Name: monitoring gut acidification in the adult drosophila intestine
Uploaded: 2021-10-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine at JoVE.com

המחברים מכירים בכך שהתמיכה בעבודה במעבדה של המחבר ניתנת על ידי פרס חוקר הפקולטה של HHMI וקרנות סטארט-אפ ממכון המחקר לילדים במרכז הרפואי UT Southwestern.

הערה: קו המעבדה הסטנדרטי Oregon R שימש כפקד WT. כל הזבובים גודלו על מדיום רגיל של קמח תירס-מולסה (המכיל מולסה, אגר, שמרים, קמח תירס, טגוזפט, חומצה פרופיונית ומים) בטמפרטורת החדר עם 12/12 שעות שעון ביולוגי בהיר/כהה.
1. הכנה לבדיקה
<ol><li>לאסוף זבובים נשיים (0-2 ימים, לא בתולה) תחת הר...

<ol>
	<li>Hollander, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+composition+and+mechanism+of+formation+of+gastric+acid+secretion.">The composition and mechanism of formation of gastric acid secretion.</a> Science. 110 (2846), 57-63 (1949).</li><li>Forte, J. G., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+recycling+of+the+gastric+parietal+cell+H,+K-ATPase.">Apical recycling of the gastric parietal cell H, K-ATPase.</a> Annual Review of Physiology. 72, 273-296 (2010).</li><li>Samuelson, L. C., Hinkle, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+gastric+acid+secretion+through+analysis+of+genetically+engineered+mice.">Insights into the regulation of gastric acid secretion through analysis of genetically engineered mice.</a> Annual Review of Physiology. 65, 383-400 (2003).</li><li>Yao, X., Forte, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+acid+secretion+by+the+parietal+cell.">Cell biology of acid secretion by the parietal cell.</a> Annual Review of Physiology. 65, 103-131 (2003).</li><li>Driver, I., Ohlstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+regional+intestinal+stem+cell+identity+during+Drosophila+metamorphosis.">Specification of regional intestinal stem cell identity during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 141 (9), 1848-1856 (2014).</li><li>Overend, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+and+functional+significance+of+acid+generation+in+the+Drosophila+midgut.">Molecular mechanism and functional significance of acid generation in the Drosophila midgut.</a> Scientific Reports. 6, 27242 (2016).</li><li>Shanbhag, S., Tripathi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+ultrastructure+and+cellular+mechanisms+of+acid+and+base+transport+in+the+Drosophila+midgut.">Epithelial ultrastructure and cellular mechanisms of acid and base transport in the Drosophila midgut.</a> Journal of Experimental Biology. 212, 1731-1744 (2009).</li><li>Dubreuil, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+cells+and+stomach+acid+secretion+in+the+Drosophila+midgut.">Copper cells and stomach acid secretion in the Drosophila midgut.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (5), 745-752 (2004).</li><li>Martorell, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+mechanisms+of+tumorigenesis+in+the+Drosophila+adult+midgut.">Conserved mechanisms of tumorigenesis in the Drosophila adult midgut.</a> PLoS ONE. 9 (2), 88413 (2014).</li><li>Strand, M., Micchelli, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+control+of+Drosophila+gut+stem+cell+proliferation:+EGF+establishes+GSSC+proliferative+set+point+&amp;+controls+emergence+from+quiescence.">Regional control of Drosophila gut stem cell proliferation: EGF establishes GSSC proliferative set point &amp; controls emergence from quiescence.</a> PLoS One. 8 (11), 80608 (2013).</li><li>Storelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+perpetuates+nutritional+mutualism+by+promoting+the+fitness+of+its+intestinal+symbiont+Lactobacillus+plantarum.">Drosophila perpetuates nutritional mutualism by promoting the fitness of its intestinal symbiont Lactobacillus plantarum.</a> Cell Metabolism. 27 (2), 362-377 (2018).</li><li>Abu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communicating+the+nutritional+value+of+sugar+in+Drosophila.">Communicating the nutritional value of sugar in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (12), 2829-2838 (2018).</li><li>Blecker, U., Gold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastritis+and+ulcer+disease+in+childhood.">Gastritis and ulcer disease in childhood.</a> European Journal of Pediatrics. 158 (7), 541-546 (1999).</li></ol>

צעד קריטי בפרוטוקול זה הוא החיתוך הנכון של המעיים כדי לדמיין את CCR עבור פנוטיפ החמצה. החומצה המשתחררת מתאי הנחושת מוגבלת ל- CCR כאשר המעיים שלמים. עם זאת, במהלך ניתוח, דליפה הנגרמת על ידי קרע של המעי יכול להוביל דיפוזיה של חומצה מן CCR ולגרום המעי בטעות ציון שלילי עבור החמצה. בנוסף, הצבע הצהוב המ...

במעי החרקים, תאי נחושת חולקים קווי דמיון תאיים ותפקודיים עם תאי קודקוד הקיבה המייצרים חומצה (הידועים גם בשם אוקסינטי) של הקיבה היונקת. קבוצת תאים זו משחררת חומצה לתוך לומן המעי. הפונקציה של הפרשת חומצה ואנטומיה נשמרת אבולוציונית. המרכיבים העיקריים של החומצה המשוחררת הם חומצה הידרוכלורית ואשלגן כלוריד. המנגנון הכימי של היווצרות חומצה בתאים תלוי באנהידרז פחמתי. אנזים זה מייצר יון ביקרבונט מפחמן דו-חמצני ומים, אשר משחרר יון הידרוקסיל כי הוא משוחרר לאחר מכן לתוך הלומן באמצעות משאבת פרוטון בתמורה אשלגן. יוני כלוריד ואשלגן מועברים לתוך הלומן על ידי ערוצי מוליכות וכתוצאה מכך היווצרות של חומצה הידרוכלורית ואשלגן כלוריד, המרכיב העיקרי של מיץ קיבה1,2,3,4.
למרות המנגנונים של היווצרות חומצה מובנים היטב, הרבה פחות ידוע על מנגנונים פיזיולוגיים המסדירים הפרשת חומצה. המטרה של פיתוח שיטה זו היא לעזור לתאר טוב יותר את המסלולים התאיים המתאמים היווצרות חומצה והפרשת ולקבוע את תפקידה של חומצה בתיווך פיזיולוגיה מעיים והומאוסטזיס. הרציונל מאחורי ההתפתחות והשימוש בטכניקה זו הוא לספק שיטה עקבית ואמינה ללמוד את תהליך החמצת המעיים בדרוזופילה ואורגניזמים שאינם מודל. למרות פרוטוקול סטנדרטי לקביעת חמצת midgut Drosophila קיים כיום 2,5,6, שונות משמעותית נצפתה במידת החמצה זבובים מסוג בר (WT) בעת שימוש בפרוטוקול זה לחקר תפקוד תאי נחושת. כדי להבין את הבסיס לשונות נצפתה זו ולקבל תוצאות עקביות, מספר היבטים של הפרוטוקול הסטנדרטי היו ממוטבים כמתואר להלן.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>B0126</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. simulans</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. erecta</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. pseudoobscura</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. mojavensis</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Inox Biology</td>
			<td></td>
			<td>Catalog# 11252-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fuji</td>
			<td>Fuji</td>
			<td></td>
			<td>Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Catalog#16005-108</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim wipes Tissue</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope and camera</td>
			<td>Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon R</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock</td>
			<td></td>
			<td>(https://bdsc.indiana.edu/ # 2376)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Catalog #FB0875713A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td></td>
			<td>Catalog # SH30258.01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus SZ51</td>
			<td></td>
			<td>Visual magnification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring gut acidification in the adult drosophila intestine

מידגוט זבוב הפירות מורכב מאזורים מרובים, שכל אחד מהם מורכב מתאים המבצעים פונקציות פיזיולוגיות ייחודיות הנדרשות לתפקוד תקין של המעיים. אזור אחד כזה, אזור תא הנחושת (CCR), הוא מקומי לאמצע midgut והוא מורכב, בחלקו, של קבוצה של תאים המכונה תאי נחושת. תאי נחושת מעורבים בהפרשת חומצת קיבה, תהליך שנשמר אבולוציונית שתפקידם המדויק אינו מובן כהלכה. מאמר זה מתאר שיפורים בפרוטוקול הנוכחי המשמש לבדיקת החמצה של המעיים הבוגרים Drosophila melanogaster ומדגים כי ניתן להשתמש בו על מינים אחרים של זבובים. בפרט, מאמר זה מדגים כי החמצת המעיים תלויה במצב התזונתי של הזבוב ומציג פרוטוקול המבוסס על ממצא חדש זה. בסך הכל, פרוטוקול זה מדגים את התועלת הפוטנציאלית של לימוד תאי נחושת Drosophila לחשוף עקרונות כלליים שבבסיס המנגנונים של החמצת המעיים.

הרעבנו זבובים נקבות אורגון R במשך יותר מ 20 שעות ולאחר מכן האכלנו אותם מזון בתוספת BPB (2%) עבור ~ 12 שעות, כפי שתואר בעבר 7,8,9,10,10,11. ברומופנול כחול (באנגלית: Bromophenol Blue) הוא צבע חישת pH. הוא משתנה מצהוב ב-pH 3.0 לכחול...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine at JoVE.com

Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מתוקנן לניטור החמצת המעיים ב Drosophila melanogaster עם תפוקה אופטימלית. תחילה אנו משתמשים בפרוטוקול זה לניטור החמצת המעיים ב - Drosophila melanogaster ולאחר מכן מדגימים את השימוש בו במינים שאינם מודל Drosophila .

ניטור החמצת מעיים במעי דרוזופילה למבוגרים

The fruit fly midgut consists of multiple regions, each of which is composed of cells that carry out unique physiological functions required for the ...

