2.7K Views
•
09:21 min
•
November 30th, 2021
DOI :
November 30th, 2021
•0:04
Introduction
1:23
Seeding of Astrocytes in the Wells
2:50
Seeding of Pericytes on the Reverted Insert Filters
4:35
Seeding of Endothelial Cells on the Insert Filters
6:00
Maintenance of the Triple Cell Culture for the Induction of the BBB Properties
6:35
Results: Properties of the Triple Culture BBB Model and the Comparison of BLEC Gene Expression and Protein Level of Distinctive Markers in the Triple Culture Model with the Co‐culture BBB Model
8:49
Conclusion
Transcript
Medicijnafgifte aan de hersenen bleef een uitdaging. De ontwikkeling van grote panelen van nieuwe nanomaterialen om de levering aan de hersenen te verbeteren, benadrukt de noodzaak van een echt in vitro microsysteem om hersenpenetratie te voorspellen in het kader van preklinische testen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is om de vrije pijn cellulaire actuals van de bloed-hersenbarrière in hetzelfde systeem te ijsberen, waardoor celcelcommunicatie mogelijk is die nodig is voor de inductie van het fenotype van de bloed-hersenbarrière.
Bovendien kunnen alle celtypen afzonderlijk worden geïsoleerd voor verdere moleculaire analyse. Het model kan worden gebruikt voor een uitgebreid scala aan experimenten in gezonde en pathologische omstandigheden en vormt een waardevol hulpmiddel voor preklinische beoordelingen van molecuul- en deeltjestransporten, evenals inter- en intracellulaire handel. De procedure wordt gedemonstreerd door Dr.Clemence Deligne en Dr.Eleonora Rizzi.
Begin met het coderen van de putjes met 500 microliter van twee microgram per vierkante centimeter Poly-L-Lysine-oplossing. Incubeer 's nachts of minimaal een uur bij 37 graden Celsius en verwijder de Poly-L-Lysine-oplossing voorzichtig met een glazen pipet aangesloten op een aspiratsysteem. Spoel vervolgens twee keer met steriel water.
Om de astrocyten te verzamelen, wast u de astrocyten eerst een keer met 10 milliliter warme 1X PBS CMF. Incubeer ze gedurende drie minuten met 10 milliliter warme 20% Trypsine EDTA-oplossing bij 37 graden Celsius onder 5% koolstofdioxide en 21% zuurstof. Maak de cellen mechanisch los van de kolf en breng de suspensie over in een conische buis die vijf milliliter warm niet-verdund FCS bevat.
Centrifugeer de suspensie op 190 maal G gedurende vijf minuten bij 20 graden Celsius. Suspensie de celpellet opnieuw in vijf milliliter warm astrocytenmedium en verdun vervolgens 20 microliter van de celsuspensie met 80 microliter 1X PBS CMF. Tel de cellen met behulp van een handmatige telkamer onder een microscoop.
Plaat ongeveer 40.000 cellen per vierkante centimeter in elke Poly-L-Lysine goed gecodeerd in een volume van 1,5 milliliter warm astrocytenmedium. Plaats de omgekeerde insertfilters aan de rand van een bedekte schaal van 25 millimeter hoog en voeg 250 microliter collageen type één oplossing toe aan de insertfilters. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende een uur.
Verwijder vervolgens voorzichtig de collageen type één-oplossing met een glazen pipet die is aangesloten op een aspiratatiesysteem. Was tweemaal met 250 microliter DMEM hoge glucose bij kamertemperatuur en verwijder voorzichtig alle oplossing uit de insteekfilters. Was de pericyten twee keer met 10 milliliter warm 1X PBS CMF en incubeer de cellen met twee milliliter warm Trypsine.
Observeer de cellen onder de microscoop om de werking van het Trypsine te volgen. Wanneer de cellen beginnen los te komen, verwijdert u het Trypsine, voegt u vijf milliliter warm endotheelcelbasaal medium of ECM toe aan de cellen en start u mechanische dissociatie. Verdun 20 microliter van de celsuspensie met 80 microliter 1X PBS CMF en tel de cellen met behulp van een handmatige telkamer onder een microscoop zoals eerder getoond.
Zaad 44, 500 cellen per vierkante centimeter op de voorgecodeerde omgekeerde insertfilters in een volume van 250 microliter. Bewaar de wisselplaatfilters in een bevochtigde incubator op 37 graden Celsius gedurende drie uur onder 5% koolstofdioxide en 21% zuurstof. Gebruik een steriel pincet om de wisselplaatfilters voorzichtig om te zetten in een plaat met 12 putten met 1,5 milliliter warme ECU per put.
