2.7K Views
•
09:21 min
•
November 30th, 2021
DOI :
November 30th, 2021
•0:04
Introduction
1:23
Seeding of Astrocytes in the Wells
2:50
Seeding of Pericytes on the Reverted Insert Filters
4:35
Seeding of Endothelial Cells on the Insert Filters
6:00
Maintenance of the Triple Cell Culture for the Induction of the BBB Properties
6:35
Results: Properties of the Triple Culture BBB Model and the Comparison of BLEC Gene Expression and Protein Level of Distinctive Markers in the Triple Culture Model with the Co‐culture BBB Model
8:49
Conclusion
Transcript
Lægemiddellevering til hjernen forblev en udfordring. Udviklingen af store paneler af nye nanomaterialer for at forbedre leveringen til hjernen understreger behovet for et reelt in vitro-mikrosystem til at forudsige hjernens indtrængning inden for rammerne af prækliniske assays. Den største fordel ved denne teknik er at ise de frie smerte cellulære faktiske tal i blodhjernebarrieren inde i det samme system, der tillader cellecellekommunikation, der kræves til induktion af blodhjernebarrierefænotypen.
Desuden kan hver celletype isoleres separat til yderligere molekylær analyse. Modellen kan bruges til en lang række eksperimenter under sunde og patologiske forhold og repræsenterer et værdifuldt værktøj til prækliniske vurderinger af molekyle- og partikeltransporter samt inter- og intracellulær handel. Demonstrerer proceduren vil være Dr. Clemence Deligne og Dr.Eleonora Rizzi.
Begynd med at kode brøndene med 500 mikroliter to mikrogram pr. Kvadratcentimeter Poly-L-lysinopløsning. Inkuberes natten over eller i mindst en time ved 37 grader Celsius, og poly-L-lysinopløsningen fjernes forsigtigt med en glaspipette forbundet til et aspirationssystem. Skyl derefter to gange med sterilt vand.
For at samle astrocytterne skal du først vaske astrocytterne en gang med 10 ml varm 1X PBS CMF. Inkuber dem i tre minutter med 10 ml varm 20% Trypsin EDTA-opløsning ved 37 grader Celsius under 5% kuldioxid og 21% ilt. Cellerne frigøres mekanisk fra kolben, og suspensionen overføres til et konisk rør indeholdende fem ml varm ikke-fortyndet FCS.
Centrifuger suspensionen ved 190 gange G i fem minutter ved 20 grader Celsius. Suspender cellepelleten igen i fem milliliter varmt astrocytmedium, og fortynd derefter 20 mikroliter af cellesuspensionen med 80 mikroliter 1X PBS CMF. Tæl cellerne ved hjælp af et manuelt tællekammer under et mikroskop.
Plade omkring 40.000 celler pr. Kvadratcentimeter i hver Poly-L-lysin forudkodet godt i et volumen på 1,5 ml varmt astrocytmedium. Placer de tilbageførte indsatsfiltre i periferien af en dækket 25 millimeter høj skål, og tilsæt 250 mikroliter kollagen type en opløsning til indsatsfiltrene. Inkuberes ved stuetemperatur i en time.
Fjern derefter forsigtigt kollagen type et-opløsningen med en glaspipette forbundet til et aspirationssystem. Vask to gange med 250 mikroliter DMEM høj glukose ved stuetemperatur og fjern forsigtigt al opløsningen fra indsatsfiltrene. Vask pericytterne to gange med 10 ml varm 1X PBS CMF og inkuber cellerne med to milliliter varm trypsin.
Overhold cellerne under mikroskopet for at overvåge virkningen af Trypsin. Når cellerne begynder at løsne sig, skal du fjerne trypsinen og derefter tilføje fem milliliter varmt endotelcellebasalmedium eller ECM til cellerne og starte mekanisk dissociation. Fortynd 20 mikroliter af cellesuspensionen med 80 mikroliter 1X PBS CMF, og tæl cellerne ved hjælp af et manuelt tællekammer under et mikroskop som vist tidligere.
Frø 44.500 celler pr. centimeter kvadrat på de forkodede tilbageførte indsatsfiltre i et volumen på 250 mikroliter. Opbevar indsatsfiltrene i en befugtet inkubator ved 37 grader Celsius i tre timer under 5% kuldioxid og 21% ilt. Brug steril pincet til forsigtigt at vende indsatsfiltrene tilbage i en 12 brøndplade indeholdende 1,5 ml varm ECM pr. Brønd.
Indsatsfiltrene er nu klar til at blive belagt på den anden side. Belæg oversiden og indsatsfiltrene med 500 mikroliter ekstracellulær matrixbaseret hydrogel. Anbring indsatsfiltrene i en befugtet inkubator ved 37 grader Celsius under 5% kuldioxid og 21% ilt i en time.
Vask dem en gang med 500 mikroliter DMEM høj glukose ved stuetemperatur. Vask endotelcellekulturen en gang med 10 ml varm 1X PBS CMF og inkuber cellerne med to milliliter varm trypsin. Fjern Trypsin, når cellerne begynder at løsne sig, tilsæt derefter fem milliliter varm ECM og start mekanisk dissociation.
Fortynd 20 mikroliter af cellesuspensionen med 80 mikroliter 1X PBS CMF og tæl cellerne ved hjælp af et manuelt tællekammer. Frø endotelcellerne med en tæthed på 71.500 celler pr. Centimeter kvadrat på de forkodede indsatsfiltre i et volumen på 500 mikroliter varm ECM. Udskift astrocytmediet med 1,5 ml varm ECM pr. Brønd.
Overfør derefter de seedede indsatsfiltre til brøndene, der indeholder astrocytterne. Placer trikulturcellesystemerne i en befugtet inkubator ved 37 grader Celsius under 5% kuldioxid og 21% ilt. Tag forsigtigt mediet af det øverste og nederste rum ved hjælp af en glaspipette forbundet med et aspirationssystem.
Udskift mediet med varm ECM i et volumen på 500 mikroliter i det øverste rum og 1,5 ml i det nederste rum. Forny mediet hver anden dag indtil dag seks ved at gentage den samme procedure. Sæt endelig cellerne tilbage i befugtet inkubator ved 37 grader Celsius under 5% kuldioxid og 21% ilt.
Immunocytokemiske data bekræftede ekspressionen af konventionelle markører såsom blodpladeafledt vækstfaktorreceptor beta og Desmine for pericytter og glialfibrillært surt protein til astrocytter. Derfor, efter seks dages kultur med pericytter og astrocytter, viser monolaget af hjernelignende endotelceller eller BLEC'er visualiseret med den vedhæftede krydsfarvning af Ve-Cadherin en kontinuerlig lokalisering af TJ-proteiner CLD5 og Z-01 ved cellegrænserne. Paracellulær permeabilitet af BLECS til fluorescerende BBB-integritetsmarkører, natriumfluorescein og FITC dextran er vist her.
R123 intracellulær akkumulering i BLEC'er udviste en signifikant stigning i tilstedeværelsen af udstrømningspumpehæmmeren Elacridar sammenlignet med kontroltilstanden med dens fravær. Dette indikerer tilstedeværelsen af aktive effluxpumpemolekyler, nemlig P-glycoprotein og brystkræftresistensprotein eller BCRP i BLEC'erne. Genekspression af tætte krydsproteiner, transportører og store molekylereceptorer normaliseret ved ekspression af RPLP0 er vist her.
Her svarer værdierne større end en til højere genekspression i triple culture-modellen. Den røde linje svarer til en værdi af en, hvor udtryksniveauet for de to modeller er ækvivalent. Det repræsentative billede viser proteinniveauet af tætte krydsproteiner, transportører, i store molekylereceptorer normaliseret ved ekspression af beta-actin.
Transporten af fluorescerende mærkede NIPAM-baserede neutrale polymere nanogeler blev evalueret. På tidspunktet nul blev polymere nanogeler anbragt i luminalrummet i en koncentration på 0, 1 milligram pr. Milliliter. Efter 24 timers inkubation blev 5,82% af de polymere nanogeler fundet i det abluminale rum, der beviste deres evne til at krydse BLEC'erne.
Den korrekte belægning og såning af pericytterne på det tilbageførte filter er afgørende. Vigtigt er vedligeholdelsen af strukturerne sterilitet og integritet for at undgå forurening af cellekultursystemet.
Denne protokol beskriver en metode til at etablere en human blod-hjerne barriere (BBB) in vitro model. Endotelcellerne og pericytterne er podet på hver side af et indsatsfilter (blodrum), og astrocytter er podet i bundbrønden (hjernerummet). Den karakteriserede model blev brugt til nanopartikler transporteksperimenter.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved