Um sistema celular de cultura tripla modelando a barreira hematoencefálica humana

A entrega de drogas ao cérebro permaneceu um desafio. O desenvolvimento de grandes painéis de novos nanomateriais para melhorar a entrega ao cérebro destaca a necessidade de um microssistema in vitro real para prever a penetração cerebral no quadro de ensaios pré-clínicos. A principal vantagem desta técnica é congelar os reais celulares de dor livre da barreira hematoencefálica dentro do mesmo sistema, permitindo as comunicações celulares necessárias para a indução do fenótipo da barreira hematoencefálica.

Além disso, cada tipo de célula pode ser isolado separadamente para posterior análise molecular. O modelo pode ser usado para uma extensa gama de experimentos em condições saudáveis e patológicas e representa uma ferramenta valiosa para avaliações pré-clínicas de transportes de moléculas e partículas, bem como tráfico inter e intracelular. Demonstrando o procedimento estarão a Dra. Clemence Deligne e a Dra. Eleonora Rizzi.

Comece codificando os poços com 500 microlitros de dois microgramas por centímetro quadrado de solução de poli-L-lisina. Incubar durante a noite ou durante um mínimo de uma hora a 37 graus Celsius e remover cuidadosamente a solução de poli-L-lisina com uma pipeta de vidro ligada a um sistema de aspiração. Em seguida, enxágue duas vezes com água estéril.

Para coletar os astrócitos, primeiro lave os astrócitos uma vez com 10 mililitros de 1X PBS CMF quentes. Incubá-los por três minutos com 10 mililitros de solução quente de EDTA de 20% de tripsina a 37 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono e 21% de oxigênio. Separar mecanicamente as células do balão e transferir a suspensão para um tubo cónico contendo cinco mililitros de FCS quente não diluído.

Centrifugar a suspensão a 190 vezes G durante cinco minutos a 20 graus Celsius. Ressuspeite o pellet celular em cinco mililitros de meio astrócitos quente, em seguida, dilua 20 microlitros da suspensão celular com 80 microlitros de 1X PBS CMF. Conte as células usando uma câmara de contagem manual sob um microscópio.

Placa em torno de 40.000 células por centímetro quadrado em cada poço pré-codificado de poli-L-lisina em um volume de 1,5 mililitros de meio astrócitos quentes. Coloque os filtros de inserção revertidos na periferia de um prato coberto de 25 milímetros de altura e adicione 250 microlitros de solução de colágeno tipo um aos filtros de inserção. Incubar à temperatura ambiente durante uma hora.

Em seguida, remova cuidadosamente a solução de colágeno tipo um com uma pipeta de vidro conectada a um sistema de aspiração. Lave duas vezes com 250 microlitros de DMEM de glicose elevada à temperatura ambiente e remova cuidadosamente toda a solução dos filtros de inserção. Lave os pericitos duas vezes com 10 mililitros de 1X PBS CMF morno e incube as células com dois mililitros de tripsina quente.

Observe as células sob o microscópio para monitorar a ação da tripsina. Quando as células começarem a se desprender, remova a tripsina, adicione cinco mililitros de meio basal de células endoteliais quentes ou ECM às células e inicie a dissociação mecânica. Diluir 20 microlitros da suspensão celular com 80 microlitros de 1X PBS CMF e contar as células usando uma câmara de contagem manual sob um microscópio, como mostrado anteriormente.

Semente 44, 500 células por centímetro quadrado nos filtros de inserção reversos pré-codificados em um volume de 250 microlitros. Mantenha os filtros de inserção em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius por três horas sob 5% de dióxido de carbono e 21% de oxigênio. Use pinças estéreis para reverter cuidadosamente os filtros de inserção em uma placa de 12 poços contendo 1,5 mililitros de ECM quente por poço.

Os filtros de inserção agora estão prontos para serem revestidos do outro lado. Revestir o lado superior e os filtros de inserção com 500 microlitros de hidrogel à base de matriz extracelular. Coloque os filtros de inserção em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono e 21% de oxigênio por uma hora.

Lave-os uma vez com 500 microlitros de DMEM de glicose elevada à temperatura ambiente. Lave a cultura de células endoteliais uma vez com 10 mililitros de 1X PBS CMF quente e incube as células com dois mililitros de tripsina quente. Remova a tripsina quando as células começarem a se desprender, adicione cinco mililitros de ECM quente e inicie a dissociação mecânica.

Diluir 20 microlitros da suspensão celular com 80 microlitros de 1X PBS CMF e contar as células usando uma câmara de contagem manual. Semeia as células endoteliais a uma densidade de 71.500 células por centímetro quadrado nos filtros de inserção pré-codificados em um volume de 500 microlitros de ECM quente. Substitua o meio astrócitos por 1,5 mililitros de ECM quente por poço.

Em seguida, transfira os filtros de inserção semeados para os poços que contêm os astrócitos. Coloque os sistemas de células de tricultura em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono e 21% de oxigênio. Retire o meio cuidadosamente do compartimento superior e inferior usando uma pipeta de vidro conectada a um sistema de aspiração.

Substitua o meio por ECM quente em um volume de 500 microlitros no compartimento superior e 1,5 mililitros no compartimento inferior. Renove o meio a cada dois dias até o sexto dia, repetindo o mesmo procedimento. Finalmente, coloque as células de volta na incubadora umidificada a 37 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono e 21% de oxigênio.

Dados imunocitoquímicos confirmaram a expressão de marcadores convencionais, como o receptor beta do fator de crescimento derivado de plaquetas e Desmine para pericitos, e proteína glial fibrilar ácida para astrócitos. Assim, após seis dias de cultura com os pericitos e astrócitos, a monocamada de células endoteliais semelhantes ao cérebro ou BLECs visualizadas com a coloração da junção aderente de Ve-Cadherin exibe uma localização contínua das proteínas TJ CLD5 e Z-01 nas bordas celulares. A permeabilidade paracelular do BLECS a marcadores fluorescentes de integridade BBB, fluoresceína sódica e dextrano FITC é mostrada aqui.

O acúmulo intracelular de R123 em BLECs exibiu um aumento significativo na presença do inibidor da bomba de efluxo Elacridar em comparação com a condição de controle com sua ausência. Isso indica a presença de moléculas ativas da bomba de efluxo ou seja, glicoproteína P e proteína de resistência ao câncer de mama ou BCRP nos BLEC's. A expressão gênica de proteínas de junção apertada, transportadores e receptores de moléculas grandes normalizados pela expressão de RPLP0 é mostrada aqui.

Aqui, os valores maiores que um correspondem a maior expressão gênica no modelo de cultura tripla. A linha vermelha corresponde a um valor de um em que o nível de expressão dos dois modelos é equivalente. A imagem representativa mostra o nível proteico de proteínas de junção apertada, transportadores, em receptores de moléculas grandes normalizados pela expressão de beta-actina.

O transporte de nanogéis poliméricos neutros à base de NIPAM marcados fluorescentemente foi avaliado. No tempo zero, nanogéis poliméricos foram colocados no compartimento luminal a uma concentração de 0,1 miligramas por mililitro. Após 24 horas de incubação, 5,82% dos nanogéis poliméricos foram encontrados no compartimento abluminal comprovando sua capacidade de atravessar os BLECs.

O revestimento e a semeadura corretos dos pericitos no filtro revertido são fundamentais. Importante é a manutenção da esterilidade e integridade das estruturas para evitar a contaminação do sistema de cultura celular.