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November 30th, 2021
DOI :
November 30th, 2021
•0:04
Introduction
1:23
Seeding of Astrocytes in the Wells
2:50
Seeding of Pericytes on the Reverted Insert Filters
4:35
Seeding of Endothelial Cells on the Insert Filters
6:00
Maintenance of the Triple Cell Culture for the Induction of the BBB Properties
6:35
Results: Properties of the Triple Culture BBB Model and the Comparison of BLEC Gene Expression and Protein Level of Distinctive Markers in the Triple Culture Model with the Co‐culture BBB Model
8:49
Conclusion
Transcript
मस्तिष्क में दवा वितरण एक चुनौती बनी रही। मस्तिष्क को वितरण में सुधार के लिए नए नैनोमटेरियल्स के बड़े पैनलों का विकास प्रीक्लिनिकल परख के फ्रेम में मस्तिष्क प्रवेश की भविष्यवाणी करने के लिए वास्तविक इन विट्रो माइक्रोसिस्टम की आवश्यकता पर प्रकाश डालता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ रक्त मस्तिष्क बाधा के मुक्त दर्द सेलुलर वास्तविकताओं को एक ही प्रणाली के अंदर बर्फ करना है जो रक्त मस्तिष्क बाधा फेनोटाइप के प्रेरण के लिए आवश्यक सेल सेल संचार की अनुमति देता है।
इसके अलावा, प्रत्येक सेल प्रकारों को आगे आणविक विश्लेषण के लिए अलग से अलग किया जा सकता है। मॉडल का उपयोग स्वस्थ और पैथोलॉजिकल स्थितियों में प्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए किया जा सकता है और अणु और कण परिवहन के प्रीक्लिनिकल आकलन के साथ-साथ अंतर और इंट्रासेल्युलर तस्करी के लिए एक मूल्यवान उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है। प्रक्रिया का प्रदर्शन डॉ क्लेमेंस डेलिग्ने और डॉ एलोनोरा रिज्जी करेंगे।
दो माइक्रोग्राम प्रति वर्ग सेंटीमीटर पॉली-एल-लाइसिन समाधान के 500 माइक्रोलीटर के साथ कुओं को कोडिंग करके शुरू करें। रात भर या 37 डिग्री सेल्सियस पर न्यूनतम एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें और पॉली-एल-लाइसिन समाधान को एक एस्पिरेटिंग सिस्टम से जुड़े ग्लास पिपेट के साथ सावधानीपूर्वक हटा दें। फिर बाँझ पानी से दो बार धो लें।
एस्ट्रोसाइट्स को इकट्ठा करने के लिए, पहले एस्ट्रोसाइट्स को 10 मिलीलीटर गर्म 1 एक्स पीबीएस सीएमएफ के साथ एक बार धो लें। उन्हें 5% कार्बन डाइऑक्साइड और 21% ऑक्सीजन के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिलीलीटर गर्म 20% ट्रिप्सिन ईडीटीए समाधान के साथ तीन मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। यांत्रिक रूप से फ्लास्क से कोशिकाओं को अलग करें और निलंबन को एक शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें पांच मिलीलीटर गर्म गैर-पतला एफसीएस होता है।
निलंबन को 20 डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 190 गुना जी पर सेंट्रीफ्यूज करें। गर्म एस्ट्रोसाइट माध्यम के पांच मिलीलीटर में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें, फिर 1 एक्स पीबीएस सीएमएफ के 80 माइक्रोलीटर के साथ सेल निलंबन के 20 माइक्रोलीटर को पतला करें। माइक्रोस्कोप के तहत मैन्युअल गिनती कक्ष का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
