Name: injection of porcine adipose tissue-derived stroma cells via waterjet technology
Uploaded: 2021-11-23T15:00:00
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Agradecemos a nuestros coautores de las publicaciones originales por su ayuda y apoyo.

Las muestras de tejido adiposo porcino se obtuvieron del Instituto de Cirugía Experimental de la Universidad de Tuebingen. Todos los procedimientos fueron aprobados por las autoridades locales de bienestar animal bajo el número de experimento animal CU1/16.
1. Aislamiento de células estromales derivadas del tejido adiposo porcino
<ol><li>Use tejido adiposo porcino entregado desde el Instituto de Cirugía Experimental en un tubo centrífugo de 50 ml al laboratorio.</li>
	<...

En el presente estudio, demostramos y presentamos un enfoque paso a paso para el procedimiento de entrega de células WJ y empleamos una secuela de investigaciones cuantitativas para evaluar el efecto de la entrega de WJ en las características celulares: viabilidad celular y características biomecánicas (es decir, EM). Después de la inyección de WJ, el 85,9% de las células cosechadas eran viables. En términos de inyección de WN, el 97,2% de las células conservaron su viabilidad después de la inyección. Por lo ...

La incontinencia urinaria (IU) es un trastorno generalizado con una prevalencia del 1,8 al 30,5% en las poblaciones europeas1 y se caracteriza principalmente por el mal funcionamiento del esfínter uretral. Desde una perspectiva clínica, el tratamiento quirúrgico a menudo se ofrece a los pacientes cuando las terapias conservadoras o la fisioterapia no abordan y alivian los síntomas emergentes.
La terapia celular para la potencial reparación regenerativa del mal funcionamiento del complejo del esfínter ha ido emergiendo como un enfoque vanguardista para el tratamiento de la patología de la IU 2,3. Sus principales objetivos son reemplazar, reparar y restaurar la funcionalidad biológica del tejido dañado. En modelos animales para IU, el trasplante de células madre ha mostrado resultados prometedores en resultados urodinámicos 2,4,5. Las células madre surgen como candidatas celulares óptimas, ya que tienen la capacidad de someterse a la autorrenovación y la diferenciación multipotente, lo que ayuda a la regeneración del tejido afectado6. A pesar del potencial regenerativo que se avecina, el uso práctico de la terapia celular sigue siendo obstaculizado, ya que la administración mínimamente invasiva de células aún enfrenta varios desafíos relacionados con la precisión de la inyección y la cobertura del objetivo. A pesar de que el enfoque actual utilizado para la administración de células es la inyección a través de un sistema de aguja-jeringa7, generalmente resulta en un déficit general de células viables, con viabilidades reportadas tan bajas como 1% - 31% después del trasplante8. Además, también se ha demostrado que la administración de células a través de la inyección con aguja afecta la colocación, la tasa de retención y la distribución de las células trasplantadas en el tejido objetivo 9,10,11. Un enfoque factible y novedoso que supera la limitación mencionada anteriormente es la entrega de células sin agujas a través de la tecnología de chorro de agua.
La tecnología de chorro de agua (WJ) está emergiendo como un nuevo enfoque que permite la entrega de células de alto rendimiento por cistoscopio bajo control visual en el esfínter uretral12,13. El WJ permite la entrega de células a diferentes presiones (E = efectos en bar) que van desde E5 hasta E8013. En la primera fase, (fase de penetración tisular) se aplica solución isotónica con alta presión (es decir, E60 o E80) para aflojar la matriz extracelular que rodea el tejido objetivo y abrir pequeñas microlacuras de interconexión. En la segunda fase (la fase de inyección), la presión se reduce en milisegundos (es decir, hasta E10) para entregar suavemente las células al tejido objetivo. Después de esta aplicación de dos fases escalonadas, las células no se someten a presión adicional contra el tejido cuando se expulsan, sino que flotan en una corriente de baja presión en un área cavernosa llena de líquido13. En un entorno de modelo ex vivo donde las células madre se inyectaron a través de WJ en el tejido de la uretra cadavérica, las células viables podrían aspirarse y recuperarse posteriormente del tejido y expandirse aún más in vitro13. Aunque un estudio de 2020 realizado por Weber et al. demostró la viabilidad y aplicabilidad de WJ para entregar cardiomiocitos sin huella en el miocardio14, debe tenerse en cuenta que la tecnología WJ aún se encuentra en una etapa de prototipo.