זהו הפרוטוקול המהיר והנכון ביותר לניטור החמצת המעיים Drosophila עם תוצאות חזקות ואותנטיות. שיטה זו תסייע לקבוע את התפקיד של החמצת המעיים באורגניזמים מרובים. ותופעה זו היא הפשטות של טכניקה זו היא היתרון העיקרי.ככזה, זה יכול להיות מנוצל עבור אורגניזמים שאינם מודל. שיטה זו יכולה לפקח על שחרור החומצה עבור מערכות רבות כולל קווי התא ותלת-ממד בתרביות חיות. טכניקה זו היא פשוטה עם מאמץ מינימלי.מזון המכיל ברומופנול כחול צריך להיות מוכן טרי. בנוסף, בעוד המעי הגס לא צריך להיות מתוח. התחל לארגן את בדיקת ניטור החמצת המעיים עם הכנת מזון זבוב עם pH חישת ברומופנול כחול או צבע BPB.כדי לעשות זאת, להמיס את מזון זבובים במיקרוגל ולתת לו להתקרר עד פושר. מוסיפים מיליליטר אחד של 4% BPB למיליליטר אחד של מזון פושר עם באר ערבוב. בעזרת פיפטה, מוסיפים את מזון הזבובים המכיל BPB לנקודה אחת של כ-200 מיקרוליטרים במרכז צלחת פטרי.לאחר מכן, לאסוף אפס עד יומיים נקבה לא בתולה נקבה Drosophila melanogaster זבובים, ולאפשר לזבובים להתאושש על מזון ארוחת תירס סטנדרטי. לפני הניסוי, הרעיבו את הזבובים במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר בבקבוקון המכיל רקמת ניגוב מעבדה ספוגה בכשני מיליליטרים של מים שעברו דה-יוניטר. מעבירים זבובים מורעבים לצלחת פטרי המכילה נקודות בודדות של מזון הזבוב הטרי, בתוספת 2% BPB, כדי לאפשר לזבובים לחפש מזון במשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר בעודם חשופים לאור.לאחר ארבע שעות לאסוף את הזבובים, ולאחר מכן להמשיך לבודד בניתוח את המעיים של זבובים מרדימים ב 1X PBS עם מלקחיים תחת מיקרוסקופ סטריאו. ספור את מספר הזבובים המציגים BPB חזק עומד במעיים, וחשב את האחוז באמצעות המשוואה. לאחר הניתוח, הרם את הדגימות ב- PBS על שקופית זכוכית והנח את השקופית המוכנה מתחת למיקרוסקופ.לאחר מכן התאם את המוקד באמצעות IPS. לאחר שתסיים, כבה את שב"ס כדי לפתוח את התריס למצלמה. לאחר ניתוח המעיים, כמה זבובים נקבות Drosophila melanogaster נמצאו לייצר חומצה כפי שצוין על ידי הצבע הצהוב ב- CCR של המעיים.בעוד שהמעיים של כמה זבובים היו כחולים מה שמרמז על כישלון של הזבובים כדי להחמיר את המעיים שלהם. בתוך 30 דקות, כ -20% מהזבובים החמיצו את המעיים. לאחר שעה, 40% ממעי המעיים הראו החמצה, ואילו לאחר שעתיים עד שלוש שעות של האכלה, אחוז המעיים החומציים עלה ל -60 עד 70%כמעט 90 עד 95% מהעיים היו חומציים כאשר זבובים הוזנו במשך ארבע שעות.לא נצפתה הבדל בהחמצת המעיים בשני תנאי טמפרטורה שונים. היעילות של פרוטוקול החמצת המעיים הוערכה במינים שונים של דרוזופילה. כל המינים שנבדקו הראו החמצת מעיים חזקה, דבר המצביע על כך שניתן להחיל את הפרוטוקול על אורגניזמים אחרים.הדבר החשוב ביותר שיש לזכור, הוא למקם את הכוכב עף לתוך צלחת פטרי עם שמרים וכחול Bromophenol במשך ארבע שעות. טכניקה זו תעזור להבין את הביולוגיה הבסיסית ואת המסלול התאי המעורבים החמצת המעיים. זה גם צריך לעזור לזהות את היעד התרופה כדי ליצור את המחלות הקשורות החמצת המעיים.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine

Unit 1

Membrane Transport and Active Transporters

SCIENTISTS IN ACTION

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite Zootermopsis Angusticollis and Visualizing Gut Microbes

חילוץ ה-DNA של חיידקים במעיים של טרמיטים (Zootermopsis Angusticollis) באופן חזותי חיידקים גוט

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and ...

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

תא הקלטות שלמות של המוח של מבוגרים תסיסנית

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

וידאו ברזולוציה גבוהה של מעקב אחר תנועה של מבוגרים תסיסנית melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

ניטור הלב לתפקד הזחל תסיסנית melanogaster ללימודים פיזיולוגיים

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Dissection של Oenocytes מן למבוגרים תסיסנית melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

הזרקת אינסולין ו Extraction Hemolymph כדי למדוד את הרגישות לאינסולין אצל מבוגרים תסיסנית melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

לטווח ארוך רעילות מבחן קטלני עם לסרטן הארטמיה franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

העגבניות / GFP-FLP / FRT שיטת ההדמיה חיה של פסיפס למבוגרים בלבד<em&gt; דרוזופילה</em&gt; תאי קולטי אור

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging דג הזברה למבוגר

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...