Un sistema di cellule a tripla coltura che modella la barriera emato-encefalica umana

La somministrazione di farmaci al cervello è rimasta una sfida. Lo sviluppo di grandi pannelli di nuovi nanomateriali per migliorare la consegna al cervello evidenzia la necessità di un vero microsistema in vitro per prevedere la penetrazione cerebrale nell'ambito dei saggi preclinici. Il vantaggio principale di questa tecnica è quello di ghiacciare gli effettivi cellulari del dolore libero della barriera ematoencefalica all'interno dello stesso sistema consentendo le comunicazioni cellulari necessarie per l'induzione del fenotipo della barriera ematoencefalica.

Inoltre, ogni tipo di cellula può essere isolato separatamente per ulteriori analisi molecolari. Il modello può essere utilizzato per una vasta gamma di esperimenti in condizioni sane e patologiche e rappresenta un valido strumento per le valutazioni precliniche dei trasporti di molecole e particelle, nonché del traffico intercellulare e intracellulare. A dimostrare la procedura saranno la Dott.ssa Clemence Deligne e la Dott.ssa Eleonora Rizzi.

Inizia codificando i pozzetti con 500 microlitri di due microgrammi per centimetro quadrato Soluzione di poli-L-lisina. Incubare durante la notte o per un minimo di un'ora a 37 gradi Celsius e rimuovere accuratamente la soluzione di poli-L-lisina con una pipetta di vetro collegata a un sistema di aspirazione. Quindi risciacquare due volte con acqua sterile.

Per raccogliere gli astrociti, lavare prima gli astrociti una volta con 10 millilitri di 1X PBS CMF caldo. Incubarli per tre minuti con 10 millilitri di soluzione calda al 20% di tripsina EDTA a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica e il 21% di ossigeno. Staccare meccanicamente le celle dal pallone e trasferire la sospensione in un tubo conico contenente cinque millilitri di FCS caldo non diluito.

Centrifugare la sospensione a 190 volte G per cinque minuti a 20 gradi Celsius. Risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di terreno astrocitario caldo, quindi diluire 20 microlitri della sospensione cellulare con 80 microlitri di 1X PBS CMF. Contare le cellule usando una camera di conteggio manuale al microscopio.

Piastra circa 40.000 cellule per centimetro quadrato in ogni poli-L-lisina pre-codificato bene in un volume di 1,5 millilitri di mezzo astrocitario caldo. Posizionare i filtri dell'inserto invertiti alla periferia di un piatto coperto alto 25 millimetri e aggiungere 250 microlitri di collagene tipo una soluzione ai filtri dell'inserto. Incubare a temperatura ambiente per un'ora.

Quindi rimuovere con attenzione la soluzione di collagene di tipo uno con una pipetta di vetro collegata a un sistema di aspirazione. Lavare due volte con 250 microlitri di DMEM ad alto glucosio a temperatura ambiente e rimuovere accuratamente tutta la soluzione dai filtri dell'inserto. Lavare i periciti due volte con 10 millilitri di 1X PBS CMF caldo e incubare le cellule con due millilitri di tripsina calda.

Osservare le cellule al microscopio per monitorare l'azione della tripsina. Quando le cellule iniziano a staccarsi, rimuovere la tripsina, quindi aggiungere cinque millilitri di mezzo basale a cellule endoteliali calde o ECM alle cellule e avviare la dissociazione meccanica. Diluire 20 microlitri della sospensione cellulare con 80 microlitri di 1X PBS CMF e contare le cellule utilizzando una camera di conteggio manuale al microscopio come mostrato in precedenza.

Seme 44, 500 cellule per centimetro quadrato sui filtri di inserto invertiti precodificati in un volume di 250 microlitri. Mantenere i filtri dell'inserto in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius per tre ore sotto il 5% di anidride carbonica e il 21% di ossigeno. Utilizzare pinzette sterili per ripristinare attentamente i filtri di inserimento in una piastra a 12 pozzetti contenente 1,5 millilitri di ECM caldo per pozzetto.