De wisselplaatfilters zijn nu klaar om aan de andere kant te worden gecoat. Bedek de bovenzijde en de inzetfilters met 500 microliter extracellulaire hydrogel op basis van matrix. Plaats de wisselplaatfilters in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius onder 5% koolstofdioxide en 21% zuurstof gedurende een uur.
Was ze eenmaal met 500 microliter DMEM hoge glucose bij kamertemperatuur. Was de endotheelcelcultuur eenmaal met 10 milliliter warme 1X PBS CMF en incubeer de cellen met twee milliliter warm Trypsine. Verwijder de Trypsine wanneer de cellen beginnen los te komen, voeg vervolgens vijf milliliter warme ECU toe en start de mechanische dissociatie.
Verdun 20 microliter van de celsuspensie met 80 microliter 1X PBS CMF en tel de cellen met behulp van een handmatige telkamer. Zaai de endotheelcellen met een dichtheid van 71.500 cellen per vierkante centimeter op de voorgecodeerde insertfilters in een volume van 500 microliter warme ECU. Vervang het astrocytenmedium door 1,5 milliliter warme ECU per put.
Breng vervolgens de gezaaide insertfilters over naar de putten met de astrocyten. Plaats de tricultuurcelsystemen in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius onder 5% koolstofdioxide en 21% zuurstof. Verwijder het medium voorzichtig uit het bovenste en onderste compartiment met behulp van een glazen pipet die is verbonden met een aspiratiesysteem.
Vervang het medium door warme ECU in een volume van 500 microliter in het bovenste compartiment en 1,5 milliliter in het onderste compartiment. Vernieuw het medium om de dag tot dag zes door dezelfde procedure te herhalen. Zet de cellen uiteindelijk terug in de bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius onder 5% koolstofdioxide en 21% zuurstof.
Immunocytochemische gegevens bevestigden de expressie van conventionele markers zoals van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor bèta en Desmine voor pericyten, en gliaal fibrillair zuur eiwit voor astrocyten. Vandaar dat, na zes dagen van cultuur met de pericyten en astrocyten, de monolaag van hersenachtige endotheelcellen of BCC's gevisualiseerd met de adherente junctiekleuring van Ve-Cadherine een continue lokalisatie van TJ-eiwitten CLD5 en Z-01 aan de celgrenzen vertoont. Paracellulaire permeabiliteit van BLECS tot fluorescerende BBB-integriteitsmarkers, natriumfluoresceïne en FITC-dextran wordt hier weergegeven.
R123 intracellulaire accumulatie in BCC's vertoonde een significante toename van de aanwezigheid van de effluxpompremmer Elacridar in vergelijking met de controleconditie met zijn afwezigheid. Dit duidt op de aanwezigheid van actieve efflux pompmoleculen namelijk P glycoproteïne en borstkanker resistentie eiwit of BCRP in de BLEC's. Genexpressie van tight junction-eiwitten, transporters en grote molecuulreceptoren genormaliseerd door de expressie van RPLP0 worden hier weergegeven.
Hier komen de waarden groter dan één overeen met een hogere genexpressie in het triple culture model. De rode lijn komt overeen met een waarde van één waarbij het expressieniveau van de twee modellen equivalent is. De representatieve afbeelding toont het eiwitniveau van tight junction-eiwitten, transporters, in grote molecuulreceptoren genormaliseerd door de expressie van bèta-actine.
Het transport van fluorescerend gelabelde NIPAM-gebaseerde neutrale polymere nanogels werd geëvalueerd. Op tijdstip nul werden polymere nanogels in het luminale compartiment geplaatst met een concentratie van 0,1 milligram per milliliter. Na 24 uur incubatie werd 5,82% van de polymere nanogels gevonden in het abluminale compartiment, wat bewijst dat ze in staat zijn om de BCC's te passeren.
De juiste coating en zaaiing van de pericyten op het omgekeerde filter is cruciaal. Belangrijk is het behoud van de steriliteit en integriteit van de structuren om besmetting van het celkweeksysteem te voorkomen.
Dit protocol beschrijft een methode om een menselijk bloed-hersenbarrière (BBB) in vitro model vast te stellen. De endotheelcellen en pericyten worden aan elke kant van een insertfilter (bloedcompartiment) gezaaid en astrocyten worden in de onderste put (hersencompartiment) gezaaid. Het gekarakteriseerde model werd gebruikt voor nanodeeltjestransportexperimenten.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved