Name: injection of porcine adipose tissue-derived stroma cells via waterjet technology
Uploaded: 2021-11-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stroma Cells via Waterjet Technology at JoVE.com

Мы благодарим наших соавторов из оригинальных публикаций за помощь и поддержку.

Образцы жировой ткани свиней были получены из Института экспериментальной хирургии при Университете Тюбингена. Все процедуры были одобрены местными органами по защите животных под номером эксперимента на животных CU1/16.
1. Выделение стромальных клеток, полученных из ?...

В настоящем исследовании мы продемонстрировали и представили пошаговый подход к процедуре доставки WJ-клеток и использовали продолжение количественных исследований для оценки влияния доставки WJ на клеточные характеристики: жизнеспособность клеток и биомеханические особенности (т.е....

Недержание мочи (UI) является широко распространенным расстройством с распространенностью 1,8 - 30,5% в европейских популяциях1 и характеризуется в первую очередь неисправностью уретрального сфинктера. С клинической точки зрения хирургическое лечение часто предлагается пациентам, когда консервативная терапия или физиотерапия не могут решить и облегчить возникающие симптомы.
Клеточная терапия потенциальной регенеративной репарации сфинктерного комплекса возникает как авангардный подход к лечению патологииUI 2,3. Его основными целями являются замена, восстановление и восстановление биологической функциональности поврежденной ткани. На животных моделях для пользовательского интерфейса трансплантация стволовых клеток показала многообещающие результаты в уродинамических исходах 2,4,5. Стволовые клетки возникают как оптимальные клеточные кандидаты, поскольку они обладают способностью подвергаться самообновлению и мультипотентной дифференцировке, таким образом, способствуя регенерации пораженной ткани6. Несмотря на предстоящий регенеративный потенциал, практическое использование клеточной терапии остается затрудненным, поскольку минимально инвазивная доставка клеток по-прежнему сталкивается с рядом проблем, касающихся точности инъекций и охвата мишени. Несмотря на то, что текущий подход, используемый для доставки клеток, представляет собой инъекцию через систему иглы-шприца7, он обычно приводит к общему дефициту жизнеспособных клеток, при этом заявленные жизнеспособности составляют всего 1%-31% после трансплантации8. Кроме того, было также показано, что доставка клеток с помощью инъекции иглы влияет на размещение, скорость удержания, а также на распределение трансплантированных клеток в целевой ткани 9,10,11. Осуществимым, новым подходом, который преодолевает вышеупомянутое ограничение, является доставка клеток без игл с помощью водоструйной технологии.
Технология Waterjet (WJ) становится новым подходом, который обеспечивает высокую пропускную способность доставки клеток цистоскопом под визуальным контролем в уретральном сфинктере12,13. WJ обеспечивает доставку ячеек при различных давлениях (E = эффекты в барах) в диапазоне от E5 до E8013. В первой фазе (фазе проникновения в ткани) изотонический раствор наносят с высоким давлением (т.е. Е60 или Е80) с целью ослабления внеклеточного матрикса, окружающего ткани-мишень, и открытия небольших соединительных микролакунов. Во второй фазе (фазе инъекции) давление понижается в течение миллисекунд (т.е. до Е10), чтобы мягко доставить клетки в ткани-мишени. После этого двухэтапного применения клетки не подвергаются дополнительному давлению на ткань при выбросе, а плавают в потоке низкого давления в заполненную жидкостью кавернозную область13. В условиях модели ex vivo, где стволовые клетки вводились через WJ в трупную ткань уретры, жизнеспособные клетки могли быть впоследствии аспирированы и извлечены из ткани и дополнительно расширены in vitro13. Хотя исследование 2020 года Weber et al. продемонстрировало осуществимость и применимость WJ для доставки кардиомиоцитов без следов в миокард14, следует иметь в виду, что технология WJ все еще находится на стадии прототипа.
Следующий протокол описывает, как подготовить и маркировать стромальные клетки, полученные из жировой ткани свиней (pADSC), и как доставить их в улавливающую жидкость и трупную ткань с помощью технологии WJ и игл цистоскопии Уильямса (WN). После клеточной инъекции оценивается клеточная жизнеспособность и эластичность с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ). Посредством пошаговых инструкций протокол дает четкий и лаконичный подход к получению достоверных данных. В дискуссионном разделе представлены и описаны основные преимущества, ограничения и будущие перспективы методики. Доставка WJ клеток, а также анализы sequela post translation, о которых сообщается здесь, заменяют стандартную инъекцию иглы и обеспечивают прочную основу для доставки клеток для регенеративного заживления ткани-мишени. В наших недавних исследованиях мы предоставили доказательства того, что WJ доставлял клетки более точно и, по крайней мере, с сопоставимой жизнеспособностью по сравнению с инъекциями иглы15,16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL BD Luer-LokTM Syringe</td>
