrega de biológicos ao olho do rato

Many current therapeutics under development for diseases of the posterior pole of the eye are biologics. These drugs need to be administered frequently, ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

Bioink extracelular derivado da matriz de tecido sipâncreas para a impressão de construções de tecidopanpático 3D Carregadas de células

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...