प्रत्येक पॉली-एल-लाइसिन में प्रति वर्ग सेंटीमीटर लगभग 40,000 कोशिकाओं की प्लेट 1.5 मिलीलीटर गर्म एस्ट्रोसाइट माध्यम की मात्रा में अच्छी तरह से पूर्व-कोडित होती है। एक ढके हुए 25 मिलीमीटर ऊंचे पकवान की परिधि पर प्रत्यावर्तित सम्मिलित फिल्टर रखें और सम्मिलित फिल्टर में कोलेजन प्रकार एक समाधान के 250 माइक्रोलीटर जोड़ें। एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
फिर एक एस्पिरेटिंग सिस्टम से जुड़े ग्लास पिपेट के साथ कोलेजन टाइप वन समाधान को सावधानीपूर्वक हटा दें। कमरे के तापमान पर डीएमईएम उच्च ग्लूकोज के 250 माइक्रोलीटर के साथ दो बार धोएं और इंसर्ट फिल्टर से सभी समाधान को सावधानीपूर्वक हटा दें। पेरिसाइट्स को 10 मिलीलीटर गर्म 1एक्स पीबीएस सीएमएफ के साथ दो बार धोएं और कोशिकाओं को दो मिलीलीटर गर्म ट्रिप्सिन के साथ इनक्यूबेट करें।
ट्रिप्सिन की कार्रवाई की निगरानी के लिए माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें। जब कोशिकाएं अलग होना शुरू कर देती हैं, तो ट्रिप्सिन को हटा दें, फिर कोशिकाओं में गर्म एंडोथेलियल सेल बेसल माध्यम या ईसीएम के पांच मिलीलीटर जोड़ें, और यांत्रिक पृथक्करण शुरू करें। 1X PBS CMF के 80 माइक्रोलीटर के साथ सेल सस्पेंशन के 20 माइक्रोलीटर को पतला करें, और माइक्रोस्कोप के तहत मैन्युअल काउंटिंग चैंबर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें जैसा कि पहले दिखाया गया है।
बीज 44, 500 कोशिकाएं प्रति सेंटीमीटर वर्ग पूर्व-कोडित पर 250 माइक्रोलीटर की मात्रा में प्रत्यावर्तित फिल्टर डालती हैं। एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में 5% कार्बन डाइऑक्साइड और 21% ऑक्सीजन के तहत तीन घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर डालें फिल्टर रखें। 12 अच्छी तरह से 12 अच्छी प्लेट में डालने वाले फिल्टर को सावधानीपूर्वक वापस करने के लिए बाँझ चिमटी का उपयोग करें जिसमें प्रति कुएं 1.5 मिलीलीटर गर्म ईसीएम होता है।
सम्मिलित फिल्टर अब दूसरी तरफ लेपित होने के लिए तैयार हैं। बाह्य मैट्रिक्स आधारित हाइड्रोगेल के 500 माइक्रोलीटर के साथ ऊपरी तरफ और सम्मिलित फिल्टर को कोट करें। एक घंटे के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड और 21% ऑक्सीजन के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में डालें।
कमरे के तापमान पर डीएमईएम उच्च ग्लूकोज के 500 माइक्रोलीटर के साथ उन्हें एक बार धो लें। एंडोथेलियल सेल कल्चर को एक बार 10 मिलीलीटर गर्म 1 एक्स पीबीएस सीएमएफ के साथ धो लें और कोशिकाओं को दो मिलीलीटर गर्म ट्रिप्सिन के साथ इनक्यूबेट करें। ट्रिप्सिन को हटा दें जब कोशिकाएं अलग होने लगती हैं, फिर पांच मिलीलीटर गर्म ईसीएम जोड़ें और यांत्रिक पृथक्करण शुरू करें।
1X PBS CMF के 80 माइक्रोलीटर के साथ सेल सस्पेंशन के 20 माइक्रोलीटर को पतला करें और मैन्युअल काउंटिंग चैंबर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। प्री-कोडेड इंसर्ट फिल्टर पर 71,500 कोशिकाओं प्रति सेंटीमीटर वर्ग के घनत्व पर एंडोथेलियल कोशिकाओं को गर्म ईसीएम के 500 माइक्रोलीटर की मात्रा में बीज दें। एस्ट्रोसाइट माध्यम को प्रति कुएं 1.5 मिलीलीटर गर्म ईसीएम के साथ बदलें।
फिर बीज वाले सम्मिलित फिल्टर को एस्ट्रोसाइट्स युक्त कुओं में स्थानांतरित करें। ट्राई-कल्चर सेल सिस्टम को 5% कार्बन डाइऑक्साइड और 21% ऑक्सीजन के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में रखें। एक आकांक्षा प्रणाली से जुड़े ग्लास पिपेट का उपयोग करके ऊपरी और नीचे के डिब्बे से माध्यम को सावधानीपूर्वक उतारें।
