2.7K Views
•
09:21 min
•
November 30th, 2021
DOI :
November 30th, 2021
•0:04
Introduction
1:23
Seeding of Astrocytes in the Wells
2:50
Seeding of Pericytes on the Reverted Insert Filters
4:35
Seeding of Endothelial Cells on the Insert Filters
6:00
Maintenance of the Triple Cell Culture for the Induction of the BBB Properties
6:35
Results: Properties of the Triple Culture BBB Model and the Comparison of BLEC Gene Expression and Protein Level of Distinctive Markers in the Triple Culture Model with the Co‐culture BBB Model
8:49
Conclusion
Transcript
Medikamentlevering til hjernen forble en utfordring. Utviklingen av store paneler av nye nanomaterialer for å forbedre leveransen til hjernen fremhever behovet for ekte in vitro mikrosystem for å forutsi hjernepenetrasjon i rammen av prekliniske analyser. Den største fordelen med denne teknikken er å ise de frie smertecellulære aktualene til blodhjernebarrieren inne i det samme systemet som tillater cellekommunikasjon som kreves for induksjon av blodhjernebarrierens fenotype.
Videre kan hver celletype isoleres separat for videre molekylær analyse. Modellen kan brukes til et omfattende spekter av eksperimenter i friske og patologiske tilstander og representerer et verdifullt verktøy for prekliniske vurderinger av molekyl- og partikkeltransporter, samt inter- og intracellulær handel. Demonstrere prosedyren vil være Dr.Clemence Deligne og Dr.Eleonora Rizzi.
Begynn med å kode brønnene med 500 mikroliter to mikrogram per kvadratcentimeter Poly-L-Lysin-løsning. Inkuber over natten eller i minst en time ved 37 grader Celsius og fjern Poly-L-Lysin-løsningen forsiktig med en glasspipette koblet til et aspireringssystem. Skyll deretter to ganger med sterilt vann.
For å samle astrocytter, vask først astrocytter en gang med 10 milliliter varm 1X PBS CMF. Inkuber dem i tre minutter med 10 milliliter varm 20% Trypsin EDTA-løsning ved 37 grader Celsius under 5% karbondioksid og 21% oksygen. Mekanisk løsne cellene fra kolben og overfør suspensjonen til et konisk rør som inneholder fem milliliter varm ikke-fortynnet FCS.
Sentrifuge suspensjonen ved 190 ganger G i fem minutter ved 20 grader Celsius. Re-suspendere cellepelleten i fem milliliter varmt astrocyttmedium, fortynn deretter 20 mikroliter av cellesuspensjonen med 80 mikroliter 1X PBS CMF. Tell cellene ved hjelp av et manuelt tellekammer under et mikroskop.
Plate rundt 40.000 celler per kvadratcentimeter i hver Poly-L-Lysin forhåndskodet brønn i et volum på 1,5 milliliter varmt astrocyttmedium. Plasser de tilbakestilte innsatsfiltrene i periferien av en dekket 25 millimeter høy tallerken og tilsett 250 mikroliter kollagen type en løsning til innsatsfiltrene. Inkuber ved romtemperatur i en time.
Fjern deretter forsiktig kollagen type en-løsningen med en glasspipette koblet til et aspirasjonssystem. Vask to ganger med 250 mikroliter DMEM høy glukose ved romtemperatur og fjern forsiktig all løsningen fra innsatsfiltrene. Vask pericytter to ganger med 10 milliliter varm 1X PBS CMF og inkuber cellene med to milliliter varm trypsin.
Vær oppmerksom på cellene under mikroskopet for å overvåke virkningen av Trypsin. Når cellene begynner å løsne, fjern Trypsin, tilsett deretter fem milliliter varmt endotelcelle basalmedium eller ECM til cellene, og start mekanisk dissosiasjon. Fortynn 20 mikroliter av cellesuspensjonen med 80 mikroliter 1X PBS CMF, og tell cellene ved hjelp av et manuelt tellekammer under et mikroskop som vist tidligere.
Frø 44, 500 celler per centimeter kvadrat på de forhåndskodede tilbakestilte innsatsfiltrene i et volum på 250 mikroliter. Hold innsatsfiltrene i en fuktet inkubator ved 37 grader Celsius i tre timer under 5% karbondioksid og 21% oksygen. Bruk steril pinsett for å forsiktig tilbakestille innsatsfiltrene i en 12-brønnplate som inneholder 1,5 milliliter varm ECM per brønn.
