Name: monitoring gut acidification in the adult drosophila intestine
Uploaded: 2021-10-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine at JoVE.com

يعترف المؤلفون بأن الدعم للعمل في مختبر المؤلف يتم توفيره من خلال جائزة HHMI College Scholar Award وصناديق بدء التشغيل من معهد أبحاث الأطفال في مركز UT Southwestern الطبي.

ملاحظة: تم استخدام خط المختبر القياسي أوريغون R كعنصر تحكم WT. تم تربية جميع الذباب على وسط دبس الذرة القياسي (الذي يحتوي على دبس السكر ، والأجار ، والخميرة ، ودقيق الذرة ، و tegosept ، وحمض البروبيونيك ، والماء) في درجة حرارة الغرفة مع إيقاع الساعة البيولوجية الفاتحة / الداكنة 12/12 ساعة.
<p class="jove_...

<ol>
	<li>Hollander, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+composition+and+mechanism+of+formation+of+gastric+acid+secretion.">The composition and mechanism of formation of gastric acid secretion.</a> Science. 110 (2846), 57-63 (1949).</li><li>Forte, J. G., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+recycling+of+the+gastric+parietal+cell+H,+K-ATPase.">Apical recycling of the gastric parietal cell H, K-ATPase.</a> Annual Review of Physiology. 72, 273-296 (2010).</li><li>Samuelson, L. C., Hinkle, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+gastric+acid+secretion+through+analysis+of+genetically+engineered+mice.">Insights into the regulation of gastric acid secretion through analysis of genetically engineered mice.</a> Annual Review of Physiology. 65, 383-400 (2003).</li><li>Yao, X., Forte, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+acid+secretion+by+the+parietal+cell.">Cell biology of acid secretion by the parietal cell.</a> Annual Review of Physiology. 65, 103-131 (2003).</li><li>Driver, I., Ohlstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+regional+intestinal+stem+cell+identity+during+Drosophila+metamorphosis.">Specification of regional intestinal stem cell identity during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 141 (9), 1848-1856 (2014).</li><li>Overend, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+and+functional+significance+of+acid+generation+in+the+Drosophila+midgut.">Molecular mechanism and functional significance of acid generation in the Drosophila midgut.</a> Scientific Reports. 6, 27242 (2016).</li><li>Shanbhag, S., Tripathi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+ultrastructure+and+cellular+mechanisms+of+acid+and+base+transport+in+the+Drosophila+midgut.">Epithelial ultrastructure and cellular mechanisms of acid and base transport in the Drosophila midgut.</a> Journal of Experimental Biology. 212, 1731-1744 (2009).</li><li>Dubreuil, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+cells+and+stomach+acid+secretion+in+the+Drosophila+midgut.">Copper cells and stomach acid secretion in the Drosophila midgut.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (5), 745-752 (2004).</li><li>Martorell, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+mechanisms+of+tumorigenesis+in+the+Drosophila+adult+midgut.">Conserved mechanisms of tumorigenesis in the Drosophila adult midgut.</a> PLoS ONE. 9 (2), 88413 (2014).</li><li>Strand, M., Micchelli, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+control+of+Drosophila+gut+stem+cell+proliferation:+EGF+establishes+GSSC+proliferative+set+point+&amp;+controls+emergence+from+quiescence.">Regional control of Drosophila gut stem cell proliferation: EGF establishes GSSC proliferative set point &amp; controls emergence from quiescence.</a> PLoS One. 8 (11), 80608 (2013).</li><li>Storelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+perpetuates+nutritional+mutualism+by+promoting+the+fitness+of+its+intestinal+symbiont+Lactobacillus+plantarum.">Drosophila perpetuates nutritional mutualism by promoting the fitness of its intestinal symbiont Lactobacillus plantarum.</a> Cell Metabolism. 27 (2), 362-377 (2018).</li><li>Abu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communicating+the+nutritional+value+of+sugar+in+Drosophila.">Communicating the nutritional value of sugar in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (12), 2829-2838 (2018).</li><li>Blecker, U., Gold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastritis+and+ulcer+disease+in+childhood.">Gastritis and ulcer disease in childhood.</a> European Journal of Pediatrics. 158 (7), 541-546 (1999).</li></ol>

الخطوة الحاسمة في هذا البروتوكول هي التشريح السليم للأمعاء لتصور CCR للنمط الظاهري للتحمض. يقتصر الحمض المنبعث من الخلايا النحاسية على CCR عندما تكون الأمعاء سليمة. ومع ذلك ، أثناء التشريح ، يمكن أن يؤدي التسرب الناجم عن تمزق الأمعاء إلى انتشار الحمض من CCR ويؤدي إلى تسجيل الأمعاء عن طريق الخط...

في أمعاء الحشرات ، تشترك الخلايا النحاسية في أوجه تشابه خلوية ووظيفية مع الخلايا الجدارية المعدية المنتجة للحمض (المعروفة أيضا باسم oxyntic) في معدة الثدييات. هذه المجموعة من الخلايا تطلق الحمض في تجويف الأمعاء. يتم الحفاظ على وظيفة إفراز الحمض والتشريح تطوريا. المكونات الرئيسية للحمض المفرغ هي حمض الهيدروكلوريك وكلوريد البوتاسيوم. تعتمد الآلية الكيميائية لتكوين الحمض في الخلايا على الأنهيدراز الكربوني. يولد هذا الإنزيم أيون بيكربونات من CO2 والماء ، والذي يحرر أيون الهيدروكسيل الذي يتم تفريغه بعد ذلك في التجويف من خلال مضخة بروتون مقابل البوتاسيوم. يتم نقل أيونات الكلوريد والبوتاسيوم إلى التجويف عن طريق قنوات التوصيل مما يؤدي إلى تكوين حمض الهيدروكلوريك وكلوريد البوتاسيوم ، المكون الرئيسي لعصير المعدة 1،2،3،4.
على الرغم من أن آليات تكوين الحمض مفهومة جيدا ، إلا أنه لا يعرف الكثير عن الآليات الفسيولوجية التي تنظم إفراز الحمض. الهدف من تطوير هذه الطريقة هو المساعدة في تحديد المسارات الخلوية التي تنسق تكوين الحمض وإفرازه بشكل أفضل وتحديد دور الحمض في التوسط في فسيولوجيا الأمعاء والتوازن. الأساس المنطقي وراء تطوير واستخدام هذه التقنية هو توفير طريقة متسقة وموثوقة لدراسة عملية تحمض الأمعاء في ذبابة الفاكهة والكائنات الحية غير النموذجية. على الرغم من وجود بروتوكول قياسي لتحديد تحمض ذبابة الفاكهة في منتصف الأمعاء حاليا2,5,6 ، فقد لوحظ تباين كبير في مدى التحمض في الذباب من النوع البري (WT) أثناء استخدام هذا البروتوكول لدراسة وظيفة الخلايا النحاسية. لفهم أساس هذا التباين الملحوظ والحصول على نتائج متسقة ، تم تحسين العديد من جوانب البروتوكول القياسي كما هو موضح أدناه.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>B0126</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. simulans</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. erecta</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. pseudoobscura</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. mojavensis</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Inox Biology</td>
			<td></td>
			<td>Catalog# 11252-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fuji</td>
			<td>Fuji</td>
			<td></td>
			<td>Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Catalog#16005-108</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim wipes Tissue</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope and camera</td>
			<td>Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon R</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock</td>
			<td></td>
			<td>(https://bdsc.indiana.edu/ # 2376)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Catalog #FB0875713A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td></td>
			<td>Catalog # SH30258.01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus SZ51</td>
			<td></td>
			<td>Visual magnification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring gut acidification in the adult drosophila intestine

تتكون ذبابة الفاكهة midgut من مناطق متعددة ، يتكون كل منها من خلايا تقوم بوظائف فسيولوجية فريدة مطلوبة لحسن سير العمل في الأمعاء. إحدى هذه المناطق ، منطقة الخلايا النحاسية (CCR) ، موضعية في منتصف الأمعاء الوسطى وتتكون ، جزئيا ، من مجموعة من الخلايا المعروفة باسم الخلايا النحاسية. تشارك الخلايا النحاسية في إفراز حمض المعدة ، وهي عملية محفوظة تطوريا ودورها الدقيق غير مفهوم بشكل جيد. تصف هذه الورقة التحسينات في البروتوكول الحالي المستخدم لفحص تحمض أمعاء ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر البالغة وتوضح أنه يمكن استخدامه على أنواع أخرى من الذباب. على وجه الخصوص ، توضح هذه الورقة أن تحمض الأمعاء يعتمد على الحالة الغذائية للذبابة ويقدم بروتوكولا يعتمد على هذه النتيجة الجديدة. بشكل عام ، يوضح هذا البروتوكول الفائدة المحتملة لدراسة خلايا ذبابة الفاكهة النحاسية للكشف عن المبادئ العامة الكامنة وراء آليات تحمض الأمعاء.

لقد جوعنا ذباب أوريغون R لأكثر من 20 ساعة ثم أطعمناهم طعاما مكملا ب BPB (2٪) لمدة 12 ساعة تقريبا ، كما هو موضح سابقا7،8،9،10،11. بروموفينول الأزرق (BPB) هو صبغة استشعار درجة الحموضة. يتغير من الأصفر عند درجة الحم?...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine at JoVE.com

Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine

هنا ، نقدم بروتوكولا موحدا لمراقبة تحمض الأمعاء في ذبابة الفاكهة مع الإخراج الأمثل. نستخدم هذا البروتوكول أولا لمراقبة تحمض الأمعاء في ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر ثم نظهر استخدامه في أنواع ذبابة الفاكهة غير النموذجية.

مراقبة تحمض الأمعاء في أمعاء ذبابة الفاكهة البالغة

The fruit fly midgut consists of multiple regions, each of which is composed of cells that carry out unique physiological functions required for the ...

هذا هو البروتوكول الأسرع والصحيح لمراقبة تحمض الأمعاء ذبابة الفاكهة مع نتائج قوية وأصيلة. ستساعد هذه الطريقة في تحديد دور تحمض الأمعاء في الكائنات الحية المتعددة. وهذه الظاهرة هي بساطة هذه التقنية هي الميزة الرئيسية.على هذا النحو ، يمكن استخدامه للكائنات الحية غير النموذجية. يمكن لهذه الطريقة مراقبة إطلاق الحمض للعديد من الأنظمة بما في ذلك خطوط الخلايا و 3D على الثقافات الحية. هذه التقنية بسيطة بأقل جهد ممكن.يجب إعداد الطعام الذي يحتوي على بروموفينول الأزرق طازجا. بالإضافة إلى ذلك ، في حين لا ينبغي أن تمتد تشريح الأمعاء. ابدأ في الترتيب لفحص مراقبة تحمض الأمعاء مع إعداد طعام الذبابة مع استشعار درجة الحموضة بروموفينول الأزرق أو صبغة BPB.للقيام بذلك ، قم بإذابة طعام الذبابة في الميكروويف واتركه يبرد حتى يصبح فاترا. أضف ملليلتر واحد من 4٪ BPB إلى ملليلتر واحد من الطعام الفاتر مع بئر الخلط. باستخدام ماصة ، أضف طعام الذبابة الذي يحتوي على BPB إلى نقطة واحدة تبلغ حوالي 200 ميكرولتر في وسط طبق بتري.بعد ذلك ، اجمع ذبابة الفاكهة غير البكر من صفر إلى يومين من ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر ، واسمح للذباب بالتعافي على طعام وجبة الذرة القياسي. قبل التجربة، تجويع الذباب لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة في قارورة تحتوي على مناديل مخبرية منقوعة بحوالي ملليلترين من الماء منزوع الأيونات. انقل الذباب الجائع إلى طبق بتري يحتوي على نقاط مفردة من طعام الذباب الطازج ، مع استكماله بنسبة 2٪ BPB ، للسماح للذباب بالعلف لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة أثناء تعرضه للضوء.بعد أربع ساعات من جمع الذباب ، ثم المضي قدما في عزل أحشاء الذباب المخدر جراحيا في 1X PBS مع ملقط تحت المجهر ستيريو. احسب عدد الذباب الذي يظهر قوة BPB في الأحشاء ، واحسب النسبة المئوية باستخدام المعادلة. بعد التشريح ، قم بتركيب العينات في PBS على شريحة زجاجية ووضع الشريحة المعدة تحت المجهر.ثم اضبط التركيز باستخدام IPS. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بإيقاف تشغيل IPS لفتح الغالق للكاميرا. بعد تشريح الأمعاء ، تم العثور على بعض ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر الإناث لإنتاج حمض كما هو موضح في اللون الأصفر في CCR من الأمعاء.في حين أن أمعاء بعض الذباب كانت زرقاء مما يشير إلى فشل الذباب في تحمض أحشائه. في غضون 30 دقيقة ، قام ما يقرب من 20٪ من الذباب بتحمض الأمعاء. بعد ساعة ، أظهرت 40٪ من أمعاء الأمعاء تحمض ، بينما بعد ساعتين إلى ثلاث ساعات من التغذية ، زادت نسبة الأمعاء المحمضة إلى 60 إلى 70٪ تم تحمض ما يقرب من 90 إلى 95٪ من الأمعاء عندما تم تغذية الذباب لمدة أربع ساعات.لم يلاحظ أي فرق في تحمض الأمعاء لظروفين مختلفتين لدرجة الحرارة. تم تقييم كفاءة بروتوكول تحمض الأمعاء في مختلف أنواع ذبابة الفاكهة. أظهرت جميع الأنواع التي تم اختبارها تحمض الأمعاء القوي ، مما يشير إلى أنه يمكن تطبيق البروتوكول على الكائنات الحية الأخرى.أهم شيء يجب تذكره ، هو وضع النجم يطير في صفيحة بتري مع الخميرة وبروموفينول الأزرق لمدة أربع ساعات. ستساعد هذه التقنية على فهم البيولوجيا الأساسية والمسار الخلوي المتضمن في تحمض الأمعاء. يجب أن يساعد أيضا في تحديد هدف الدواء لإنشاء الأمراض المتعلقة بتحمض الأمعاء.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine

Unit 1

Membrane Transport and Active Transporters

SCIENTISTS IN ACTION

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite Zootermopsis Angusticollis and Visualizing Gut Microbes

استخراج الحمض النووي من الميكروبات غوت من النمل الأبيض (Zootermopsis Angusticollis) وتصور الميكروبات غوت

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and ...

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

تسجيلات كاملة من خلية دماغ ذبابة الفاكهة الكبار

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

عالية الدقة تعقب الفيديو للتنقل في الكبار ذبابة الفاكهة السوداء البطن

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

رصد وظيفة القلب في اليرقات ذبابة الفاكهة السوداء البطن للدراسات فسيولوجية

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

تشريح Oenocytes من الكبار ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

حقن الانسولين واستخراج الدملمف لقياس حساسية الانسولين في الكبار ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

على المدى الطويل اختبار السمية المهلكة مع القشريات الأرتيميا franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

والطماطم / GFP-FLP / FRT الطريقة للتصوير لايف من الفسيفساء الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; خلايا مستقبلة للضوء

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging اسماك الزرد الكبار

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...