I filtri di inserimento sono ora pronti per essere rivestiti sull'altro lato. Rivestire il lato superiore e i filtri inserto con 500 microlitri di idrogel a base di matrice extracellulare. Posizionare i filtri inserto in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica e il 21% di ossigeno per un'ora.

Lavarli una volta con 500 microlitri di DMEM ad alto glucosio a temperatura ambiente. Lavare la coltura cellulare endoteliale una volta con 10 millilitri di CMF caldo 1X PBS e incubare le cellule con due millilitri di tripsina calda. Rimuovere la tripsina quando le cellule iniziano a staccarsi, quindi aggiungere cinque millilitri di ECM caldo e avviare la dissociazione meccanica.

Diluire 20 microlitri della sospensione cellulare con 80 microlitri di 1X PBS CMF e contare le celle utilizzando una camera di conteggio manuale. Seminare le cellule endoteliali a una densità di 71.500 cellule per centimetro quadrato sui filtri di inserimento precodificati in un volume di 500 microlitri di ECM caldo. Sostituire il terreno astrocitario con 1,5 millilitri di ECM caldo per pozzetto.

Quindi trasferire i filtri di inserimento seminati nei pozzetti contenenti gli astrociti. Posizionare i sistemi di celle di tricoltura in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica e il 21% di ossigeno. Rimuovere con cautela il mezzo dallo scomparto superiore e inferiore utilizzando una pipetta di vetro collegata a un sistema di aspirazione.

Sostituire il mezzo con ECM caldo in un volume di 500 microlitri nello scomparto superiore e 1,5 millilitri nello scomparto inferiore. Rinnovare il mezzo a giorni alterni fino al sesto giorno ripetendo la stessa procedura. Infine rimettere le celle in incubatore umidificato a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica e il 21% di ossigeno.

I dati immunocitochimici hanno confermato l'espressione di marcatori convenzionali come il recettore beta del fattore di crescita derivato dalle piastrine e la desmina per i periciti e la proteina acida fibrillare gliale per gli astrociti. Quindi, dopo sei giorni di coltura con i periciti e gli astrociti, il monostrato di cellule endoteliali simili al cervello o BLEC visualizzati con la colorazione di giunzione aderente di Ve-Cadherin mostra una localizzazione continua delle proteine TJ CLD5 e Z-01 ai bordi cellulari. La permeabilità paracellulare di BLECS ai marcatori di integrità fluorescenti della BBB, alla fluoresceina di sodio e al destrano FITC è mostrata qui.

L'accumulo intracellulare di R123 nei BLEC ha mostrato un aumento significativo della presenza dell'inibitore della pompa di efflusso Elacridar rispetto alla condizione di controllo con la sua assenza. Ciò indica la presenza di molecole attive della pompa di efflusso vale a dire glicoproteina P e proteina di resistenza al cancro al seno o BCRP nei BLEC. L'espressione genica di proteine a giunzione stretta, trasportatori e recettori di grandi molecole normalizzati dall'espressione di RPLP0 sono mostrati qui.

Qui, i valori maggiori di uno corrispondono a una maggiore espressione genica nel modello di tripla coltura. La linea rossa corrisponde a un valore di uno in cui il livello di espressione dei due modelli è equivalente. L'immagine rappresentativa mostra il livello proteico delle proteine a giunzione stretta, trasportatori, in recettori molecolari di grandi dimensioni normalizzati dall'espressione della beta actina.

È stato valutato il trasporto di nano gel polimerici neutri a base di NIPAM marcati con fluorescenza. Al tempo zero, nano gel polimerici sono stati collocati nel compartimento luminale ad una concentrazione di 0,1 milligrammi per millilitro. Dopo 24 ore di incubazione, il 5,82% dei nano gel polimerici sono stati trovati nel compartimento abluminale dimostrando la loro capacità di attraversare i BLEC.

Il corretto rivestimento e semina dei periciti sul filtro invertito è fondamentale. Importante è il mantenimento della sterilità e dell'integrità delle strutture per evitare la contaminazione del sistema di coltura cellulare.