Läkemedelsleverans till hjärnan förblev en utmaning. Utvecklingen av stora paneler av nya nanomaterial för att förbättra leveransen till hjärnan belyser behovet av verkliga in vitro-mikrosystem för att förutsäga hjärnans penetration inom ramen för prekliniska analyser. Den största fördelen med denna teknik är att isa de fria smärtcellulära utfallen i blodhjärnbarriären inuti samma system som möjliggör cellcellkommunikation som krävs för induktion av blodhjärnbarriärfenotypen.
Dessutom kan varje celltyp isoleras separat för vidare molekylär analys. Modellen kan användas för ett omfattande spektrum av experiment vid friska och patologiska tillstånd och utgör ett värdefullt verktyg för prekliniska bedömningar av molekyl- och partikeltransporter, samt inter- och intracellulär handel. Demonstrerar proceduren kommer att vara Dr.Clemence Deligne och Dr.Eleonora Rizzi.
Börja med att koda brunnarna med 500 mikroliter två mikrogram per kvadratcentimeter Poly-L-lysinlösning. Inkubera över natten eller i minst en timme vid 37 grader Celsius och ta bort Poly-L-lysinlösningen försiktigt med en glaspipett ansluten till ett aspireringssystem. Skölj sedan två gånger med sterilt vatten.
För att samla astrocyterna, tvätta först astrocyterna en gång med 10 ml varm 1X PBS CMF. Inkubera dem i tre minuter med 10 ml varm 20% Trypsin EDTA-lösning vid 37 grader Celsius under 5% koldioxid och 21% syre. Lossa cellerna mekaniskt från kolven och överför suspensionen till ett koniskt rör som innehåller fem ml varm, icke-utspädd FCS.
Centrifugera suspensionen vid 190 gånger G i fem minuter vid 20 grader Celsius. Återsuspendera cellpelleten i fem milliliter varmt astrocytmedium och späd sedan 20 mikroliter av cellsuspensionen med 80 mikroliter 1X PBS CMF. Räkna cellerna med en manuell räknekammare under ett mikroskop.
Platta runt 40, 000 celler per kvadratcentimeter i varje Poly-L-lysin förkodad väl i en volym av 1,5 ml varmt astrocytmedium. Placera de återställda insatsfiltren i periferin av en täckt 25 millimeter hög skål och tillsätt 250 mikroliter kollagen typ en lösning till insatsfiltren. Inkubera vid rumstemperatur i en timme.
Ta sedan försiktigt bort kollagentyp en lösning med en glaspipett ansluten till ett aspireringssystem. Tvätta två gånger med 250 mikroliter DMEM hög glukos vid rumstemperatur och ta försiktigt bort all lösning från insatsfiltren. Tvätta pericyterna två gånger med 10 ml varm 1X PBS CMF och inkubera cellerna med två milliliter varmt trypsin.
Observera cellerna under mikroskopet för att övervaka trypsins verkan. När cellerna börjar lossna, ta bort trypsinet, tillsätt sedan fem milliliter varmt endotelcellbasalmedium eller ECM till cellerna och starta mekanisk dissociation. Späd 20 mikroliter av cellsuspensionen med 80 mikroliter 1X PBS CMF och räkna cellerna med hjälp av en manuell räknekammare under ett mikroskop som visats tidigare.
Frö 44 500 celler per centimeter kvadrat på de förkodade återställda insatsfiltren i en volym av 250 mikroliter. Håll insatsfiltren i en fuktad inkubator vid 37 grader Celsius i tre timmar under 5% koldioxid och 21% syre. Använd steril pincett för att försiktigt återställa insatsfiltren till en 12-brunnsplatta som innehåller 1,5 ml varm ECM per brunn.
Insatsfiltren är nu redo att beläggas på andra sidan. Täck ovansidan och insatsfiltren med 500 mikroliter extracellulär matrisbaserad hydrogel. Placera insatsfiltren i en fuktad inkubator vid 37 grader Celsius under 5% koldioxid och 21% syre i en timme.
Tvätta dem en gång med 500 mikroliter DMEM hög glukos vid rumstemperatur. Tvätta endotelcellkulturen en gång med 10 ml varm 1X PBS CMF och inkubera cellerna med två milliliter varmt trypsin. Ta bort trypsinet när cellerna börjar lossna, tillsätt sedan fem milliliter varm ECM och starta mekanisk dissociation.
Späd 20 mikroliter av cellsuspensionen med 80 mikroliter 1X PBS CMF och räkna cellerna med en manuell räknekammare. Frö endotelcellerna med en densitet av 71 500 celler per centimeter kvadrat på de förkodade insatsfiltren i en volym av 500 mikroliter varm ECM. Byt ut astrocytmediet med 1,5 ml varm ECM per brunn.
Överför sedan de sådda insatsfiltren till brunnarna som innehåller astrocyterna. Placera trekulturcellsystemen i en fuktad inkubator vid 37 grader Celsius under 5% koldioxid och 21% syre. Ta försiktigt av mediet från det övre och nedre facket med en glaspipett ansluten till ett aspirationssystem.
Byt ut mediet med varm ECM i en volym på 500 mikroliter i det övre facket och 1,5 ml i bottenfacket. Förnya mediet varannan dag fram till dag sex genom att upprepa samma procedur. Slutligen sätta tillbaka cellerna i fuktad inkubator vid 37 grader Celsius under 5% koldioxid och 21% syre.
Immunocytokemidata bekräftade uttrycket av konventionella markörer såsom trombocythärledd tillväxtfaktorreceptor beta och Desmine för pericyter och glialfibrillärt surt protein för astrocyter. Därför, efter sex dagars odling med pericyterna och astrocyterna, visar monolagret av hjärnliknande endotelceller eller BLEC visualiserade med den vidhäftande korsningsfärgningen av Ve-Cadherin en kontinuerlig lokalisering av TJ-proteiner CLD5 och Z-01 vid cellgränserna. Paracellulär permeabilitet av BLECS till fluorescerande BBB-integritetsmarkörer, natriumfluorescein och FITC-dextran visas här.
R123 intracellulär ackumulering i BLEC uppvisade en signifikant ökning av närvaron av effluxpumphämmaren Elacridar jämfört med kontrolltillståndet med dess frånvaro. Detta indikerar närvaron av aktiva effluxpumpmolekyler, nämligen P-glykoprotein och bröstcancerresistensprotein eller BCRP i BLEC: erna. Genuttryck av tighta korsningsproteiner, transportörer och stora molekylreceptorer normaliserade genom uttrycket av RPLP0 visas här.
Här motsvarar värdena större än ett högre genuttryck i trippelkulturmodellen. Den röda linjen motsvarar ett värde på en där uttrycksnivån för de två modellerna är ekvivalent. Den representativa bilden visar proteinnivån hos tighta korsningsproteiner, transportörer, i stora molekylreceptorer normaliserade genom uttrycket av beta-aktin.
Transporten av fluorescerande märkta NIPAM-baserade neutrala polymera nanogeler utvärderades. Vid tiden noll placerades polymera nanogeler i det luminala facket i en koncentration av 0, 1 milligram per milliliter. Efter 24 timmars inkubation hittades 5,82% av de polymera nanogelerna i det abluminala facket vilket bevisade deras förmåga att korsa BLC: erna.
Den korrekta beläggningen och sådden av pericyterna på det återställda filtret är avgörande. Viktigt är upprätthållandet av strukturernas sterilitet och integritet för att undvika kontaminering av cellodlingssystemet.