Name: monitoring gut acidification in the adult drosophila intestine
Uploaded: 2021-10-11T14:00:00
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Les auteurs reconnaissent que le soutien au travail dans le laboratoire de l’auteur est fourni par un HHMI Faculty Scholar Award et des fonds de démarrage du Children’s Research Institute du UT Southwestern Medical Center.

REMARQUE: La ligne de laboratoire standard Oregon R a été utilisée comme contrôle WT. Toutes les mouches ont été élevées sur un milieu standard de semoule de maïs et de mélasse (contenant de la mélasse, de la gélose, de la levure, de la semoule de maïs, du tegosept, de l’acide propionique et de l’eau) à température ambiante avec un rythme circadien clair/foncé de 12/12 h.
1. Préparation au test
<ol><li>Recueillir les mouches femelles (âgées de 0 à 2 j...

<ol>
	<li>Hollander, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+composition+and+mechanism+of+formation+of+gastric+acid+secretion.">The composition and mechanism of formation of gastric acid secretion.</a> Science. 110 (2846), 57-63 (1949).</li><li>Forte, J. G., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+recycling+of+the+gastric+parietal+cell+H,+K-ATPase.">Apical recycling of the gastric parietal cell H, K-ATPase.</a> Annual Review of Physiology. 72, 273-296 (2010).</li><li>Samuelson, L. C., Hinkle, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+gastric+acid+secretion+through+analysis+of+genetically+engineered+mice.">Insights into the regulation of gastric acid secretion through analysis of genetically engineered mice.</a> Annual Review of Physiology. 65, 383-400 (2003).</li><li>Yao, X., Forte, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+acid+secretion+by+the+parietal+cell.">Cell biology of acid secretion by the parietal cell.</a> Annual Review of Physiology. 65, 103-131 (2003).</li><li>Driver, I., Ohlstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+regional+intestinal+stem+cell+identity+during+Drosophila+metamorphosis.">Specification of regional intestinal stem cell identity during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 141 (9), 1848-1856 (2014).</li><li>Overend, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+and+functional+significance+of+acid+generation+in+the+Drosophila+midgut.">Molecular mechanism and functional significance of acid generation in the Drosophila midgut.</a> Scientific Reports. 6, 27242 (2016).</li><li>Shanbhag, S., Tripathi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+ultrastructure+and+cellular+mechanisms+of+acid+and+base+transport+in+the+Drosophila+midgut.">Epithelial ultrastructure and cellular mechanisms of acid and base transport in the Drosophila midgut.</a> Journal of Experimental Biology. 212, 1731-1744 (2009).</li><li>Dubreuil, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+cells+and+stomach+acid+secretion+in+the+Drosophila+midgut.">Copper cells and stomach acid secretion in the Drosophila midgut.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (5), 745-752 (2004).</li><li>Martorell, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+mechanisms+of+tumorigenesis+in+the+Drosophila+adult+midgut.">Conserved mechanisms of tumorigenesis in the Drosophila adult midgut.</a> PLoS ONE. 9 (2), 88413 (2014).</li><li>Strand, M., Micchelli, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+control+of+Drosophila+gut+stem+cell+proliferation:+EGF+establishes+GSSC+proliferative+set+point+&amp;+controls+emergence+from+quiescence.">Regional control of Drosophila gut stem cell proliferation: EGF establishes GSSC proliferative set point &amp; controls emergence from quiescence.</a> PLoS One. 8 (11), 80608 (2013).</li><li>Storelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+perpetuates+nutritional+mutualism+by+promoting+the+fitness+of+its+intestinal+symbiont+Lactobacillus+plantarum.">Drosophila perpetuates nutritional mutualism by promoting the fitness of its intestinal symbiont Lactobacillus plantarum.</a> Cell Metabolism. 27 (2), 362-377 (2018).</li><li>Abu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communicating+the+nutritional+value+of+sugar+in+Drosophila.">Communicating the nutritional value of sugar in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (12), 2829-2838 (2018).</li><li>Blecker, U., Gold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastritis+and+ulcer+disease+in+childhood.">Gastritis and ulcer disease in childhood.</a> European Journal of Pediatrics. 158 (7), 541-546 (1999).</li></ol>

Une étape critique de ce protocole est la dissection appropriée de l’intestin pour visualiser le CCR pour le phénotype d’acidification. L’acide libéré par les cellules de cuivre est confiné au CCR lorsque l’intestin est intact. Cependant, lors de la dissection, une fuite causée par une rupture de l’intestin peut entraîner la diffusion de l’acide du CCR et entraîner un intestin marqué par erreur comme négatif pour l’acidification. En outre, la couleur jaune indicative de l’acidification s’esto...

Dans l’intestin de l’insecte, les cellules de cuivre partagent des similitudes cellulaires et fonctionnelles avec les cellules pariétales gastriques productrices d’acide (également appelées oxyntiques) de l’estomac des mammifères. Ce groupe de cellules libère de l’acide dans la lumière intestinale. La fonction de la sécrétion acide et de l’anatomie est conservée de manière évolutive. Les principaux composants de l’acide rejeté sont l’acide chlorhydrique et le chlorure de potassium. Le mécanisme chimique de formation d’acide dans les cellules dépend de l’anhydrase carbonique. Cette enzyme génère un ion bicarbonate à partir du CO2 et de l’eau, qui libère un ion hydroxyle qui est ensuite rejeté dans la lumière par une pompe à protons en échange de potassium. Les ions chlorure et potassium sont transportés dans la lumière par des canaux de conductance entraînant la formation d’acide chlorhydrique et de chlorure de potassium, le composant principal du suc gastrique1,2,3,4.
Bien que les mécanismes de formation d’acide soient bien compris, on en sait beaucoup moins sur les mécanismes physiologiques qui régulent la sécrétion d’acide. L’objectif du développement de cette méthode est d’aider à mieux délimiter les voies cellulaires qui coordonnent la formation et la sécrétion d’acide et de déterminer le rôle de l’acide dans la médiation de la physiologie intestinale et de l’homéostasie. La raison d’être du développement et de l’utilisation de cette technique est de fournir une méthode cohérente et fiable pour étudier le processus d’acidification intestinale chez la drosophile et les organismes non modèles. Bien qu’il existe actuellement un protocole standard pour déterminer l’acidification de l’intestin moyen de la drosophile2,5,6, une variabilité significative a été observée dans l’étendue de l’acidification chez les mouches de type sauvage (WT) lors de l’utilisation de ce protocole pour étudier la fonction des cellules de cuivre. Pour comprendre la base de cette variabilité observée et obtenir des résultats cohérents, plusieurs aspects du protocole standard ont été optimisés comme décrit ci-dessous.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>B0126</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. simulans</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. erecta</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. pseudoobscura</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. mojavensis</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Inox Biology</td>
			<td></td>
			<td>Catalog# 11252-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fuji</td>
			<td>Fuji</td>
			<td></td>
			<td>Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Catalog#16005-108</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim wipes Tissue</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope and camera</td>
			<td>Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon R</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock</td>
			<td></td>
			<td>(https://bdsc.indiana.edu/ # 2376)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Catalog #FB0875713A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td></td>
			<td>Catalog # SH30258.01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus SZ51</td>
			<td></td>
			<td>Visual magnification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring gut acidification in the adult drosophila intestine

L’intestin moyen de la mouche des fruits se compose de plusieurs régions, chacune composée de cellules qui remplissent des fonctions physiologiques uniques nécessaires au bon fonctionnement de l’intestin. L’une de ces régions, la région des cellules de cuivre (CCR), est localisée dans l’intestin moyen et se compose, en partie, d’un groupe de cellules appelées cellules de cuivre. Les cellules de cuivre sont impliquées dans la sécrétion d’acide gastrique, un processus conservé de manière évolutive dont le rôle précis est mal compris. Cet article décrit les améliorations apportées au protocole actuel utilisé pour tester l’acidification de l’intestin adulte de Drosophila melanogaster et démontre qu’il peut être utilisé sur d’autres espèces de mouches. En particulier, cet article démontre que l’acidification intestinale dépend de l’état nutritionnel de la mouche et présente un protocole basé sur cette nouvelle découverte. Dans l’ensemble, ce protocole démontre l’utilité potentielle de l’étude des cellules de cuivre de la drosophile pour découvrir les principes généraux sous-jacents aux mécanismes de l’acidification intestinale.

Nous avons affamé les mouches femelles oregon R pendant plus de 20 heures, puis nous les avons nourries avec de la nourriture supplémentée en BPB (2%) pendant environ 12 heures, comme décrit précédemment7,8,9,10,11. Le bleu de bromophénol (BPB) est un colorant qui détecte le pH. Il passe du jaune à un pH de 3,0 au bleu à un pH de 4,6 et plus. Après ...