			<td>BD Plastik Inc</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell sieve</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>542000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 tissue culture flask</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM head</td>
			<td>(CellHesion 200) JPK</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM processing software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM system Cell Hesion 200</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-In-One-Al cantilever</td>
			<td>Budget Sensors</td>
			<td>AIO-10</td>
			<td>tip A, Conatct Mode, Shape: Beam 
			Force Constant: 0.2 N/m (0.04 - 0.7 N/m) 
			Resonance Frequency: 15 kHz (10 - 20 kHz) 
			Length: 500 &#181;m (490 - 510 &#181;m) 
			Width: 30 &#181;m (35 - 45 &#181;m) 
			Thickness: 2.7 &#181;m (1.7 - 3.7 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2942</td>
			<td>250 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscope (AFM)</td>
			<td>CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microlance 3 18G</td>
			<td>BD</td>
			<td>304622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10008-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilever</td>
			<td>&#160;All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria</td>
			<td>AIO-TL-10</td>
			<td>tip A, k &#188; 0.2 N/m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-chip disposable hemocytometer</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>631-1098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge: Rotina 420R</td>
			<td>Hettich Zentrifugen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17100-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - low glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather disposable scalpel (No. 10)</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.30.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES sodium salt solution (1 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM)</td>
			<td>AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany</td>
			<td>L201306_03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laboratory bags</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium without l-glutamine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F1315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium without L-glutamine</td>
			<td>(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)</td>
			<td>F1315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE 17-605C1</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td>Calcein AM and EthD-1 are used from this kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope software: Zen 2.6</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope: AxioVertA.1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nelaton-Catheter female</td>
			<td>Bicakcilar</td>
			<td>19512051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10000 U/ml Penicillin 
			10000 &#181;g/ml Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater associated with AFM</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>T-05-0117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater associated with AFM</td>
			<td>JPK Instruments AG, Berlin, Germany</td>
			<td>T-05-0117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical Software: SPSS Statistics 22</td>
			<td>IBM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri dish - CellStar</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>TPP AG</td>
			<td>TPP93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland</td>
			<td>TPP93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4% 
			0.85% NaCl</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterjet: ERBEJET2 device</td>
			<td>Erbe Elektromedizin GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams Cystoscopic Injection Needle</td>
			<td>Cook Medical</td>
			<td>G14220</td>
			<td>23G, 5.0 Fr, 35 cm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injection of porcine adipose tissue-derived stroma cells via waterjet technology

Недержание мочи (UI) является широко распространенным состоянием, характеризующимся дефицитом мышцы уретрального сфинктера. Отрасли регенеративной медицины, особенно клеточная терапия, являются новыми подходами к улучшению и восстановлению функции уретрального сфинктера. Несмотря на то, что инъекция активных функциональных клеток обычно выполняется в клинических условиях с помощью иглы и шприца, эти подходы имеют значительные недостатки и ограничения. В этом контексте технология безигольчатой гидроабразивной струи (WJ) является осуществимым и инновационным методом, который может вводить жизнеспособные клетки с помощью визуальной цистоскопии в уретральный сфинктер. В настоящем исследовании мы использовали WJ для доставки стромальных клеток (pADSC), полученных из жировой ткани свиней, в трупную уретральную ткань и впоследствии исследовали влияние доставки WJ на выход и жизнеспособность клеток. Мы также оценили биомеханические характеристики (т.е. эластичность) с помощью измерений атомно-силовой микроскопии (AFM). Мы показали, что pADSC, доставленные WJ, были значительно снижены в их клеточной эластичности. Жизнеспособность была значительно ниже по сравнению с контрольной группой, но все еще выше 80%.

После доставки клеток с помощью двух подходов жизнеспособность клеток, доставленных через WN (97,2 ± 2%, n = 10, p<0,002), была выше по сравнению с инъекциями WJ с использованием настроек E60-10 (85,9 ± 0,16%, n = 12) (рисунок 2). Результаты биомеханической оценки показали, что: инъекции ВН клетка...

Watch this Scientific Journal Video about Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stroma Cells via Waterjet Technology at JoVE.com

Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stroma Cells via Waterjet Technology

Мы представляем метод инъекции клеток с помощью безигольчатой водоструйной технологии в сочетании с продолжением послеродовых исследований с точки зрения измерения клеточной жизнеспособности, пролиферации и эластичности.

Инъекция клеток стромы, полученных из жировой ткани свиней, с помощью технологии Waterjet

Urinary incontinence (UI) is a highly prevalent condition characterized by the deficiency of the urethral sphincter muscle. Regenerative medicine ...

Водоструйные инъекции активных компонентов, таких как жидкости, наночастицы, микрочастицы, инкапсулированные лекарства или даже живые клетки, могут применяться гораздо точнее по сравнению с инъекциями игл в различные ткани. Минимально инвазивные подходы требуют точной локализации препарата в заранее определенных слоях целевой ткани путем предварительного выбора давления инъекций. В настоящее время мы фокусируемся на клеточной терапии недержания мочи.Однако эта методика уже была распространена на регенерацию инфицированной мышечной ткани после тяжелых инфарктов. В настоящее время методика может применяться только опытными исследователями или лицензированными врачами в доклинических исследованиях. Он не предназначен для использования в обычных лабораторных процедурах, поскольку он разработан для будущих клинических целей.Для начала поместите уретру со соединительным мочевым пузырем, рассеченным от взрослой самки ландрасовой свиньи, на губку, которая имитирует эластичность нижнего тазового дна. Затем с помощью мочевого пузыря определяют ориентацию мочеиспускательного канала. Это возможно благодаря локализации мочеточника и трех связок, которые фиксируют мочевой пузырь в брюшной и тазовой полости.После правильной ориентации уретры разрезайте ее продольно на спинной стороне с помощью катетера. После корректировки плотности клеток стромальных клеток, полученных из жировой ткани свиней, до 2,4 раз 10 до шестых клеток на миллилитр, маркируют клетки зеленым флуоресцентным мембранным проницаемым живым клеточным пятном, затем аспирируют клеточную суспензию шприцем и применяют цитоскопическую инъекционную иглу Уильямса. Затем либо удерживайте иглу над двумя миллилитрами питательной среды в 15-миллилитровой центрифугирующей трубке, либо вставьте иглу в открытую ткань уретры.В обоих случаях вручную вводят 250 микролитров клеточной суспензии. Клетки, вводимые в трупную уретру из инъекционного купола. Соберите клетки, введенные в среду непосредственно путем центрифугирования.Для клеток, введенных в трупную уретру, аспирируйте их из купола инъекции с помощью иглы 18 калибра, нанесенной на шприц. Перенесите аспирированные ячейки в центрифугированную трубку и гранулируйте их центрифугированием. Повторно суспендировать обе клеточные гранулы в четырех миллилитрах питательной среды.Чтобы определить выход и жизнеспособность клеток, тщательно смешайте 20 клеточных суспензий с 20 микролитрами трипан-синего цвета. Затем заполните по 10 микролитров этой смеси в каждой камере гемоцитометра. Под микроскопом подсчитайте клетки во всех четырех угловых квадратах.Подсчитайте незапятнанные белые клетки как жизнеспособные клетки, а синие окрашенные клетки как мертвые клетки, а затем рассчитайте количество клеток на миллилитр. Для инъекций с помощью струи воды отрегулируйте плотность стромальных клеток, полученных из жировой ткани свиней, в шесть раз от 10 до шестой клетки на миллилитр. Маркировка их, как было показано ранее, и заполнение клеточной суспензии в дозирующий блок безигольчатого гидроабразивного устройства.