Name: monitoring gut acidification in the adult drosophila intestine
Uploaded: 2021-10-11T14:00:00
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Die Autoren erkennen an, dass die Unterstützung für die Arbeit im Labor des Autors durch einen HHMI Faculty Scholar Award und Startkapital des Children's Research Institute am UT Southwestern Medical Center bereitgestellt wird.

HINWEIS: Die Standard-Laborlinie Oregon R wurde als WT-Steuerung verwendet. Alle Fliegen wurden auf Standard-Maismehl-Melasse-Medium (mit Melasse, Agar, Hefe, Maismehl, Tegosept, Propionsäure und Wasser) bei Raumtemperatur mit 12/12 h hell/dunkel zirkadianem Rhythmus aufgezogen.
1. Vorbereitung auf den Assay
<ol><li>Sammeln Sie weibliche Fliegen (0-2 Tage alt, nicht jungfräulich) unter CO2-Anästhesie und lassen Sie sie sich mindestens 3 Tage vor den Experimente...

<ol>
	<li>Hollander, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+composition+and+mechanism+of+formation+of+gastric+acid+secretion.">The composition and mechanism of formation of gastric acid secretion.</a> Science. 110 (2846), 57-63 (1949).</li><li>Forte, J. G., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+recycling+of+the+gastric+parietal+cell+H,+K-ATPase.">Apical recycling of the gastric parietal cell H, K-ATPase.</a> Annual Review of Physiology. 72, 273-296 (2010).</li><li>Samuelson, L. C., Hinkle, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+gastric+acid+secretion+through+analysis+of+genetically+engineered+mice.">Insights into the regulation of gastric acid secretion through analysis of genetically engineered mice.</a> Annual Review of Physiology. 65, 383-400 (2003).</li><li>Yao, X., Forte, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+acid+secretion+by+the+parietal+cell.">Cell biology of acid secretion by the parietal cell.</a> Annual Review of Physiology. 65, 103-131 (2003).</li><li>Driver, I., Ohlstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+regional+intestinal+stem+cell+identity+during+Drosophila+metamorphosis.">Specification of regional intestinal stem cell identity during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 141 (9), 1848-1856 (2014).</li><li>Overend, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+and+functional+significance+of+acid+generation+in+the+Drosophila+midgut.">Molecular mechanism and functional significance of acid generation in the Drosophila midgut.</a> Scientific Reports. 6, 27242 (2016).</li><li>Shanbhag, S., Tripathi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+ultrastructure+and+cellular+mechanisms+of+acid+and+base+transport+in+the+Drosophila+midgut.">Epithelial ultrastructure and cellular mechanisms of acid and base transport in the Drosophila midgut.</a> Journal of Experimental Biology. 212, 1731-1744 (2009).</li><li>Dubreuil, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+cells+and+stomach+acid+secretion+in+the+Drosophila+midgut.">Copper cells and stomach acid secretion in the Drosophila midgut.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (5), 745-752 (2004).</li><li>Martorell, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+mechanisms+of+tumorigenesis+in+the+Drosophila+adult+midgut.">Conserved mechanisms of tumorigenesis in the Drosophila adult midgut.</a> PLoS ONE. 9 (2), 88413 (2014).</li><li>Strand, M., Micchelli, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+control+of+Drosophila+gut+stem+cell+proliferation:+EGF+establishes+GSSC+proliferative+set+point+&amp;+controls+emergence+from+quiescence.">Regional control of Drosophila gut stem cell proliferation: EGF establishes GSSC proliferative set point &amp; controls emergence from quiescence.</a> PLoS One. 8 (11), 80608 (2013).</li><li>Storelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+perpetuates+nutritional+mutualism+by+promoting+the+fitness+of+its+intestinal+symbiont+Lactobacillus+plantarum.">Drosophila perpetuates nutritional mutualism by promoting the fitness of its intestinal symbiont Lactobacillus plantarum.</a> Cell Metabolism. 27 (2), 362-377 (2018).</li><li>Abu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communicating+the+nutritional+value+of+sugar+in+Drosophila.">Communicating the nutritional value of sugar in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (12), 2829-2838 (2018).</li><li>Blecker, U., Gold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastritis+and+ulcer+disease+in+childhood.">Gastritis and ulcer disease in childhood.</a> European Journal of Pediatrics. 158 (7), 541-546 (1999).</li></ol>

Ein kritischer Schritt in diesem Protokoll ist die richtige Dissektion des Darms, um die CCR für den Versauerungsphänotyp zu visualisieren. Die aus den Kupferzellen freigesetzte Säure ist auf das CCR beschränkt, wenn der Darm intakt ist. Während der Dissektion kann jedoch eine durch darmruptur verursachte Leckage zur Diffusion von Säure aus dem CCR führen und zu einem Darm führen, der fälschlicherweise als negativ für die Übersäuerung bewertet wird. Darüber hinaus verblasst die gelbe Farbe, die auf eine Ans?...