Innsettingsfiltrene er nå klare til å belegges på den andre siden. Belegg oversiden og innsatsfiltrene med 500 mikroliter ekstracellulær matriksbasert hydrogel. Plasser innsatsfiltrene i en fuktet inkubator ved 37 grader Celsius under 5% karbondioksid og 21% oksygen i en time.
Vask dem en gang med 500 mikroliter DMEM høy glukose ved romtemperatur. Vask endotelcellekulturen en gang med 10 milliliter varm 1X PBS CMF og inkuber cellene med to milliliter varmt trypsin. Fjern trypsinet når cellene begynner å løsne, tilsett deretter fem milliliter varm ECM og start mekanisk dissosiasjon.
Fortynn 20 mikroliter av cellesuspensjonen med 80 mikroliter 1X PBS CMF og tell cellene ved hjelp av et manuelt tellekammer. Frø endotelcellene med en tetthet på 71.500 celler per centimeter kvadrat på de forhåndskodede innsatsfiltrene i et volum på 500 mikroliter varm ECM. Bytt ut astrocyttmediet med 1,5 milliliter varm ECM per brønn.
Overfør deretter de seedede innsatsfiltrene til brønnene som inneholder astrocytter. Plasser trikulturcellesystemene i en fuktet inkubator ved 37 grader Celsius under 5% karbondioksid og 21% oksygen. Fjern mediet forsiktig fra det øvre og nedre rommet ved hjelp av en glasspipette koblet til et aspirasjonssystem.
Bytt mediet med varm ECM i et volum på 500 mikroliter i det øvre rommet og 1,5 milliliter i underrommet. Forny mediet annenhver dag frem til dag seks ved å gjenta samme prosedyre. Til slutt sette cellene tilbake i fuktet inkubator ved 37 grader Celsius under 5% karbondioksid og 21% oksygen.
Immunocytokjemi data bekreftet uttrykket av konvensjonelle markører som blodplate avledet vekstfaktor reseptor beta og Desmine for pericytter, og glial fibrillær surt protein for astrocytter. Derfor, etter seks dager med kultur med pericytter og astrocytter, viser monolaget av hjernelignende endotelceller eller BLAC-er visualisert med den tilhørende kryssfargingen av Ve-Cadherin en kontinuerlig lokalisering av TJ-proteiner CLD5 og Z-01 ved cellegrensene. Paracellulær permeabilitet av BLECS til fluorescerende BBB-integritetsmarkører, natriumfluorescein og FITC dextran er vist her.
R123 intracellulær akkumulering i BLEC viste en signifikant økning i tilstedeværelsen av efflukspumpehemmeren Elacridar sammenlignet med kontrolltilstanden med fravær. Dette indikerer tilstedeværelsen av aktive efflukspumpemolekyler, nemlig P-glykoprotein og brystkreftresistensprotein eller BCRP i BLECs. Genuttrykk av tette kryssproteiner, transportører og store molekylreseptorer normalisert ved ekspresjon av RPLP0 er vist her.
Her tilsvarer verdiene større enn en høyere genuttrykk i trippelkulturmodellen. Den røde linjen tilsvarer en verdi på en der uttrykksnivået til de to modellene er ekvivalent. Det representative bildet viser proteinnivået av tette kryssproteiner, transportører, i store molekylreseptorer normalisert ved ekspresjon av betaaktin.
Transporten av fluorescerende merkede NIPAM-baserte nøytrale polymere nanogeler ble evaluert. På tidspunktet null ble polymere nanogeler plassert i luminalrommet i en konsentrasjon på 0, 1 milligram per milliliter. Etter 24 timers inkubasjon ble 5,82% av de polymere nanogelene funnet i det abluminale rommet som viste deres evne til å krysse BLAC-ene.
Riktig belegg og såing av pericytter på det tilbakestilte filteret er avgjørende. Viktig er vedlikehold av strukturer sterilitet og integritet for å unngå forurensning av cellekultursystemet.
Denne protokollen beskriver en metode for å etablere en human blod-hjernebarriere (BBB) in vitro-modell . Endotelceller og pericytter blir sådd på hver side av et innsatsfilter (blodrom), og astrocytter blir sådd i bunnbrønnen (hjernekammeret). Den karakteriserte modellen ble brukt til nanopartikler transporteksperimenter.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved