Name: injection of porcine adipose tissue-derived stroma cells via waterjet technology
Uploaded: 2021-11-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stroma Cells via Waterjet Technology at JoVE.com

Vi tackar våra medförfattare från de ursprungliga publikationerna för deras hjälp och stöd.

Fettvävnadsproverna från svin erhölls från Institutet för experimentell kirurgi vid universitetet i Tuebingen. Alla försök godkändes av lokala djurskyddsmyndigheter under djurförsöksnummer CU1/16.
1. Isolering av svin fettvävnadshärledda stromaceller
<ol><li>Använd svin fettvävnad som levereras från Institute for Experimental Surgery i ett 50 ml centrifugrör till laboratoriet.</li>
	<li>Överför vävnaden till en steril petriskål under den sterila bänken o...

I den aktuella studien demonstrerade och presenterade vi ett steg-för-steg-tillvägagångssätt för WJ-cellleveransförfarande och använde en följd av kvantitativa undersökningar för att bedöma effekten av WJ-leverans på cellulära egenskaper: cellulär livskraft och biomekaniska egenskaper (dvs. EM). Efter WJ-injektion var 85,9% av de skördade cellerna livskraftiga. När det gäller WN-injektion behöll 97,2% av cellerna sin livskraft efter injektion. Således uppfyller WJ-metoden ett absolut krav för en klini...

Urininkontinens (UI) är en utbredd sjukdom med en prevalens på 1,8 - 30,5% i europeiska populationer1 och kännetecknas främst av funktionsfel i urinrörets sfinkter. Ur ett kliniskt perspektiv erbjuds kirurgisk behandling ofta till patienter när konservativa terapier eller fysioterapi misslyckas med att ta itu med och lindra de framväxande symtomen.
Cellterapi för potentiell regenerativ reparation av sfinkterkomplexets funktionsfel har uppstått som ett avantgarde-tillvägagångssätt för behandling av UI-patologi 2,3. Dess huvudmål är att ersätta, reparera och återställa den skadade vävnadens biologiska funktionalitet. I djurmodeller för UI har stamcellstransplantation visat lovande resultat i urodynamiska resultat 2,4,5. Stamceller uppstår som optimala cellulära kandidater eftersom de har förmågan att genomgå självförnyelse och multipotent differentiering, vilket hjälper den drabbade vävnadsregenereringen6. Trots den kommande regenerativa potentialen förblir den praktiska användningen av cellterapi hindrad eftersom minimalt invasiv leverans av celler fortfarande står inför flera utmaningar när det gäller injektionsprecision och täckning av målet. Även om det nuvarande tillvägagångssättet som används för cellleverans är injektion genom ett nålsprutasystem7, resulterar det vanligtvis i ett totalt underskott av livskraftiga celler, med rapporterade livskrafter så låga som 1% - 31% efter transplantation8. Dessutom har cellleverans via nålinjektion också visat sig påverka placeringen, retentionshastigheten samt fördelningen av transplanterade celler i den riktade vävnaden 9,10,11. Ett genomförbart, nytt tillvägagångssätt som övervinner ovannämnda begränsning är den nålfria cellleveransen via vattenstråleteknik.
Vattenstråleteknik (WJ) växer fram som ett nytt tillvägagångssätt som möjliggör hög genomströmningsleverans av celler genom cystoskop under visuell kontroll i urinrörets sfinkter 12,13. WJ möjliggör cellleverans vid olika tryck (E = effekter i bar) som sträcker sig från E5 till E8013. I den första fasen appliceras (vävnadspenetrationsfasen) isotonisk lösning med högt tryck (dvs. E60 eller E80) för att lossa den extracellulära matrisen som omger den vävnad som är riktad och öppna små sammankopplade mikro-lacunae. I den andra fasen (injektionsfasen) sänks trycket inom millisekunder (dvs upp till E10) för att försiktigt leverera cellerna till den riktade vävnaden. Efter denna tvåstegsapplikation utsätts cellerna inte för ytterligare tryck mot vävnaden när de matas ut utan flyter i en lågtrycksström till ett vätskefyllt kavernöst område13. I en ex vivo-modellinställning där stamceller injicerades via WJ i kadaverisk urinrörsvävnad kunde livskraftiga celler därefter aspireras och hämtas från vävnaden och expanderas ytterligare in vitro13. Även om en studie från 2020 av Weber et al. visade genomförbarheten och tillämpligheten av WJ för att leverera fotavtrycksfria kardiomyocyter i myokardiet14, måste man komma ihåg att WJ-tekniken fortfarande är i ett prototypstadium.
Följande protokoll beskriver hur man förbereder och märker svin fettvävnadshärledda stromaceller (pADSC) och hur man levererar dem till infångningsvätska och kadavervävnad via WJ-teknik och Williams cystoskopinålar (WN). Efter cellulär injektion bedöms den cellulära vitaliteten och elasticiteten via atomkraftsmikroskopi (AFM). Via steg-för-steg-instruktioner ger protokollet ett tydligt och kortfattat tillvägagångssätt för att skaffa tillförlitliga data. Diskussionsdelen presenterar och beskriver teknikens stora fördelar, begränsningar och framtidsperspektiv. WJ-leveransen av celler samt följderna efter översättningsanalyserna som rapporteras här ersätter standardnålinjektionen och ger en solid cellleveransram för regenerativ läkning av målvävnaden. I våra senaste studier gav vi bevis för att WJ levererade celler mer exakt och åtminstone vid jämförbar livskraft jämfört mednålinjektioner 15,16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL BD Luer-LokTM Syringe</td>
			<td>BD Plastik Inc</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell sieve</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>542000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 tissue culture flask</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM head</td>
			<td>(CellHesion 200) JPK</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM processing software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM system Cell Hesion 200</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-In-One-Al cantilever</td>
			<td>Budget Sensors</td>
			<td>AIO-10</td>
			<td>tip A, Conatct Mode, Shape: Beam 
			Force Constant: 0.2 N/m (0.04 - 0.7 N/m) 
			Resonance Frequency: 15 kHz (10 - 20 kHz) 
			Length: 500 &#181;m (490 - 510 &#181;m) 
			Width: 30 &#181;m (35 - 45 &#181;m) 
			Thickness: 2.7 &#181;m (1.7 - 3.7 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2942</td>
			<td>250 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscope (AFM)</td>
			<td>CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany</td>
			<td>JPK00518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microlance 3 18G</td>
			<td>BD</td>
			<td>304622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10008-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilever</td>
			<td>&#160;All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria</td>
			<td>AIO-TL-10</td>
			<td>tip A, k &#188; 0.2 N/m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-chip disposable hemocytometer</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>631-1098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge: Rotina 420R</td>
			<td>Hettich Zentrifugen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17100-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - low glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather disposable scalpel (No. 10)</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.30.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES sodium salt solution (1 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM)</td>
			<td>AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany</td>
			<td>L201306_03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laboratory bags</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium without l-glutamine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F1315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 medium without L-glutamine</td>
			<td>(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)</td>
			<td>F1315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE 17-605C1</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td>Calcein AM and EthD-1 are used from this kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope software: Zen 2.6</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope: AxioVertA.1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nelaton-Catheter female</td>
			<td>Bicakcilar</td>
			<td>19512051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10000 U/ml Penicillin 
			10000 &#181;g/ml Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater associated with AFM</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>T-05-0117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater associated with AFM</td>
			<td>JPK Instruments AG, Berlin, Germany</td>
			<td>T-05-0117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical Software: SPSS Statistics 22</td>
			<td>IBM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri dish - CellStar</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>TPP AG</td>
			<td>TPP93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland</td>
			<td>TPP93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4% 
			0.85% NaCl</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterjet: ERBEJET2 device</td>
			<td>Erbe Elektromedizin GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams Cystoscopic Injection Needle</td>
			<td>Cook Medical</td>
			<td>G14220</td>
			<td>23G, 5.0 Fr, 35 cm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injection of porcine adipose tissue-derived stroma cells via waterjet technology

Urininkontinens (UI) är ett mycket utbrett tillstånd som kännetecknas av brist på urinrörets sfinktermuskel. Regenerativ medicin grenar, särskilt cellterapi, är nya metoder för att förbättra och återställa urinrörets sfinkterfunktion. Även om injektion av aktiva funktionella celler rutinmässigt utförs i kliniska miljöer med nål och spruta, har dessa metoder betydande nackdelar och begränsningar. I detta sammanhang är nålfri vattenstråleteknik (WJ) en genomförbar och innovativ metod som kan injicera livskraftiga celler genom visuell guidad cystoskopi i urinrörets sfinkter. I den aktuella studien använde vi WJ för att leverera svin fettvävnadshärledda stromaceller (pADSC) i kadaverisk urinrörsvävnad och undersökte därefter effekten av WJ-leverans på cellutbyte och livskraft. Vi bedömde också de biomekaniska egenskaperna (dvs. elasticitet) genom atomkraftmikroskopi (AFM) mätningar. Vi visade att WJ-levererade pADSC reducerades signifikant i sin cellulära elasticitet. Lönsamheten var signifikant lägre jämfört med kontroller men är fortfarande över 80%.

Efter cellleverans via de två metoderna var livskraften hos celler som levererades genom WN (97,2 ± 2%, n = 10, p<0,002) högre jämfört med injektioner av WJ med E60-10-inställningarna (85,9 ± 0,16%, n = 12) (Figur 2). Biomekaniska bedömningsresultat visade att: WN-injektioner av celler i infångningsvätska inte visade någon signifikant skillnad med avseende på den elastiska modulen (EM; 0,992 kPa) jämfört med kontrollerna (1,176 kPa; Figur 3A), meda...

Watch this Scientific Journal Video about Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stroma Cells via Waterjet Technology at JoVE.com

Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stroma Cells via Waterjet Technology

Vi presenterar en metod för cellinjektion via nålfri vattenskärningsteknik i kombination med en följd av undersökningar efter leverans när det gäller cellulär livskraft, proliferation och elasticitetsmätningar.

Injektion av svin fettvävnads-härledda stromaceller via vattenskärningsteknik

Urinary incontinence (UI) is a highly prevalent condition characterized by the deficiency of the urethral sphincter muscle. Regenerative medicine ...

Vattenskärningsinjektioner av aktiva komponenter, såsom vätskor, nanopartiklar, mikropartiklar, inkapslade läkemedel eller till och med levande celler kan appliceras mycket mer exakt jämfört med nålinjektioner i olika vävnader riktade. Minimalt invasiva metoder kräver exakt lokalisering av läkemedlet i förutbestämda lager av den riktade vävnaden genom att förvala injektionstryck. Vårt nuvarande fokus är cellterapi för urininkontinens.Denna teknik har emellertid redan utvidgats till regenerering av infekterad muskelvävnad efter allvarliga hjärtattacker. För närvarande kan tekniken endast tillämpas av erfarna forskare eller legitimerade läkare i prekliniska studier. Det är inte avsett att användas i rutinmässiga laboratorieprocedurer eftersom det utvecklas för framtida kliniska ändamål.För att börja, placera urinröret med den anslutande blåsan dissekerad från en vuxen kvinnlig landrace gris på en svamp som efterliknar elasticiteten i den nedre bäckenbotten. Använd sedan urinblåsan, bestäm urinrörets orientering. Detta är möjligt på grund av lokaliseringen av urinledaren och de tre ligamenten, som fixerar blåsan i buk- och bäckenhålan.Efter korrekt orientering av urinröret, skär det öppet i längdriktningen på dorsalsidan med hjälp av en kateter. Efter justering av celldensiteten hos svinens fettvävnadshärledda stromaceller till 2,4 gånger 10 till de sjätte cellerna per milliliter, märk cellerna med en grön fluorescerande membranpermeabel levande cellfläck, aspirera sedan cellsuspensionen med sprutan och applicera Williams cytoskopiska injektionsnål. Håll sedan nålen strax ovanför de två milliliterna tillväxtmedier i ett 15 ml centrifugeringsrör eller sätt in nålen i den öppna urinrörsvävnaden.I båda fallen injicerar du manuellt 250 mikroliter av cellsuspensionen. Celler injiceras i kadaveruretröret från en injektionskupol. Samla cellerna som injiceras i mediet direkt genom centrifugering.För celler som injiceras i kadaveruretröret, aspirera dem ur injektionskupolen med en 18 gauge nål applicerad på en spruta. Överför de aspirerade cellerna till ett centrifugeringsrör och pelletera dem genom centrifugering. Resuspend båda cellpelletsna i fyra milliliter tillväxtmedier.För att bestämma cellutbyte och livskraft, blanda 20 av cellsuspensionen noggrant med 20 mikroliter trypanblå. Fyll sedan 10 mikroliter av denna blandning i varje kammare i hemocytometern. Under ett mikroskop räkna cellerna i alla fyra hörnrutorna.Räkna de ofärgade vita cellerna som livskraftiga celler och de blåfärgade cellerna som döda celler och beräkna sedan cellnumret per milliliter. För injektioner via vattenstrålen, justera densiteten hos svinens fettvävnadshärledda stromaceller till sex gånger 10 till sjätte celler per milliliter. Märk dem som visats tidigare och fyll i cellsuspensionen i doseringsenheten på den nålfria vattenstråleanordningen.Håll sedan antingen injektionsmunstycket strax ovanför de två milliliter tillväxtmedierna i ett 15 ml centrifugeringsrör eller strax ovanför den öppna urinrörsvävnaden. I båda fallen injicera 100 mikroliter av cellsuspensionen. Använd högt tryck för vävnadspenetration följt av en lågtrycksfas för cellinjektioner.Celler som injiceras i kadaveruretröret bildar en injektionskupol. Samla celler som injiceras i mediet direkt genom centrifugering. För celler som injiceras i kadaveruretröret, aspirera dem ur injektionskupolen.Överför de aspirerade cellerna till ett centrifugeringsrör och pelletera dem med centrifugering som visats tidigare. Efter centrifugering, återsuspendera båda pelletsna i fyra milliliter tillväxtmedier. Frö cellerna som hämtas efter injektioner i vävnadsodlingsrätter med en densitet av fem gånger 10 till de femte cellerna per maträtt.Efter en tre timmars inkubation vid 37 grader Celsius, och strax före AFM-mätningen, ersätt tillväxtmediet med tre milliliter Av Leibovitz L-15-media utan L-glutamin. För att mäta elasticiteten hos enskilda celler, identifiera visuellt en cell och fokusera på den. Placera sedan datormusen i mitten av cellen och för att förbättra mätprecisionen, placera AFM-spetsen direkt ovanför cellkärnan.Fokusera sedan på utskjutande och flytta den på datormusen. Starta sedan mätningen med run och mät minst 50 celler. Skarpunktsparametern erhållen genom kalibrering av utskjutande delen används och en cell mäts tre gånger.Livskraften hos celler som levererades genom Williams-nålen var högre än injektioner av vattenstrålen med E60-10-inställningarna. Biomekanisk bedömning av injektioner i infångningsvätskan avslöjade att Williams nålinjektioner inte visade någon signifikant skillnad i den elastiska modulen jämfört med kontroller, medan vattenstråleinjektionerna signifikant minskade den cellulära elastiska modulen med 40 till 50%På samma sätt, i kadaveriska urinrörsvävnadsprover, gav Williams nålinjektioner ingen signifikant skillnad i cellulär elastisk modul jämfört med kontroller. En signifikant minskning med 51% observerades emellertid efter vattenskärningsinjektioner.Man måste bara se till att nålinjektionerna inte helt tränger igenom vävnaden som orsakar skada. Med vattenstråle måste man bara placera enheten i rätt läge i injektionsområdet medan resten automatiskt görs av själva enheten. Eftersom vattenskärningsanordningen utvecklades för att matcha och passa in i endoskopiska enheter kan du använda vattenskärningsapplikationerna för vilken plats som helst i kroppen som kan nås av dessa cystoskopiska eller endoskopiska tekniker för att regenerera vävnader och göra reparationsjobbet.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation av inducerad Pluripotent Stamcell-härledd Mesoangioblast-liknande Myogena föregångare i musmodeller av muskelregenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Human Brosk Tissue Fabrication Använda Tredimensionell Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

En injicerbar and Drug belastad Supra Hydrogel för lokal kateter Injektion i Pig Heart

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

Isolering av murina adipos vävnad Microvascular Fragment som Vaskularisering Aggregat för Tissue Engineering

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Generiskt protokoll för optimering av heterologa proteinproduktion med hjälp av automatiserad Microbioreactor teknik

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

Lokalt av primära nedsatt vävnad segment och inkorporering med romanen byggnadsställning-fri konstruktion teknik

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

Isolering och Decellularization av en hela svin bukspottkörtel

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Hög upplöst avbildning av Kärndynamik i levande celler under Enaxiell drag belastning

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

Encapsulated Cell Technology for the Delivery of Biologics to the Mouse Eye

Inkapslade cellteknik för leverans av biologiska läkemedel till musöga

Many current therapeutics under development for diseases of the posterior pole of the eye are biologics. These drugs need to be administered frequently, ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

Pankreasvävnad-härledda extracellulära matrix Bioink för utskrift 3D cell-lastat Pankreasvävnad konstruktioner

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...