Затем либо удерживайте инъекционную сопло вскоре над двумя миллилитрами питательной среды в 15-миллилитровой центрифугирующей трубке или вскоре над открытой тканью уретры. В обоих случаях вводят 100 микролитров клеточной суспензии. Используйте высокое давление для проникновения в ткани, а затем фазу низкого давления для инъекций клеток.Клетки, вводимые в трупную уретру, образуют инъекционный купол. Собирайте клетки, вводимые в среду непосредственно путем центрифугирования. Для клеток, вводимых в трупную уретру, аспирируйте их из инъекционного купола.Перенесите аспирированные ячейки в центрифугированную трубку и гранулируйте их с помощью центрифугирования, как показано ранее. После центрифугирования повторно суспендируют обе гранулы в четырех миллилитрах питательной среды. Семена клеток, извлекаемых после инъекций в тканевую культуру посуды с плотностью от пяти раз 10 до пятой клетки на чашку.После трехчасовой инкубации при 37 градусах Цельсия и непосредственно перед измерением AFM замените питательную среду тремя миллилитрами среды L-15 Лейбовица без L-глутамина. Чтобы измерить эластичность отдельных клеток, визуально идентифицируйте одну клетку и ориентируйтесь на нее. Затем поместите компьютерную мышь в середину клетки и, чтобы повысить точность измерений, расположите наконечник AFM непосредственно над ядром клетки.Далее сосредоточьтесь на консольном устройстве и переместите его на компьютерную мышь. Затем начните измерение с пробега и отмерьте не менее 50 ячеек. Используется параметр заданного значения, полученный при калибровке консольного аппарата и трижды измеряется одна ячейка.Жизнеспособность клеток, доставленных через иглу Уильямса, была выше, чем инъекции водометом с использованием настроек E60-10. Биомеханическая оценка инъекций в улавливающей жидкости показала, что инъекции иглы Уильямса не показали существенной разницы в модулях упругости по сравнению с контрольной группой, в то время как инъекции струи воды значительно уменьшали клеточные модули упругости на 40-50% Аналогичным образом, в образцах трупной ткани уретры инъекции иглы Уильямса не дали существенной разницы в клеточных модулях упругости по сравнению с контрольной группой. Однако значительное снижение на 51% наблюдалось после водоструйных инъекций.Нужно только убедиться, что инъекции иглы не полностью проникают в ткань, которая наносит травму. С водометом нужно только поместить устройство в правильное положение в области впрыска, в то время как остальное автоматически делается самим устройством. Поскольку водоструйное устройство было разработано для соответствия и установки в эндоскопические устройства, вы можете использовать водоструйные приложения для любого участка в организме, который может быть достигнут с помощью этих цистоскопических или эндоскопических технологий для регенерации тканей и выполнения восстановительных работ.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Трансплантация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных Мезоангиобласт-как миогенные прогениторы в мышиных моделях мышечной регенерации

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Человека хрящевой ткани Изготовление с использованием трехмерных струйных технологии печати

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

Инъекций и медикаментов загружены Супрамолекулярная Гидрогель для местного катетера для инъекций в сердце свиньи

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

Выделение мышиных полученных из жировой ткани микрососудистых Фрагментов как васкуляризация единицы для тканевой инженерии

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Общий протокол для оптимизации производства гетерологичных белка с использованием автоматизированной технологии Microbioreactor

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

Microdissection первичной почечной ткани сегментов и интеграция с технологией Роман эшафот свободной конструкции

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

Изоляция и Decellularization целом свинину поджелудочной железы

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Сканирование с высоким разрешением ядерной динамики в живых клетках под напряжением Uniаксиального натяжения

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

Encapsulated Cell Technology for the Delivery of Biologics to the Mouse Eye

Инкапсулированные технологии клеток для доставки биологических препаратов для мышиного глаза

Many current therapeutics under development for diseases of the posterior pole of the eye are biologics. These drugs need to be administered frequently, ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

Поджелудочная ткань-производные внеклеточной матрицы Bioink для печати 3D-клетки-Ладена поджелудочной железы Конструкции Конструкции

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...