Name: monitoring gut acidification in the adult drosophila intestine
Uploaded: 2021-10-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine at JoVE.com

De auteurs erkennen dat ondersteuning voor werk in het laboratorium van de auteur wordt geboden door een HHMI Faculty Scholar Award en start-upfondsen van het Children's Research Institute aan het UT Southwestern Medical Center.

OPMERKING: De standaard laboratoriumlijn Oregon R werd gebruikt als een WT-besturing. Alle vliegen werden gekweekt op standaard maïsmeel-melasse medium (met melasse, agar, gist, maïsmeel, tegosept, propionzuur en water) bij kamertemperatuur met 12/12 uur licht / donker circadiaans ritme.
1. Voorbereiding op de test
<ol><li>Verzamel vrouwelijke vliegen (0-2 dagen oud, niet-maagdelijk) onder CO2-anesthesie en laat ze minstens 3 dagen vóór experimenten herstellen op standaa...

<ol>
	<li>Hollander, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+composition+and+mechanism+of+formation+of+gastric+acid+secretion.">The composition and mechanism of formation of gastric acid secretion.</a> Science. 110 (2846), 57-63 (1949).</li><li>Forte, J. G., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+recycling+of+the+gastric+parietal+cell+H,+K-ATPase.">Apical recycling of the gastric parietal cell H, K-ATPase.</a> Annual Review of Physiology. 72, 273-296 (2010).</li><li>Samuelson, L. C., Hinkle, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+gastric+acid+secretion+through+analysis+of+genetically+engineered+mice.">Insights into the regulation of gastric acid secretion through analysis of genetically engineered mice.</a> Annual Review of Physiology. 65, 383-400 (2003).</li><li>Yao, X., Forte, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+acid+secretion+by+the+parietal+cell.">Cell biology of acid secretion by the parietal cell.</a> Annual Review of Physiology. 65, 103-131 (2003).</li><li>Driver, I., Ohlstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+regional+intestinal+stem+cell+identity+during+Drosophila+metamorphosis.">Specification of regional intestinal stem cell identity during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 141 (9), 1848-1856 (2014).</li><li>Overend, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+and+functional+significance+of+acid+generation+in+the+Drosophila+midgut.">Molecular mechanism and functional significance of acid generation in the Drosophila midgut.</a> Scientific Reports. 6, 27242 (2016).</li><li>Shanbhag, S., Tripathi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+ultrastructure+and+cellular+mechanisms+of+acid+and+base+transport+in+the+Drosophila+midgut.">Epithelial ultrastructure and cellular mechanisms of acid and base transport in the Drosophila midgut.</a> Journal of Experimental Biology. 212, 1731-1744 (2009).</li><li>Dubreuil, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+cells+and+stomach+acid+secretion+in+the+Drosophila+midgut.">Copper cells and stomach acid secretion in the Drosophila midgut.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (5), 745-752 (2004).</li><li>Martorell, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+mechanisms+of+tumorigenesis+in+the+Drosophila+adult+midgut.">Conserved mechanisms of tumorigenesis in the Drosophila adult midgut.</a> PLoS ONE. 9 (2), 88413 (2014).</li><li>Strand, M., Micchelli, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+control+of+Drosophila+gut+stem+cell+proliferation:+EGF+establishes+GSSC+proliferative+set+point+&amp;+controls+emergence+from+quiescence.">Regional control of Drosophila gut stem cell proliferation: EGF establishes GSSC proliferative set point &amp; controls emergence from quiescence.</a> PLoS One. 8 (11), 80608 (2013).</li><li>Storelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+perpetuates+nutritional+mutualism+by+promoting+the+fitness+of+its+intestinal+symbiont+Lactobacillus+plantarum.">Drosophila perpetuates nutritional mutualism by promoting the fitness of its intestinal symbiont Lactobacillus plantarum.</a> Cell Metabolism. 27 (2), 362-377 (2018).</li><li>Abu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communicating+the+nutritional+value+of+sugar+in+Drosophila.">Communicating the nutritional value of sugar in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (12), 2829-2838 (2018).</li><li>Blecker, U., Gold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastritis+and+ulcer+disease+in+childhood.">Gastritis and ulcer disease in childhood.</a> European Journal of Pediatrics. 158 (7), 541-546 (1999).</li></ol>

Een cruciale stap in dit protocol is de juiste dissectie van de darm om de CCR voor het verzuringsfenotype te visualiseren. Het zuur dat vrijkomt uit de kopercellen is beperkt tot de CCR wanneer de darm intact is. Tijdens dissectie kan lekkage veroorzaakt door scheuring van de darm echter leiden tot diffusie van zuur uit de CCR en resulteren in een darm die ten onrechte als negatief wordt gescoord voor verzuring. Bovendien vervaagt de gele kleur die wijst op verzuring binnen 5-10 minuten na dissectie, wat het belang onde...

