Name: monitoring gut acidification in the adult drosophila intestine
Uploaded: 2021-10-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine at JoVE.com

Forfatterne anerkender, at støtte til arbejde i forfatterens laboratorium ydes af en HHMI Faculty Scholar Award og opstartsmidler fra Children's Research Institute ved UT Southwestern Medical Center.

BEMÆRK: Standardlaboratorielinjen Oregon R blev brugt som WT-kontrol. Alle fluer blev opdrættet på standard majsmelasse-melasse medium (indeholdende melasse, agar, gær, majsmel, tegosept, propionsyre og vand) ved stuetemperatur med 12/12 timers lys / mørk døgnrytme.
1. Forberedelse til analysen
<ol><li>Saml kvindelige fluer (0-2 dage gamle, ikke-jomfruelige) under CO2-anæstesi og lad dem komme sig på standard majsmel mad i mindst 3 dage før forsøg.</li>
...

<ol>
	<li>Hollander, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+composition+and+mechanism+of+formation+of+gastric+acid+secretion.">The composition and mechanism of formation of gastric acid secretion.</a> Science. 110 (2846), 57-63 (1949).</li><li>Forte, J. G., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+recycling+of+the+gastric+parietal+cell+H,+K-ATPase.">Apical recycling of the gastric parietal cell H, K-ATPase.</a> Annual Review of Physiology. 72, 273-296 (2010).</li><li>Samuelson, L. C., Hinkle, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+gastric+acid+secretion+through+analysis+of+genetically+engineered+mice.">Insights into the regulation of gastric acid secretion through analysis of genetically engineered mice.</a> Annual Review of Physiology. 65, 383-400 (2003).</li><li>Yao, X., Forte, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+acid+secretion+by+the+parietal+cell.">Cell biology of acid secretion by the parietal cell.</a> Annual Review of Physiology. 65, 103-131 (2003).</li><li>Driver, I., Ohlstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+regional+intestinal+stem+cell+identity+during+Drosophila+metamorphosis.">Specification of regional intestinal stem cell identity during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 141 (9), 1848-1856 (2014).</li><li>Overend, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+and+functional+significance+of+acid+generation+in+the+Drosophila+midgut.">Molecular mechanism and functional significance of acid generation in the Drosophila midgut.</a> Scientific Reports. 6, 27242 (2016).</li><li>Shanbhag, S., Tripathi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+ultrastructure+and+cellular+mechanisms+of+acid+and+base+transport+in+the+Drosophila+midgut.">Epithelial ultrastructure and cellular mechanisms of acid and base transport in the Drosophila midgut.</a> Journal of Experimental Biology. 212, 1731-1744 (2009).</li><li>Dubreuil, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+cells+and+stomach+acid+secretion+in+the+Drosophila+midgut.">Copper cells and stomach acid secretion in the Drosophila midgut.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (5), 745-752 (2004).</li><li>Martorell, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+mechanisms+of+tumorigenesis+in+the+Drosophila+adult+midgut.">Conserved mechanisms of tumorigenesis in the Drosophila adult midgut.</a> PLoS ONE. 9 (2), 88413 (2014).</li><li>Strand, M., Micchelli, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+control+of+Drosophila+gut+stem+cell+proliferation:+EGF+establishes+GSSC+proliferative+set+point+&amp;+controls+emergence+from+quiescence.">Regional control of Drosophila gut stem cell proliferation: EGF establishes GSSC proliferative set point &amp; controls emergence from quiescence.</a> PLoS One. 8 (11), 80608 (2013).</li><li>Storelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+perpetuates+nutritional+mutualism+by+promoting+the+fitness+of+its+intestinal+symbiont+Lactobacillus+plantarum.">Drosophila perpetuates nutritional mutualism by promoting the fitness of its intestinal symbiont Lactobacillus plantarum.</a> Cell Metabolism. 27 (2), 362-377 (2018).</li><li>Abu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communicating+the+nutritional+value+of+sugar+in+Drosophila.">Communicating the nutritional value of sugar in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (12), 2829-2838 (2018).</li><li>Blecker, U., Gold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastritis+and+ulcer+disease+in+childhood.">Gastritis and ulcer disease in childhood.</a> European Journal of Pediatrics. 158 (7), 541-546 (1999).</li></ol>

Et kritisk trin i denne protokol er den korrekte dissektion af tarmen for at visualisere CCR for forsuringsfænotypen. Syren frigivet fra kobbercellerne er begrænset til CCR, når tarmen er intakt. Under dissektion kan lækage forårsaget af brud på tarmen imidlertid føre til diffusion af syre fra CCR og resultere i en tarm, der fejlagtigt scores som en negativ til forsuring. Derudover falmer den gule farve, der indikerer forsuring, inden for 5-10 minutter efter dissektion, hvilket understreger vigtigheden af at score...