ऊपरी डिब्बे में 500 माइक्रोलीटर और नीचे के डिब्बे में 1.5 मिलीलीटर की मात्रा में माध्यम को गर्म ईसीएम के साथ बदलें। एक ही प्रक्रिया को दोहराकर छह वें दिन तक हर दूसरे दिन माध्यम को नवीनीकृत करें। अंत में कोशिकाओं को 5% कार्बन डाइऑक्साइड और 21% ऑक्सीजन के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में वापस रखा गया।
इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री डेटा ने पेरिसाइट्स के लिए प्लेटलेट व्युत्पन्न विकास कारक रिसेप्टर बीटा और डेसमाइन और एस्ट्रोसाइट्स के लिए ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन जैसे पारंपरिक मार्करों की अभिव्यक्ति की पुष्टि की। इसलिए, पेरिसाइट और एस्ट्रोसाइट्स के साथ छह दिनों की संस्कृति के बाद, मस्तिष्क जैसी एंडोथेलियल कोशिकाओं या बीएलसी के मोनोलेयर को वे-कैडरिन के अनुयायी जंक्शन धुंधला होने के साथ देखा जाता है, जो सेल सीमाओं पर टीजे प्रोटीन सीएलडी 5 और जेड -01 का निरंतर स्थानीयकरण प्रदर्शित करता है। फ्लोरोसेंट बीबीबी अखंडता मार्करों, सोडियम फ्लोरेसिन और एफआईटीसी डेक्सट्रान के लिए बीएलईसीएस की पैरासेल्युलर पारगम्यता यहां दिखाई गई है।
बीएलईसी में आर 123 इंट्रासेल्युलर संचय ने इसकी अनुपस्थिति के साथ नियंत्रण स्थिति की तुलना में एफ्लक्स पंप अवरोधक एलाक्रीडर की उपस्थिति में उल्लेखनीय वृद्धि का प्रदर्शन किया। यह सक्रिय एफ्लक्स पंप अणुओं जैसे पी ग्लाइकोप्रोटीन और स्तन कैंसर प्रतिरोध प्रोटीन या बीसीआरपी की उपस्थिति को दर्शाता है। आरपीएलपी 0 की अभिव्यक्ति द्वारा सामान्यीकृत तंग जंक्शन प्रोटीन, ट्रांसपोर्टर्स और बड़े अणु रिसेप्टर्स की जीन अभिव्यक्ति यहां दिखाई गई है।
यहां, एक से अधिक मूल्य ट्रिपल कल्चर मॉडल में उच्च जीन अभिव्यक्ति के अनुरूप हैं। लाल रेखा एक के मूल्य से मेल खाती है जहां दो मॉडलों का अभिव्यक्ति स्तर बराबर होता है। प्रतिनिधि छवि बीटा एक्टिन की अभिव्यक्ति द्वारा सामान्यीकृत बड़े अणु रिसेप्टर्स में तंग जंक्शन प्रोटीन, ट्रांसपोर्टरों के प्रोटीन स्तर को दिखाती है।
फ्लोरोसेंटली टैग किए गए एनआईपीएएम आधारित तटस्थ पॉलिमरिक नैनो जैल के परिवहन का मूल्यांकन किया गया था। शून्य समय पर, बहुलक नैनो जैल को ल्यूमिनल डिब्बे में 0.1 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर की एकाग्रता पर रखा गया था। इनक्यूबेशन के 24 घंटों के बाद, 5.82% पॉलीमेरिक नैनो जैल एब्ल्यूमिनल डिब्बे में पाए गए, जो बीएलईसी को पार करने की उनकी क्षमता को साबित करते हैं।
प्रत्यावर्तित फिल्टर पर पेरिसाइट्स की सही कोटिंग और सीडिंग महत्वपूर्ण है। सेल कल्चर सिस्टम के संदूषण से बचने के लिए संरचनाओं बाँझपन और अखंडता का रखरखाव महत्वपूर्ण है।
यह प्रोटोकॉल विट्रो मॉडल में मानव रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) स्थापित करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। एंडोथेलियल कोशिकाओं और पेरिसाइट को एक सम्मिलित फिल्टर (रक्त डिब्बे) के प्रत्येक तरफ बीज दिया जाता है, और एस्ट्रोसाइट्स को नीचे के कुएं (मस्तिष्क डिब्बे) में बीज दिया जाता है। विशेषता वाले मॉडल का उपयोग नैनोकणों परिवहन प्रयोगों के लिए किया गया था।
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