In de insectendarm delen kopercellen cellulaire en functionele overeenkomsten met de zuurproducerende maagpariëtale cellen (ook bekend als oxyntisch) van de zoogdiermaag. Deze groep cellen geeft zuur af in het darmlumen. De functie van zuursecretie en anatomie is evolutionair geconserveerd. De belangrijkste componenten van het geloosde zuur zijn zoutzuur en kaliumchloride. Het chemische mechanisme van zuurvorming in de cellen is afhankelijk van koolzuuranhydrase. Dit enzym genereert een bicarbonaation uit CO2 en water, dat een hydroxylion vrijmaakt dat vervolgens via een protonpomp in het lumen wordt afgevoerd in ruil voor kalium. Chloride- en kaliumionen worden via geleidingskanalen in het lumen getransporteerd, wat resulteert in de vorming van zoutzuur en kaliumchloride, het hoofdbestanddeel van maagsap1,2,3,4.
Hoewel de mechanismen van zuurvorming goed worden begrepen, is er veel minder bekend over de fysiologische mechanismen die de zuursecretie reguleren. Het doel van het ontwikkelen van deze methode is om de cellulaire routes die zuurvorming en secretie coördineren beter af te bakenen en de rol van zuur bij het bemiddelen van darmfysiologie en homeostase te bepalen. De reden achter de ontwikkeling en het gebruik van deze techniek is om een consistente en betrouwbare methode te bieden om het proces van darmverzuring in Drosophila en niet-modelorganismen te bestuderen. Hoewel er momenteel een standaardprotocol bestaat voor het bepalen van Drosophila midgut-verzuring2,5,6, werd een significante variabiliteit waargenomen in de mate van verzuring bij wildtype (WT) vliegen tijdens het gebruik van dit protocol voor het bestuderen van de kopercelfunctie. Om de basis voor deze waargenomen variabiliteit te begrijpen en consistente resultaten te verkrijgen, werden verschillende aspecten van het standaardprotocol geoptimaliseerd zoals hieronder beschreven.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>B0126</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. simulans</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. erecta</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. pseudoobscura</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. mojavensis</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Inox Biology</td>
			<td></td>
			<td>Catalog# 11252-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fuji</td>
			<td>Fuji</td>
			<td></td>
			<td>Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Catalog#16005-108</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim wipes Tissue</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope and camera</td>
			<td>Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon R</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock</td>
			<td></td>
			<td>(https://bdsc.indiana.edu/ # 2376)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Catalog #FB0875713A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td></td>
			<td>Catalog # SH30258.01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus SZ51</td>
			<td></td>
			<td>Visual magnification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring gut acidification in the adult drosophila intestine

De fruitvlieg midgut bestaat uit meerdere regio's, die elk zijn samengesteld uit cellen die unieke fysiologische functies uitvoeren die nodig zijn voor de goede werking van de darm. Een dergelijk gebied, het kopercelgebied (CCR), is gelokaliseerd in het middelste middengut en bestaat gedeeltelijk uit een groep cellen die bekend staat als kopercellen. Kopercellen zijn betrokken bij maagzuursecretie, een evolutionair geconserveerd proces waarvan de precieze rol slecht wordt begrepen. Dit artikel beschrijft verbeteringen in het huidige protocol dat wordt gebruikt om te testen op verzuring van de volwassen Drosophila melanogaster-darm en toont aan dat het kan worden gebruikt op andere soorten vliegen. In het bijzonder toont dit artikel aan dat darmverzuring afhankelijk is van de voedingsstatus van de vlieg en presenteert een protocol op basis van deze nieuwe bevinding. Over het algemeen toont dit protocol het potentiële nut aan van het bestuderen van Drosophila-kopercellen om algemene principes te ontdekken die ten grondslag liggen aan de mechanismen van darmverzuring.

We hongerden Oregon R vrouwelijke vliegen meer dan 20 uur uit en voerden ze vervolgens voedsel aangevuld met BPB (2%) gedurende ~ 12 uur, zoals eerder beschreven7,8,9,10,11. Broomfenolblauw (BPB) is een pH-sensing kleurstof. Het verandert van geel bij pH 3,0 tot blauw bij pH 4,6 en hoger. Na darmdissectie, zoals eerder gemeld, bleken sommige vliegen zuur te pr...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine at JoVE.com

Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine

Hier presenteren we een gestandaardiseerd protocol voor het monitoren van darmverzuring in Drosophila melanogaster met optimale output. We gebruiken dit protocol eerst voor darmverzuringsmonitoring bij Drosophila melanogaster en demonstreren vervolgens het gebruik ervan in niet-model Drosophila-soorten .

Monitoring van darmverzuring in de drosophila-darm van volwassenen

The fruit fly midgut consists of multiple regions, each of which is composed of cells that carry out unique physiological functions required for the ...