Im Insektendarm teilen Kupferzellen zelluläre und funktionelle Ähnlichkeiten mit den säureproduzierenden Magenparietalzellen (auch bekannt als oxyntisch) des Säugetiermagens. Diese Gruppe von Zellen setzt Säure in das Darmlumen frei. Die Funktion der Säuresekretion und Anatomie ist evolutionär erhalten. Die Hauptbestandteile der entladenen Säure sind Salzsäure und Kaliumchlorid. Der chemische Mechanismus der Säurebildung in den Zellen hängt von der Carboanhydrase ab. Dieses Enzym erzeugt aus CO2 und Wasser ein Bicarbonation, das ein Hydroxylion freisetzt, das dann durch eine Protonenpumpe im Austausch für Kalium in das Lumen abgegeben wird. Chlorid- und Kaliumionen werden über Leitfähigkeitskanäle in das Lumen transportiert, was zur Bildung von Salzsäure und Kaliumchlorid, dem Hauptbestandteil des Magensaftes, führt1,2,3,4.
Obwohl die Mechanismen der Säurebildung gut verstanden sind, ist viel weniger über die physiologischen Mechanismen bekannt, die die Säuresekretion regulieren. Ziel der Entwicklung dieser Methode ist es, die zellulären Wege, die die Säurebildung und -sekretion koordinieren, besser abzugrenzen und die Rolle der Säure bei der Vermittlung der Darmphysiologie und Homöostase zu bestimmen. Die Begründung für die Entwicklung und Anwendung dieser Technik besteht darin, eine konsistente und zuverlässige Methode zur Untersuchung des Prozesses der Darmversauerung in Drosophila und Nicht-Modellorganismen bereitzustellen. Obwohl derzeit ein Standardprotokoll zur Bestimmung der Drosophila-Mitteldarmversauerung existiert2,5,6 wurde eine signifikante Variabilität im Ausmaß der Versauerung bei Wildtypfliegen (WT) beobachtet, während dieses Protokoll zur Untersuchung der Kupferzellfunktion verwendet wurde. Um die Grundlage für diese beobachtete Variabilität zu verstehen und konsistente Ergebnisse zu erhalten, wurden mehrere Aspekte des Standardprotokolls wie unten beschrieben optimiert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>B0126</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. simulans</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. erecta</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. pseudoobscura</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. mojavensis</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Inox Biology</td>
			<td></td>
			<td>Catalog# 11252-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fuji</td>
			<td>Fuji</td>
			<td></td>
			<td>Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Catalog#16005-108</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim wipes Tissue</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope and camera</td>
			<td>Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon R</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock</td>
			<td></td>
			<td>(https://bdsc.indiana.edu/ # 2376)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Catalog #FB0875713A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td></td>
			<td>Catalog # SH30258.01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus SZ51</td>
			<td></td>
			<td>Visual magnification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring gut acidification in the adult drosophila intestine

Der Fruchtfliegenmitteldarm besteht aus mehreren Regionen, von denen jede aus Zellen besteht, die einzigartige physiologische Funktionen ausführen, die für das reibungslose Funktionieren des Darms erforderlich sind. Eine solche Region, die Kupferzellregion (CCR), ist im mittleren Mitteldarm lokalisiert und besteht zum Teil aus einer Gruppe von Zellen, die als Kupferzellen bekannt sind. Kupferzellen sind an der Magensäuresekretion beteiligt, einem evolutionär konservierten Prozess, dessen genaue Rolle kaum verstanden wird. Dieses Papier beschreibt Verbesserungen im aktuellen Protokoll, das zur Untersuchung der Übersäuerung des adulten Drosophila melanogaster-Darms verwendet wird, und zeigt, dass es bei anderen Fliegenarten angewendet werden kann. Insbesondere zeigt diese Arbeit, dass die Übersäuerung des Darms vom Ernährungszustand der Fliege abhängt und stellt ein Protokoll vor, das auf diesem neuen Befund basiert. Insgesamt zeigt dieses Protokoll die potenzielle Nützlichkeit der Untersuchung von Drosophila-Kupferzellen , um allgemeine Prinzipien aufzudecken, die den Mechanismen der Darmversauerung zugrunde liegen.

Wir hungerten Oregon R weibliche Fliegen für mehr als 20 h und fütterten sie dann mit BPB (2%) für ~ 12 h, wie zuvor beschrieben7,8,9,10,11. Bromphenolblau (BPB) ist ein pH-sensorischer Farbstoff. Es wechselt von Gelb bei pH 3,0 zu Blau bei pH 4,6 und höher. Nach der Darmdissektion wurde, wie bereits berichtet, festgestellt, dass einige Fliegen Säure prod...

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Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine

Hier stellen wir ein standardisiertes Protokoll zur Überwachung der Darmsäuerung bei Drosophila melanogaster mit optimalem Output vor. Wir verwenden dieses Protokoll zuerst für das Monitoring der Darmversauerung bei Drosophila melanogaster und demonstrieren dann seine Verwendung bei Nicht-Modell-Drosophila-Spezies.