El siguiente protocolo describe cómo preparar y etiquetar las células estromales derivadas del tejido adiposo porcino (pADSC) y cómo administrarlas en el líquido de captura y el tejido cadavérico a través de la tecnología WJ y las agujas de cistoscopia Williams (WN). Después de la inyección celular, se evalúa la vitalidad y elasticidad celular a través de la microscopía de fuerza atómica (AFM). A través de instrucciones paso a paso, el protocolo ofrece un enfoque claro y conciso para adquirir datos confiables. La sección de discusión presenta y describe las principales ventajas, limitaciones y perspectivas futuras de la técnica. La entrega de células WJ, así como los análisis posteriores a la traducción de secuelas informados aquí están reemplazando la inyección de aguja estándar y proporcionan un marco de administración de células sólidas para la curación regenerativa del tejido objetivo. En nuestros estudios recientes proporcionamos evidencia de que WJ administró células con mayor precisión y al menos en viabilidad comparable en comparación con las inyecciones con aguja15,16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL BD Luer-LokTM Syringe</td>
			<td>BD Plastik Inc</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell sieve</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>542000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 tissue culture flask</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM head</td>
			<td>(CellHesion 200) JPK</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM processing software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM system Cell Hesion 200</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-In-One-Al cantilever</td>
			<td>Budget Sensors</td>
			<td>AIO-10</td>
			<td>tip A, Conatct Mode, Shape: Beam 
			Force Constant: 0.2 N/m (0.04 - 0.7 N/m) 
			Resonance Frequency: 15 kHz (10 - 20 kHz) 
			Length: 500 &#181;m (490 - 510 &#181;m) 
			Width: 30 &#181;m (35 - 45 &#181;m) 
			Thickness: 2.7 &#181;m (1.7 - 3.7 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2942</td>
			<td>250 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscope (AFM)</td>
			<td>CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microlance 3 18G</td>
			<td>BD</td>
			<td>304622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10008-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilever</td>
			<td>&#160;All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria</td>
			<td>AIO-TL-10</td>
			<td>tip A, k &#188; 0.2 N/m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-chip disposable hemocytometer</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>631-1098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge: Rotina 420R</td>
			<td>Hettich Zentrifugen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17100-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - low glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather disposable scalpel (No. 10)</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.30.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES sodium salt solution (1 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM)</td>
			<td>AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany</td>
			<td>L201306_03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laboratory bags</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium without l-glutamine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F1315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium without L-glutamine</td>
			<td>(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)</td>
			<td>F1315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE 17-605C1</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td>Calcein AM and EthD-1 are used from this kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope software: Zen 2.6</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope: AxioVertA.1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nelaton-Catheter female</td>
			<td>Bicakcilar</td>
			<td>19512051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10000 U/ml Penicillin 
			10000 &#181;g/ml Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater associated with AFM</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>T-05-0117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater associated with AFM</td>
			<td>JPK Instruments AG, Berlin, Germany</td>
			<td>T-05-0117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical Software: SPSS Statistics 22</td>
			<td>IBM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri dish - CellStar</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>TPP AG</td>
			<td>TPP93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland</td>
			<td>TPP93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4% 
			0.85% NaCl</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterjet: ERBEJET2 device</td>
			<td>Erbe Elektromedizin GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams Cystoscopic Injection Needle</td>
			<td>Cook Medical</td>
			<td>G14220</td>
			<td>23G, 5.0 Fr, 35 cm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injection of porcine adipose tissue-derived stroma cells via waterjet technology

La incontinencia urinaria (IU) es una afección altamente prevalente caracterizada por la deficiencia del músculo del esfínter uretral. Las ramas de la medicina regenerativa, particularmente la terapia celular, son enfoques novedosos para mejorar y restaurar la función del esfínter uretral. A pesar de que la inyección de células funcionales activas se realiza rutinariamente en entornos clínicos con aguja y jeringa, estos enfoques tienen desventajas y limitaciones significativas. En este contexto, la tecnología de chorro de agua sin aguja (WJ) es un método factible e innovador que puede inyectar células viables mediante cistoscopia guiada visualmente en el esfínter uretral. En el presente estudio, utilizamos WJ para administrar células estromales derivadas del tejido adiposo porcino (pADSC) en el tejido uretral cadavérico y posteriormente investigamos el efecto de la entrega de WJ sobre el rendimiento y la viabilidad celular. También evaluamos las características biomecánicas (es decir, la elasticidad) mediante mediciones de microscopía de fuerza atómica (AFM). Demostramos que las pADSC administradas por WJ se redujeron significativamente en su elasticidad celular. La viabilidad fue significativamente menor en comparación con los controles, pero todavía está por encima del 80%.

Después de la administración celular a través de los dos enfoques, la viabilidad de las células administradas a través del WN (97,2 ± 2%, n = 10, p<0,002) fue mayor en comparación con las inyecciones de WJ utilizando la configuración E60-10 (85,9 ± 0,16%, n = 12) (Figura 2). Los resultados de la evaluación biomecánica mostraron que: las inyecciones de WN de células en el fluido de captura no mostraron diferencias significativas con respecto a los módulos elásticos (EM; 0,992 kP...

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Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stroma Cells via Waterjet Technology

Presentamos un método de inyección celular a través de la tecnología de chorro de agua sin aguja junto con una secuela de investigaciones posteriores a la entrega en términos de mediciones de viabilidad celular, proliferación y elasticidad.

Inyección de células del estroma derivadas del tejido adiposo porcino a través de la tecnología de chorro de agua

Urinary incontinence (UI) is a highly prevalent condition characterized by the deficiency of the urethral sphincter muscle. Regenerative medicine ...