Dit is het snelste en juiste protocol om de Drosophila darmverzuring te monitoren met robuuste en authentieke resultaten. Deze methode zal helpen om de rol van darmverzuring in meerdere organismen te bepalen. En dit fenomeen is De eenvoud van deze techniek is het belangrijkste voordeel.Als zodanig kan het worden gebruikt voor de niet-modelorganismen. Deze methode kan de zuurafgifte voor veel systemen monitoren, waaronder de cellijnen en 3D op levende culturen. Deze techniek is eenvoudig met minimale inspanning.Voedsel dat broomfenolblauw bevat, moet vers worden bereid. Bovendien, terwijl dissectie darm niet mag worden uitgerekt. Begin met het regelen van de darmverzuringsmonitoringstest met de bereiding van het vliegenvoer met pH-detectie bromofenolblauw of BPB-kleurstof.Smelt hiervoor het vliegenvoer in een magnetron en laat het afkoelen tot het lauw is. Voeg een milliliter van 4% BPB toe aan een milliliter van het lauwe voedsel met een mengput. Voeg met een pipet het vliegenvoer met BPB toe aan een enkele stip van ongeveer 200 microliter in het midden van een petrischaaltje.Verzamel vervolgens nul tot twee dagen oude niet-maagdelijke vrouwelijke Drosophila melanogaster-vliegen en laat de vliegen herstellen op standaard maïsmeelvoedsel. Voor het experiment, honger de vliegen gedurende 24 uur bij kamertemperatuur uit in een flacon met een laboratoriumdoekje weefsel gedrenkt met ongeveer twee milliliter gedeïoniseerd water. Breng uitgehongerde vliegen over in een petrischaaltje met enkele stippen van het vers bereide vliegenvoer, aangevuld met 2% BPB, zodat de vliegen vier uur bij kamertemperatuur kunnen foerageren terwijl ze aan licht worden blootgesteld.Na vier uur verzamelen van de vliegen, ga dan verder met het operatief isoleren van de ingewanden van de verdoofde vliegen in 1X PBS met een tang onder een stereomicroscoop. Tel het aantal vliegen dat robuuste BPB in de ingewanden laat zien en bereken het percentage met behulp van de vergelijking. Monteer na de dissectie de monsters in PBS op een glazen dia en plaats het voorbereide glaasje onder de microscoop.Pas vervolgens de scherpstelling aan met behulp van de IPS. Als u klaar bent, schakelt u de IPS uit om de sluiter voor de camera te openen. Na darmdissectie bleken sommige Drosophila melanogaster vrouwelijke vliegen zuur te produceren zoals aangegeven door de gele kleur in de CCR van de darm.Terwijl de darmen van sommige vliegen blauw waren, wat duidt op een falen van de vliegen om hun ingewanden te verzuren. Binnen 30 minuten had ongeveer 20% van de vliegen de darm verzuurd. Na een uur vertoonde 40% van de darmdarmen verzuring, terwijl na twee tot drie uur voeden het percentage aangezuurde darmen steeg tot 60 tot 70%Bijna 90 tot 95% van de darmen werden aangezuurd wanneer vliegen vier uur lang werden gevoerd.Er werd geen verschil in darmverzuring waargenomen voor twee verschillende temperatuuromstandigheden. De efficiëntie van het darmverzuringsprotocol werd beoordeeld bij verschillende Drosophila-soorten. Alle geteste soorten vertoonden robuuste darmverzuring, wat suggereert dat het protocol kan worden toegepast op andere organismen.Het belangrijkste om te onthouden, is om de stervliegen vier uur lang in de petriplaat met gist en broomfenolblauw te plaatsen. Deze techniek zal helpen om de basisbiologie en cellulaire route te begrijpen die betrokken zijn bij de darmverzuring. Het moet ook helpen om het medicijndoel te identificeren om de ziekten te creëren die verband houden met de darmverzuring.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine

Unit 1

Membrane Transport and Active Transporters

SCIENTISTS IN ACTION

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite Zootermopsis Angusticollis and Visualizing Gut Microbes

Extraheren van DNA uit de Gut Microben van de Termite (Zootermopsis Angusticollis) en visualiseren Gut microben

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and ...

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

Hele Cell Opnamen van Brain van Adult Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Hoge-resolutie video-Tracking van Locomotion in Adult Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Monitoring Heart Functie in larvale Drosophila melanogaster Voor Fysiologische Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Dissectie van Oenocytes tegen Adult Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Insuline-injectie en hemolymfe Extraction om de gevoeligheid voor insuline meten in het volwassenenonderwijs Drosophila melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Lange-termijn Lethal toxiciteit Test met de Schaal- Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Wonen Imaging van apoptotische cel Clearance tijdens<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

De Tomaat / GFP-FLP / FRT Methode voor Live Imaging van Mozaïek Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreceptorcellen

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging Adult zebravis

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...