Überwachung der Darmsäuerung im erwachsenen Drosophila-Darm

The fruit fly midgut consists of multiple regions, each of which is composed of cells that carry out unique physiological functions required for the ...

Dies ist das schnellste und richtige Protokoll zur Überwachung der Drosophila-Darmversauerung mit robusten und authentischen Ergebnissen. Diese Methode wird helfen, die Rolle der Darmversauerung in mehreren Organismen zu bestimmen. Und dieses Phänomen ist Die Einfachheit dieser Technik ist der Hauptvorteil.Als solches kann es für die Nicht-Modellorganismen verwendet werden. Diese Methode kann die Säurefreisetzung für viele Systeme überwachen, einschließlich der Zelllinien und 3D auf lebenden Kulturen. Diese Technik ist einfach mit minimalem Aufwand.Lebensmittel, die Bromphenolblau enthalten, sollten frisch zubereitet werden. Darüber hinaus sollte der Darm während der Dissektion nicht gedehnt werden. Beginnen Sie mit der Organisation des Darmsäuerungsmonitoring-Assays mit der Zubereitung des Fliegenfutters mit pH-Messstoff Bromphenolblau oder BPB-Farbstoff.Schmelzen Sie dazu das Fliegenfutter in der Mikrowelle und lassen Sie es lauwarm abkühlen. Einen Milliliter 4%BPB zu einem Milliliter des lauwarmen Futters mit einer Mischmulde geben. Fügen Sie mit einer Pipette das BPB-haltige Fliegenfutter in einen einzigen Punkt von etwa 200 Mikrolitern in der Mitte einer Petrischale hinzu.Als nächstes sammeln Sie null bis zwei Tage alte nicht-jungfräuliche weibliche Drosophila melanogaster Fliegen und lassen Sie die Fliegen sich auf Standard-Maismehlfutter erholen. Vor dem Experiment verhungern die Fliegen für 24 Stunden bei Raumtemperatur in einer Durchstechflasche, die ein Laborwischtuch enthält, das mit etwa zwei Millilitern entionisiertem Wasser getränkt ist. Übertragen Sie verhungerte Fliegen in eine Petrischale mit einzelnen Punkten des frisch zubereiteten Fliegenfutters, ergänzt mit 2% BPB, damit die Fliegen vier Stunden bei Raumtemperatur suchen können, während sie Licht ausgesetzt sind.Nach vier Stunden sammeln Sie die Fliegen und isolieren Sie dann chirurgisch die Eingeweide der betäubten Fliegen in 1X PBS mit Pinzette unter einem Stereomikroskop. Zählen Sie die Anzahl der Fliegen, die einen robusten BPB zeigen, der in den Eingeweiden steht, und berechnen Sie den Prozentsatz anhand der Gleichung. Montieren Sie die Proben nach der Dissektion in PBS auf einem Glasobjektträger und legen Sie den vorbereiteten Objektträger unter das Mikroskop.Passen Sie dann den Fokus mit dem IPS an. Sobald Sie fertig sind, schalten Sie das IPS aus, um den Verschluss für die Kamera zu öffnen. Nach der Darmdissektion wurde festgestellt, dass einige weibliche Fliegen von Drosophila melanogaster Säure produzieren, wie die gelbe Farbe in der CCR des Darms anzeigt.Während der Darm einiger Fliegen blau war, was auf ein Versagen der Fliegen hindeutet, ihre Eingeweide zu übersäuern. Innerhalb von 30 Minuten hatten etwa 20% der Fliegen den Darm angesäuert. Nach einer Stunde zeigten 40% der Eingeweide eine Übersäuerung, während nach zwei bis drei Stunden Fütterung der Prozentsatz der angesäuerten Eingeweide auf 60 bis 70% anstieg Fast 90 bis 95% der Eingeweide waren angesäuert, wenn Fliegen vier Stunden lang gefüttert wurden.Es wurde kein Unterschied in der Darmversauerung für zwei verschiedene Temperaturbedingungen beobachtet. Die Wirksamkeit des Darmversauerungsprotokolls wurde bei verschiedenen Drosophila-Spezies bewertet. Alle getesteten Arten zeigten eine robuste Darmversauerung, was darauf hindeutet, dass das Protokoll auf andere Organismen angewendet werden kann.Das Wichtigste, woran man sich erinnern sollte, ist, die Sternfliegen mit Hefe und Bromphenolblau für vier Stunden in die Petriplatte zu legen. Diese Technik wird helfen, die grundlegende Biologie und den zellulären Weg zu verstehen, die an der Versauerung des Darms beteiligt sind. Es sollte auch helfen, das Wirkstoffziel zu identifizieren, um die mit der Darmversauerung verbundenen Krankheiten zu erzeugen.

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