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Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine

Ici, nous présentons un protocole standardisé pour surveiller l’acidification intestinale chez Drosophila melanogaster avec un rendement optimal. Nous utilisons d’abord ce protocole pour la surveillance de l’acidification intestinale chez Drosophila melanogaster , puis démontrons son utilisation chez les espèces de drosophila non modèles.

Surveillance de l’acidification intestinale dans l’intestin de la drosophile adulte

The fruit fly midgut consists of multiple regions, each of which is composed of cells that carry out unique physiological functions required for the ...

C’est le protocole le plus rapide et le plus approprié pour surveiller l’acidification intestinale de la drosophile avec des résultats robustes et authentiques. Cette méthode aidera à déterminer le rôle de l’acidification intestinale dans plusieurs organismes. Et ce phénomène est La simplicité de cette technique est le principal avantage.En tant que tel, il peut être utilisé pour les organismes non modèles. Cette méthode permet de surveiller la libération d’acide pour de nombreux systèmes, y compris les lignées cellulaires et la 3D sur des cultures vivantes. Cette technique est simple avec un minimum d’effort.Les aliments contenant du bleu de bromophénol doivent être préparés frais. En outre, alors que l’intestin de dissection ne doit pas être étiré. Commencez à organiser le test de surveillance de l’acidification intestinale avec la préparation de la nourriture pour mouches avec un colorant à détection de pH au bleu de bromophénol ou au BPB.Pour ce faire, faites fondre la nourriture pour mouches au micro-ondes et laissez-la refroidir jusqu’à ce qu’elle soit tiède. Ajouter un millilitre de 4% de BPB à un millilitre de la nourriture tiède avec un puits de mélange. À l’aide d’une pipette, ajoutez la nourriture pour mouches contenant du BPB en un seul point d’environ 200 microlitres au centre d’une boîte de Pétri.Ensuite, collectez des mouches femelles non vierges de zéro à deux jours, Drosophila melanogaster, et permettez aux mouches de récupérer sur les aliments standard de farine de maïs. Avant l’expérience, affamer les mouches pendant 24 heures à température ambiante dans un flacon contenant un tissu de lingette de laboratoire imbibé d’environ deux millilitres d’eau désionisée. Transférer les mouches affamées dans une boîte de Pétri contenant des points uniques de la nourriture pour mouches fraîchement préparée, complétée par 2% de BPB, pour permettre aux mouches de se nourrir pendant quatre heures à température ambiante tout en étant exposées à la lumière.Après quatre heures, collectez les mouches, puis procédez à l’isolement chirurgical des intestins des mouches anesthésiées dans 1X PBS avec une pince au stéréomicroscope. Comptez le nombre de mouches qui montrent un BPB robuste debout dans les tripes et calculez le pourcentage à l’aide de l’équation. Après la dissection, montez les échantillons dans PBS sur une lame de verre et placez la lame préparée sous le microscope.Ajustez ensuite la mise au point à l’aide de l’IPS. Une fois cela fait, éteignez l’IPS pour ouvrir l’obturateur de l’appareil photo. Après la dissection intestinale, certaines mouches femelles de Drosophila melanogaster ont produit de l’acide, comme l’indique la couleur jaune dans le CCR de l’intestin.Alors que les intestins de certaines mouches étaient bleus, ce qui suggère un échec des mouches à acidifier leurs intestins. En 30 minutes, environ 20% des mouches avaient acidifié l’intestin. Après une heure, 40% des intestins intestinaux ont montré une acidification, tandis qu’après deux à trois heures d’alimentation, le pourcentage d’intestins acidifiés est passé à 60 à 70%Près de 90 à 95% des intestins ont été acidifiés lorsque les mouches ont été nourries pendant quatre heures.Aucune différence dans l’acidification intestinale n’a été observée pour deux conditions de température différentes. L’efficacité du protocole d’acidification intestinale a été évaluée chez diverses espèces de drosophiles. Toutes les espèces testées ont montré une acidification intestinale robuste, ce qui suggère que le protocole peut être appliqué à d’autres organismes.La chose la plus importante à retenir est de placer les mouches étoiles dans la plaque de Pétri avec de la levure et du bleu de bromophénol pendant quatre heures. Cette technique aidera à comprendre la biologie de base et la voie cellulaire impliquées dans l’acidification intestinale. Il devrait également aider à identifier la cible médicamenteuse pour créer les maladies liées à l’acidification intestinale.

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Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine

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