I insekttarmen deler kobberceller cellulære og funktionelle ligheder med de syreproducerende gastriske parietale celler (også kendt som oxyntiske) i pattedyrs mave. Denne gruppe af celler frigiver syre i tarmens lumen. Funktionen af syresekretion og anatomi bevares evolutionært. Hovedkomponenterne i den udledte syre er saltsyre og kaliumchlorid. Den kemiske mekanisme for syredannelse i cellerne afhænger af kulsyreanhydrase. Dette enzym genererer en bicarbonation fra CO2 og vand, som frigiver en hydroxylion, der derefter udledes i lumen gennem en protonpumpe i bytte for kalium. Chlorid- og kaliumioner transporteres ind i lumen ved hjælp af konduktanskanaler, hvilket resulterer i dannelse af saltsyre og kaliumchlorid, hovedbestanddelen af mavesaft1,2,3,4.
Selvom mekanismerne for syredannelse er godt forstået, er der meget mindre kendt om de fysiologiske mekanismer, der regulerer syresekretion. Målet med at udvikle denne metode er at hjælpe med bedre at afgrænse de cellulære veje, der koordinerer syredannelse og sekretion og bestemme syrens rolle i formidlen af tarmfysiologi og homeostase. Rationalet bag udviklingen og anvendelsen af denne teknik er at tilvejebringe en konsekvent og pålidelig metode til at studere processen med tarmforsuring i Drosophila og ikke-modelorganismer. Selvom der i øjeblikket findes en standardprotokol til bestemmelse af Drosophila midgut forsuring2,5,6, blev der observeret signifikant variabilitet i omfanget af forsuring i vildtypefluer (WT), mens denne protokol blev brugt til at studere kobbercellefunktion. For at forstå grundlaget for denne observerede variabilitet og opnå konsistente resultater blev flere aspekter af standardprotokollen optimeret som beskrevet nedenfor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>B0126</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. simulans</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. erecta</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. pseudoobscura</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. mojavensis</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Inox Biology</td>
			<td></td>
			<td>Catalog# 11252-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fuji</td>
			<td>Fuji</td>
			<td></td>
			<td>Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Catalog#16005-108</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim wipes Tissue</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope and camera</td>
			<td>Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon R</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock</td>
			<td></td>
			<td>(https://bdsc.indiana.edu/ # 2376)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Catalog #FB0875713A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td></td>
			<td>Catalog # SH30258.01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus SZ51</td>
			<td></td>
			<td>Visual magnification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring gut acidification in the adult drosophila intestine

Bananfluen midgut består af flere regioner, som hver især består af celler, der udfører unikke fysiologiske funktioner, der kræves for at tarmen fungerer korrekt. En sådan region, kobbercelleregionen (CCR), er lokaliseret til den midterste midttarm og består delvist af en gruppe celler kendt som kobberceller. Kobberceller er involveret i mavesyresekretion, en evolutionært bevaret proces, hvis præcise rolle er dårligt forstået. Dette papir beskriver forbedringer i den nuværende protokol, der bruges til at analysere for forsuring af den voksne Drosophila melanogaster tarm og viser, at den kan bruges på andre arter af fluer. Dette papir viser især, at tarmforsuring er afhængig af fluens ernæringsstatus og præsenterer en protokol baseret på dette nye fund. Samlet set viser denne protokol den potentielle nytte af at studere Drosophila kobberceller for at afdække generelle principper, der ligger til grund for mekanismerne for tarmforsuring.

Vi sultede Oregon R kvindelige fluer i mere end 20 timer og fodrede dem derefter med mad suppleret med BPB (2%) i ~ 12 timer, som beskrevet tidligere7,8,9,10,11. Bromphenolblå (BPB) er et pH-sensing farvestof. Det skifter fra gul ved pH 3,0 til blå ved pH 4,6 og derover. Efter tarmdissektion, som tidligere rapporteret, viste det sig, at nogle fluer producere...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine at JoVE.com

Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine

Her præsenterer vi en standardiseret protokol til overvågning af tarmforsuring i Drosophila melanogaster med optimal effekt. Vi bruger først denne protokol til overvågning af tarmforsuring i Drosophila melanogaster og demonstrerer derefter dens anvendelse i ikke-model Drosophila arter.

Overvågning af tarmforsuring i den voksne drosophila tarm

The fruit fly midgut consists of multiple regions, each of which is composed of cells that carry out unique physiological functions required for the ...

Dette er den hurtigste og rigtige protokol til overvågning af Drosophila tarmforsuring med robuste og autentiske resultater. Denne metode vil bidrage til at bestemme rollen som tarmforsuring i flere organismer. Og dette fænomen er Enkelheden ved denne teknik er den største fordel.Som sådan kan det bruges til de ikke-modelorganismer. Denne metode kan overvåge syrefrigivelsen for mange systemer, herunder cellelinjerne og 3D på levende kulturer. Denne teknik er enkel med minimal indsats.Fødevarer indeholdende Bromophenol blå bør tilberedes friske. Derudover, mens dissektion tarm ikke bør strækkes. Begynd at arrangere tarmforsuringsovervågningsassay med tilberedning af fluemaden med pH-sensing Bromophenol blå eller BPB-farvestof.For at gøre det skal du smelte fluemaden i en mikrobølgeovn og lade den køle af, indtil den er lunken. Tilsæt en milliliter 4% BPB til en milliliter af den lunkne mad med en blandingsbrønde. Brug en pipette til at tilsætte fluemaden, der indeholder BPB, i en enkelt prak på ca. 200 mikroliter i midten af en petriskål.Saml derefter nul til to dage gamle ikke-jomfruelige kvindelige Drosophila melanogaster fluer, og lad fluerne komme sig på standard majsmel mad. Før eksperimentet sultes fluerne i 24 timer ved stuetemperatur i et hætteglas indeholdende et laboratorieaftørringsvæv gennemblødt med ca. to milliliter deioniseret vand. Overfør udsultede fluer til en petriskål, der indeholder enkelte prikker af det frisklavede fluefoder, suppleret med 2% BPB, så fluerne kan fouragere i fire timer ved stuetemperatur, mens de udsættes for lys.Efter fire timer samler fluerne, og fortsæt derefter med kirurgisk at isolere tarmene hos de bedøvede fluer i 1X PBS med tang under et stereomikroskop. Tæl antallet af fluer, der viser robust BPB, der står i tarmene, og beregn procentdelen ved hjælp af ligningen. Efter dissektion monteres prøverne i PBS på et glasglas og placeres det forberedte dias under mikroskopet.Juster derefter fokus ved hjælp af IPS. Når du er færdig, skal du slukke for IPS for at åbne lukkeren for kameraet. Efter tarmdissektion viste det sig, at nogle Drosophila melanogaster hunfluer producerede syre som angivet ved den gule farve i tarmens CCR.Mens tarmene hos nogle fluer var blå, hvilket tyder på, at fluerne ikke syrner deres tarme. Inden for 30 minutter havde ca. 20% af fluerne syrnet tarmen. Efter en time viste 40% af tarmens tarme forsuring, mens efter to til tre timers fodring steg procentdelen af forsurede tarme til 60 til 70%Næsten 90 til 95% af tarmene blev forsuret, når fluer blev fodret i fire timer.Der blev ikke observeret nogen forskel i tarmforsuring for to forskellige temperaturforhold. Effektiviteten af tarmforsuringsprotokollen blev vurderet i forskellige Drosophila-arter. Alle de testede arter viste robust tarmforsuring, hvilket tyder på, at protokollen kan anvendes på andre organismer.Det vigtigste at huske er at placere stjernefluerne i petripladen med gær og Bromophenol blå i fire timer. Denne teknik vil hjælpe med at forstå den grundlæggende biologi og cellulære vej, der er involveret i tarmforsuringen. Det skal også hjælpe med at identificere lægemiddelmålet for at skabe de sygdomme, der er relateret til tarmforsuring.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine

Unit 1

Membrane Transport and Active Transporters

SCIENTISTS IN ACTION

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite Zootermopsis Angusticollis and Visualizing Gut Microbes

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and ...

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Langsigtet dødelige toksicitet Test med krebsdyr Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Levende Imaging af Apoptotisk Cell Clearance under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

Tomat / GFP-FLP / FRT Metode til Live Imaging af Mosaic Voksen<em&gt; Drosophila</em&gt; fotoreceptorceller

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging Voksen Zebrafisk

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...