Las inyecciones por chorro de agua de componentes activos, como líquidos, nanopartículas, micropartículas, medicamentos encapsulados o incluso células vivas, se pueden aplicar con mucha más precisión en comparación con las inyecciones con agujas en diferentes tejidos dirigidos. Los enfoques mínimamente invasivos requieren una localización precisa del medicamento en capas predeterminadas del tejido objetivo mediante la preselección de presiones de inyección. Nuestro enfoque actual es la terapia celular para la incontinencia urinaria.Sin embargo, esta técnica ya se ha extendido a la regeneración del tejido muscular infectado después de ataques cardíacos severos. En la actualidad, la técnica solo puede ser aplicada por investigadores experimentados o médicos con licencia en estudios preclínicos. No está destinado a ser utilizado en procedimientos de laboratorio de rutina, ya que se desarrolla para futuros fines clínicos.Para comenzar, coloque la uretra con la vejiga de conexión diseccionada de un cerdo autóctono hembra adulto en una esponja que imita la elasticidad del suelo pélvico inferior. Luego, usando la vejiga, determine la orientación de la uretra. Esto es posible debido a la localización del uréter y los tres ligamentos, que fijan la vejiga en la cavidad abdominal y pélvica.Después de orientar correctamente la uretra, córtela longitudinalmente en el lado dorsal con la ayuda de un catéter. Después de ajustar la densidad celular de las células del estroma derivadas del tejido adiposo porcino a 2,4 veces 10 a la sexta célula por mililitro, etiquete las células con una tinción de células vivas permeables de membrana fluorescente verde, luego aspire la suspensión celular con la jeringa y aplique la aguja de inyección citoscópica Williams. A continuación, sostenga la aguja poco por encima de los dos mililitros de medios de crecimiento en un tubo de centrifugación de 15 mililitros o inserte la aguja en el tejido abierto de la uretra.En ambos casos, inyectar manualmente 250 microlitros de la suspensión celular. Células inyectadas en la uretra cadavérica desde una cúpula de inyección. Recoger las células inyectadas en el medio directamente por centrifugación.Para las células inyectadas en la uretra cadavérica, aspire fuera de la cúpula de inyección con una aguja de calibre 18 aplicada en una jeringa. Transfiera las células aspiradas a un tubo de centrifugación y gránulos por centrifugación. Resuspend ambos gránulos celulares en cuatro mililitros de medios de crecimiento.Para determinar el rendimiento celular y la viabilidad, mezcle 20 de la suspensión celular a fondo con 20 microlitros de azul de tripano. Luego llene 10 microlitros de esta mezcla en cada cámara del hemocitómetro. Bajo un microscopio, cuente las células en los cuatro cuadrados de las esquinas.Cuente los glóbulos blancos no teñidos como células viables y las células teñidas de azul como células muertas, luego calcule el número de células por mililitro. Para las inyecciones a través del chorro de agua, ajuste la densidad de las células estromales derivadas del tejido adiposo porcino a seis veces 10 a seis células por mililitro. Etiquételos como se demostró anteriormente y llene la suspensión celular en la unidad de dosificación del dispositivo de chorro de agua sin aguja.Luego sostenga la boquilla de inyección poco por encima de los dos mililitros de medios de crecimiento en un tubo de centrifugación de 15 mililitros o poco por encima del tejido de la uretra abierto. En ambos casos, inyectar 100 microlitros de la suspensión celular. Use alta presión para la penetración del tejido seguida de una fase de baja presión para las inyecciones celulares.Las células inyectadas en la uretra cadavérica forman una cúpula de inyección. Recoger las células inyectadas en el medio directamente por centrifugación. Para las células inyectadas en la uretra cadavérica, aspire fuera de la cúpula de inyección.Transfiera las células aspiradas a un tubo de centrifugación y ginelas mediante centrifugación, como se demostró anteriormente. Después de la centrifugación, resuspender ambos gránulos en cuatro mililitros de medios de crecimiento. Sembrar las células recuperadas después de las inyecciones en platos de cultivo de tejidos a una densidad de cinco veces 10 a la quinta célula por plato.Después de una incubación de tres horas a 37 grados centígrados, y justo antes de la medición de AFM, reemplace el medio de crecimiento con tres mililitros de medios L-15 de Leibovitz sin L-glutamina. Para medir la elasticidad de las células individuales, identifique visualmente una célula y concéntrese en ella. Luego coloque el mouse de la computadora en el centro de la celda y, para mejorar la precisión de las mediciones, coloque la punta AFM directamente sobre el núcleo celular.A continuación, concéntrese en el voladizo y muévalo en el mouse de la computadora. Luego comience la medición con run y mida al menos 50 celdas. Se utiliza el parámetro de punto de ajuste obtenido por calibración del voladizo y se mide una celda tres veces.La viabilidad de las células administradas a través de la aguja Williams fue mayor que las inyecciones por chorro de agua utilizando la configuración E60-10. La evaluación biomecánica de las inyecciones en el líquido de captura reveló que las inyecciones con aguja de Williams no mostraron diferencias significativas en los módulos elásticos en comparación con los controles, mientras que las inyecciones de chorro de agua redujeron significativamente los módulos elásticos celulares en un 40 a 50% Del mismo modo, en muestras de tejido uretral cadavérico, las inyecciones con aguja de Williams no produjeron diferencias significativas en los módulos elásticos celulares en comparación con los controles. Sin embargo, se observó una reducción significativa del 51% después de las inyecciones de chorro de agua.Uno solo tiene que asegurarse de que las inyecciones de aguja no penetren completamente en el tejido que está infligiendo la lesión. Con el chorro de agua, solo hay que colocar el dispositivo en la posición correcta en el área de inyección, mientras que el resto lo hace automáticamente el propio dispositivo. Como el dispositivo de chorro de agua se desarrolló para que coincida y se ajuste a los dispositivos endoscópicos, puede usar las aplicaciones de chorro de agua para cualquier sitio del cuerpo al que se pueda llegar mediante estas tecnologías cistoscópicas o endoscópicas para regenerar los tejidos y hacer el trabajo de reparación.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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